성인의 준비 Drosophila 눈

Summary

어른을 준비하는 표준 방식

Abstract

Drosophila는 오래 유전자 다루기 쉬운되는과 용이 주로 인해, 개발 연구를 모델 시스템으로 사용되고 있습니다. 수년에 걸쳐, 돌연변이 종자 및 기술 트릭의 과다는 복잡한 질문 및 시간의 합리적인 금액에 답변 수 있도록 개발되었습니다. 모든 알려진 주요 신호 경로의 구성 요소의 상호 작용에 근본적인 통찰력은 앞으로의 취득 및 유전자 Drosophila 연구를 반대하고 있습니다. 실험실 조건 하에서, 파리 기능성 눈없이 살아남을 수, 이후 플라이 눈, 유난히 잘 mutational 분석을 위해 적합한 것으로 입증되었습니다. 또한, 곤충 눈의 표면은 해부 현미경으로 바라 보았다 때 정기적으로 부드러운 표면을 형성 약 800 개별 단위 눈 (측면 또는 ommatidia)로 구성되어 있습니다. 각각 또는 전체 눈 크기 (에 따라 화면의 예를 보려면, 그러므로, 그것은 돌연변이가 외부에 매끄러운 표면의 손실 (그림 1. '거친 눈'표현형)을보고 안구 개발이나 성장에 영향을 미칠 수 있는지 쉽게 외부 눈 형태) 예 ^1을 참조하십시오. 눈 phenotypes 이후에 세부적인 분석은 고정, 플라스틱 퍼가기 성인 눈이 얇은 sectioning을 필요로합니다.

Drosophila 아이는 소위 눈 imaginal 디스크 (검토 예 ² 참조) 애벌레와 pupal 단계 동안 세포 분열 따위에 의해 번식하고 차별 상피 세포의 가방에서 개발하고 있습니다. 넷 렌즈 - secreting 콘 세포, 색소 세포 (R - 세포 클러스터 주변에 '육각')와 브리슬, 각 ommatidium 여덟 photoreceptors (. 그림 2 PR 또는 R - 세포) 등 20 세포로 이루어져 있습니다. R8 [그림;, 가장 쉽게 가벼운 민감한 organelles, rhabdomeres, (R1 - 6) 6 "객관적인"두 "주관적인"photoreceptors (R7 / 8 이루어진 사다리꼴로 구성됩니다 각 ommatidium의 photoreceptors 확인 2.]) R7 아래이며 따라서에만 눈이 깊은 지역에서 섹션에 보았다. 각 패싯의 사다리꼴은 정확하게는 이웃과 눈 (그림 3A)의 전반적인 anteroposterior 및 dorsoventral 축의 기능과 정렬됩니다. 특히, 지느러미 및 복부 (각각 검은색과 빨간색 화살표)의 ommatidia은 눈의 반쪽은 서로의 미러 이미지이며 평면 세포 극성 신호 (검토 예 ³ 참조) 중 설립이 chiral 형식과 일치합니다.

세미 얇은 눈 섹션을 생성하는 방법 (예 : 그림 3.로 표시 것과)은 약간 원래 톰린슨 ⁴ 준비하여 설명하는 하나에서 수정됩니다 여기에 설명되어 있습니다. 그것은 투명한 원추 세포를 제외한 모든 세포의 형태학의 분석을 수 있습니다. 또한, R - 세포 (그림 파란색 화살촉. 2와 3)의 안료는 R - 세포의 유전자형에 대한 셀 - 자율 마커, R - 세포 수의 하위 집합에있는 유전자의 따라서 유전자 요건으로 사용할 수 있습니다 쉽게 ^5,6를 결정합니다.

Protocol

1. 머리를 절개를 플라이

1. 당신은 (젤라틴 코팅 슬라이드 포함) 핸드에있는 모든 자료를 가지고 있는지 확인하십시오. 글루 타 알데히드와 오스뮴의 fixatives (아래 참조) 준비합니다. 얼음 1.5 ML 튜브에서 나누어지는 200μl 글루 타 알데히드 해결책을 포함하는 유전자형 당.
2. CO ₂ 패드 (우리는 보통 머리가 절차를 수행하는 동안 파괴하는 경우에 유전자형 최대 6를 포함 일곱 플라이 머리를 해부하다)에 파리를 마취.
3. 잡고 약간 핀셋과 함께, 최대 비행, 등의 측면의 흉부를 눌러 머리를 잘라하는 날카로운 메스를 사용합니다.
4. 핀셋으로 목을 만져 파리 머리를 고정하고 조심스럽게 눈 하나의 작은 부분을 슬라이스. 이것은 정착액의 침투를 (여러분이 clonal 분석을 위해 눈 섹션을 사용하려는 경우에는 이하 클론로 눈을 컷) 높여줍니다. 감동 나중에 sectioned 될 그대로 눈에 손상을 피한다.
5. 눈에서 절단 표면에 핀셋이나 메스로 머리를 만지 (정착액 위에 떠 자주 머리) 얼음 글루 타 알데히드 / 인산염 정착액에 머리를 전송 해부 머리가 이상에 대한 글루 타 알데히드 수정에 보관하지 말아야 오스뮴의 추가하기 전에 십오분 이상. 동일한 유전자형의 다른 파리와 같이 1.2-1.5를 반복합니다.

2. 고정 및 삽입 (모든 단계 장갑을 사용!)

1. 10,000 RPM에서 1 분 Eppendorf의 원심 분리기에서 flyheads를 스핀. 머리 싱크대하지 않은 경우에도 계속합니다.
2. 오소 _네 솔루션의 200μl를 추가하고 적어도 30 분 얼음에 1 시간 동안 수정.
3. 파스퇴르 피펫을 사용하여 글루 타 알데히드 / 오스뮴 솔루션 (적절한 폐기물 처리 절차를 사용해야합니다!) 제거하고 200μl 오스뮴 솔루션으로 대체합니다. 1-6 시간을위한 얼음에 품어. 항상 머리가 완전히 액체 덮여되도록하고 머리 또는 눈을 붕괴 수로 솔루션을 모두 제거 절대!
4. 파스퇴르 피펫을 사용하여, 정착액 폐기 (에탄올 지금 오스뮴가 포함되어 있으므로 적절한 폐기물 처리 절차를 사용해야합니다!) 얼음에 적어도 5 분 동안 0.5 - 1ml 30 % 에탄올과 부화를 추가합니다.
5. 50 %, 70 %, (80 %), 90 % 및 두 번 100 % 에탄올로 위의 단계를 반복합니다. 전자 현미경 분석을 위해 눈을 사용하는 경우 80 % 에탄올 단계를 포함합니다. 70 % 세척 단계 후, 샘플은 얼음에서 제거할 수 있습니다.
6. 프로필렌 산화물 (휘발성, 후드에서 계속 작동)의 동일한 볼륨으로 에탄올을 대체합니다. 실온에서 10 분 알을 품다.
7. 프로필렌 산화물 세척을 반복합니다. 프로필렌 산화물의 증발로 인해 눈이 중첩 피하기 위해 병렬로 여러 genotypes를 처리하는 경우 일괄 처리 작업.
8. , 프로필렌 산화물의 대부분 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 제거를 1:1 수지 500μl에 대한 추가 프로필렌 산화물 솔루션입니다. 실온에서 하룻밤 평형.

3. 금형에 삽입하고 배치

1. 모든 금형가 다른 genotypes를 추적하기 위해 표시되었는지 확인 후, 100 % 수지와 금형을 입력합니다. 너무 많이 넣다가 (금형의 표면 위에 아니오 '하이 힐스'똑바로 금형 표면에 걸쳐보고)하지 마십시오. EM 분석을위한 하드 수지를 사용하십시오.
2. 전송 피펫을 사용하면, 머리에서 50 %의 수지를 제거 100 % 수지로 대체하고, 실온에서 3-4시간을위한 부화. 머리가 수지로 가득 차 있으므로, 그들은 튜브의 바닥에 싱크 것입니다.
3. 작은 갈고리를 만들 수 번 하드 표면에 공격을 받았습니다 이쑤시개를 사용하여 주형으로 한 번에 하나의 머리를 전송합니다.
4. 수지 유출 대조를 보호하기 위해 귀하의 해부 범위의 작업 영역을 플레이스 알루미늄 호일.
5. 해부 바늘을 사용하여 수지의 머리 약간 범위, 소용돌이 불구하고보고 신중하게 가까운 지적 끝에 금형의 하단으로 이동합니다.
6. 조심스럽게 눈 접선 표면이 약 절반 머리 계속해야하고, 금형의 전면 벽에있는 그대로 (!) 눈 (또는 교차 섹션을 원한다면 당신의 미래 sectioning 비행기) 목의 표면을 아래로 정렬 멀리 금형 벽에서 직경. 드문 경우에, 눈 표면과 머리 표피 사이의 빈 공간으로 볼 수있는 눈 붕괴. 당신이 붕괴 눈이있다면, 7 ^일 여분의 눈으로 그것을 대체합니다.
7. 모든 머리로 반복합니다. 일단 모든 정렬을 끝내고, 당신이 수지의 바늘을 제거하면 그들의 행동하지 않는지 확인하려고 모든 눈을 다시 확인합니다.
8. 당신이 해부 바늘을 제거할 때 눈에 이동에 문제가있을 경우, 원하는대로 눈을 위치를 신속하게 약간 떨어져 머리에서 바늘을 접어야 다음 천천히 완전히 바늘을 제거합니다.
9. 70 밤새 금형을 구워 ° C.

4. 트리밍과 sectioning

1. K, 금형을 절곡하여 금형에서 강화된 블록을 제거합니다블록에 해당하는 eeping 추적하는 유전자형 (작은 섬광 튜브 안에 저장 예).
2. 트리밍 들어, 플렉시 또는 알루미늄 블록에 얼굴을 탑재하여 마이크로톰에 맞는 척을 사용합니다. 척에서 트리밍하는 블록 최대 눈을 탑재합니다.
3. 테플론 코팅 면도기를 사용하여 절개 범위가 베이드에서 신중하게 차단만을 상위 레이어를 잘라. 이것은 '눈'을 볼 수 있으므로 sectioning의 미래 비행기를 예측할 수있는지만 깨끗한 표면을 떠날 것입니다. 손가락을 절단하지 마십시오!
4. 머리 주위의 플라스틱의 대부분은 잘라 때까지 (눈을 정렬 때 금형의 상단이었던 예) 머리의 양쪽과 전면에 여분의 플라스틱을 잘라. 천천히 플라스틱의 여러 얇은 레이어를 잘라하여 머리를 접근하는 것이 좋습니다.
5. 깨끗한 면도날을 사용하여 신중하게 나중에 섹션 (보통 tangentially 눈에, 원래 금형 표면에 약간의 각도)하고자하는 정확한 비행기의 눈 위로부터 얇은 레이어를 제거합니다.
6. 방금 눈 바깥 표면을 떼어 버리기 시작 전까지 계속합니다. 당신이 마이크로톰 쉽게에 정렬하게 빛나는 투명한 표면을 얻기 위해 블레이드의 깨끗한 영역을 사용했는지 확인하십시오.
7. 면도날에 저장하려면 블록의 양쪽 주변 트리밍 원유에 대한 기존의 블레이드를 사용하여 고급 (첫 번째 절단 및 4.6) 트리밍을위한 새로운 블레이드를 사용합니다. 결국 당신은 미래의 섹션 비행기에 해당하는 약간 기울어져, 컷 - 오프 최고로 세 일방적인 피라미드됩니다.
8. 마이크로톰에서 블록을 탑재합니다. 실제 sectioning는 마이크로톰의 유형에 따라 다를 수 있으며 여기에 자세히 설명되지 않습니다. 우리는 0.5 1μm 섹션을 절단하기 위해 조직을 품질 다이아몬드 나이프로 Sorvall MT5000을 사용합니다. 가벼운 현미경 분석을 위해, 섹션 두께에 약간의 차이가 중요하지 않습니다. sectioning 클론은 화이트 + transgene 섹션으로 표시된 경우에는 1μm 섹션은 섹션 당 rhabdomeres (그림 2)에 인접한만큼 안료 과립을 가지고 있도록합니다.
9. 섹션 물 위에 떠 있습니다. 회전 운동에서 수면 아래에서 목조 Q - 팁의 평평 엔드와 첫번째 20-30 섹션을 허용하고 젤라틴 코팅 유리 슬라이드 (약 100 ° C에서 가열 접시에 보관에 물 한 방울로 그들을 전송 ).
10. 또 20-30 섹션과 반복합니다. 물이 증발하고 섹션을 슬라이드에 집중 때까지 기다리십시오. 보통 3 눈 부분 한 슬라이드에 잘 맞지 타운쉽 행에 의해 3 개 항목 (세명 눈) (상단 / 하단 부분)에 배치.

5. 얼룩과 미세 분석

1. 않는 sectioning 클론, 얼룩 섹션. 90에서 설정 난방 블록에 대한 섹션 플레이스 슬라이드 ° C. 슬라이드에 0.22μm 필터에 부착된 30 ML의 주사기에서 Toluidine - 푸른 얼룩 솔루션을 분배하고 10 초 동안 얼룩. 즉시 증류수를 폭 린스. 공기가 건조.
2. 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 슬라이드에 미디어를 장착 DPX 3 방울을 배포하고 coverslip로 커버. 3 천과 위로와 장착 매체 강화를 (룸 온도 예 : 하루)하자.
3. 가벼운 현미경 이미지. 좋은 섹션을 찾은 후 상세한 분석과 사진 촬영을위한 63x 기름 침지 렌즈로 전환하는 5 배 또는 10 배 렌즈를 사용합니다. 우리는 일반적으로 위상 대비 설정을 사용하지만, darkfield 광학은 잘 작동합니다.

6. 대표 결과 :

가장 자주, 눈이 유전 화면의 일부로 또는 일반 눈 구조 또는 극성 중 하나에 영향을 미칠 것으로 알려진 유전자와 유전자 상호 작용을 테스트 과정에서 발견 외부 거친 아이 phenotypes에 대한 자세한 분석을 위해 플라스틱에 포함됩니다. 안과 섹션의 전형적인 결과는 그림 3에 표시됩니다. 야생 형 ommatidia (그림 3A)는 안료 세포의 격자에 둘러싸인 전체 photoreceptor의 보완을 보여줍니다. 반대로, 사시 (stbm, 일명 반 - 고흐 ⁷⁾ 돌연변이에 ommatidial 극성이 전체 photoreceptor의 보완이 존재하더라도, 분실 있으며, 회전과 chirality가 무작위 (그림 3B)입니다. 또한, sectioned stbm allele이 아에 이후 ^- 배경, 안료 과립은 그림 누락되었습니다. 3B. 그림 3C는 clonal 분석의 예제를 보여줍니다. Drosophila Rho 키나 아제 (drok)가 ommatidial 회전뿐만 아니라 눈 ⁸ 구조적 무결성을 위해 필요합니다. 야생에서 돌연변이 ^- Homozygous ^drok이 클론은 안료 세포와 rhabdomeres (일반적으로 안료의 부재에 의해 확인할 수 있습니다, 클론은 눈이없는 - FLP와 배경 w를 보완 강하게 표현 흰색 마커 유전자와 P - 요소를 사용 유도 아르 - 유형 및 heterozygous 조직). 그것은 안료 그들의 부족에 의해 돌연변이 영역을 식별할 수 있으므로이 가능합니다. R - CE의 착색의 휴대 자치으로 인해힘들 일찍, 개별 R - 세포의 genotypes합니다 (그림. 3C에서 화살촉 참조) 확인할 수 언급했다.

그림 1. Drosophila의 눈으로부터 생물학을위한 훌륭한 모델 시스템입니다, 야생 타입 눈 (A)의 매끄러운 표면에 대조적으로, 돌연변이 눈 표면은 외부 자주, (B) 거친 기본 안구 phenotypes을 나타내는 것입니다 . 모든 수치에서 앞의은 왼쪽이고 지느러미가있다. 박사 제니퍼 컬티스, NMSU, 라스 크루 시스, NM, 미국의 이미지 커터.

그림 2. 설명한 방법을 사용 sectioned 단일 ommatidia의 빛 현미경 이미지. 맥도널드 R - 세포가 R8 위에 R7 자리잡고 있기 때문에, ommatidium마다 한 번에 볼 수 있습니다. (A는 A ') (R7 수준에서 R7의 세포 시체는 R1 및 R6에 노란색 화살표) 사이의 감지. 반면, R8 수준 (B)에서, R8의 세포 시체는 R1 및 R2 (B에 노란색 화살표 ') 사이에 감지됩니다. 블루 화살촉은 셀 자율 안료 마커로 사용할 수있는 안료 과립을 표시합니다.

그림 3. 야생 - 타입 (A), stbm (B)와 drok (C) 돌연변이 성인 Drosophila의 눈을 통해 접선 섹션. 섹션 아래의 설계도는 ommatidia의 극성 (화살표위한 (A) 참조) 나타냅니다. 동그라미 photoreceptor의 보완에 결함이 ommatidia을 나타냅니다. 노란색 라인은 대칭의 지느러미 / 복부 라인 (적도)를 나타냅니다. (A) 야생 타입의 잘 지향 ommatidia 대조적으로, 평면 조직은 stbm 돌연변이 (B)에서 손실됩니다. 돌연변이 배경 ^- stbm 돌연변이의 섹션 표시 참고는 w에 의한 색소 부족합니다. drok의 변이가 있기 때문에 치명적인 (C), 그들은 클론으로 분석해야합니다. R - 세포 부족 색소 (오픈 파란색 화살촉)는 ​​homozygous 돌연변이있는 동안 따라서, 색소 세포는 (가득 푸른 화살촉) 야생 입력하거나 heterozygous 있습니다. 회전 결함 이외에 drok의 돌연변이도 R - 세포 없거나 초과 번호 포함 구조적 결함을 보여줍니다. clonal 분석, 섹션은 안료 과립을 왜곡하지 않도록 스테인드되지 않습니다.

Discussion

모델 생물, 인간을 포함한 높은 eukaryotes에서 가장 높은 보존 신호 통로의 대부분에 필수적인 유전자 가족의 창립 멤버 많은 이들의 신분에 LED 유전자 화면으로 Drosophila을 사용합니다. , 실험실 조건 하에서 기능 눈이 생존을위한 소모품이기 때문에, 그 '눈'은 새로운 유전자 기능의 발견과 유전자 네트워크의 평가에 특히 적합 조직입니다. 설명한 방법을 사용하여 비행 아이의 Ultrastructural 분석함으로써 개발 및 질병에 해당하는 기본적인 발견되었다. 처음에는, 단일 세포 clonal 분석 알려져 밀접하게 연관된 세포 자치 열성 마커와 결합하여 X - 선 유도 클론을 사용하여 수행되었습니다. 최근 클론을 생성하는 FLP / FRT 시스템의 가용성이 크게 눈에 섹션 ^6,9에 치명적인 돌연변이의 phenotypic 분석을 촉진하고 있습니다.

안과 섹션의 분석은 여기에 설명된 접선 섹션에 국한되지 않습니다. 원하는 경우, 헤드는 금형의 모든 방향으로 정렬된 수 있으며, 가로 섹션은 얇은 판과 모수 같은 머리에 깊이 레이어를 연구받을 수 있습니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 따라서 눈과 머리 구조 Drosophila 성인의 분석을위한 다양한 방법입니다.

Materials

General equipment: For general fly husbandry see 10 Standard dissection microscope (e.g. Nikon SMZ-645 Stereo Zoom Microscope), preferably with a ring light source to prevent casting a shadow of your hands. CO2 Fly pad, covered with 3MM Whatman paper to provide protection against dirt during dissection. Gelatin coated slides: dissolve 10g gelatin and 1g CrKSO4x 12 H2O in 1L water on a heating plate (bring almost to a boil, takes approximately 2 hrs). Dip well washed (soap) and rinsed (dH2O) slides in holders into gelatin solution and air-dry covered with foil overnight. Heating oven (70°C; old vacuum ovens that were used for nitrocellulose filter drying are well suited for this purpose). Microtome capable of ultrathin sectioning (0.5-1 μm thick sections), e.g. those used by electron microscopy facilities. We use a Sorvall MT5000 Ultramicrotome with a Histo quality diamond knife. Glass knives also work. Fixation solutions: Prepare a stock solution of 0.2 M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Prepare 2% glutaraldehyde in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2 (can be stored at 4°C for 4 weeks). Make at least enough to have 200μl per genotype you want to embed. Keep on ice. Osmium solution: 2% OsO4 in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Make only enough to have 200μl per genotype you want to embed, since the solution cannot be stored. Keep on ice. Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette. Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use. Staining solution: 1% Toluidine-blue in 1% Borax. Soft Hard Resin A 54g 50g Hardener B 44.5g 50g Accelerator C 2.5g 1.75g Plasticizer D 10g 0.75g Table 1. Resin preparation To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol. Reagent Supplier Catalog number Fly pad e.g. Genesee 59-119 Glutaraldehyde Sigma G7526-10 X 10 ML OsO4 Polysciences,Inc. 0972A-20 Propyleneoxide Fisher 04332-1 Scalpel handles, for #3 Fisher 22080046 Scalpel blades #11 Fisher 08-916-5B Transfer pipettes Fisher 13-711-7M Durcupan (R) ACM resin Sigma (Fluka) 44610-1EA Steel dissecting needle Fisher S17346 BEEM flat embedding mold Electron Microscopy Sci. 70904-12 Teflon coated razor blades Electron Microscopy Sci. 71970 Q-tip (sterile swabs) Fisher 14-959-81 Glass slides Fisher 12-550-143 Cover slips No 1, 22X60 mm Fisher 12-531K Gelatin Fisher ICN96010280 Cr(III) K SO4 dodecahydrate Sigma 243361 Diamond Histo knife, 6mm Diatome US 60-His Toluidine Blue O Fisher BP107-10 Borax (Na-Tetraborate) Fisher AC20629-1000 DPX mounting medium Sigma 44581-100ML Table 2. Materials