הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

Summary

הגישה הסטנדרטית כדי להכין את הבוגרים

Abstract

תסיסנית כבר זמן רב המשמש כמערכת מודל מחקר ופיתוח, בעיקר בשל הקלות שבה הוא ממושמע מבחינה גנטית. במהלך השנים, שפע של זנים מוטנטים וטריקים טכני פותחו כדי לאפשר שאלות מתוחכמות להישאל וענה בסכום זמן סביר. התובנה הבסיסית לתוך הגומלין של המרכיבים של כל המסלולים העיקריים ידוע איתות התקבל ב קדימה הפוכה מחקרים גנטיים תסיסנית. העין לטוס הוכיחה להיות מתאים במיוחד גם עבור ניתוח מוטציוני, שכן, בתנאי מעבדה, זבובים יכולים לשרוד בלי עיניים תפקודית. יתר על כן, פני השטח של העין חרק מורכב כ -800 עיניים יחידת הפרט (היבטים או האומטידיה) היוצרים משטח רגיל, כאשר חלקה הסתכל תחת מיקרוסקופ לנתח. לכן, קל לראות אם מוטציה עשויה להשפיע על התפתחות העין או על ידי צמיחה חיצונית מחפש אובדן השטח החלקים (פנוטיפ "עין גס"; איור 1.) או גודל העין הכללית, בהתאמה (עבור דוגמאות של המסכים המבוססים על מורפולוגיה עין חיצונית לראות למשל ^1). לאחר ניתוחים מפורטים של פנוטיפים עין דורשים, קיבעון הטבעה פלסטיק דק חתך של העיניים הבוגרת.

העין תסיסנית מפתחת מדיסק שנקרא עין דמותי, שקית לתאי האפיתל כי להתרבות להבדיל בשלבי הזחל ו גלמי (לסקירה ראה ² למשל). כל אומטידיום מורכב 20 תאים, כולל שמונה photoreceptors (PR או R-תאים;. איור 2), ארבע עדשות מפריש תאים חרוט, תאים פיגמנט ("משושה" סביב מקבץ תאים R) וכן זיפים. Photoreceptors של אומטידיום כל, הכי מזוהה בקלות על ידי אברונים רגישים לאור שלהם, rhabdomeres, מאורגנים טרפז מורכב ששת "החיצוני" (R1-6) ושני "פנימי" photoreceptors (R7 / 8; R8 [איור . 2] מתחת R7 ולכן ראיתי רק בחלקים מאזורים עמוקים יותר של העין). טרפז של פן כל מיושרים במדויק עם אלה של שכנותיה הצירים anteroposterior ו dorsoventral הכוללת של העין (איור 3A). בפרט, האומטידיה של (חיצים שחורים ואדומים, בהתאמה) הגבי ו הגחון חצאים של העין הם תמונות ראי של אחד את השני מתאימות שתי צורות כיראלי הוקמה במהלך איתות הקוטביות מישוריים תא (לסקירה ראו למשל ^3).

השיטה לייצר חצי דקה סעיפים העין (כמו אלה שהוצגו באיור. 3) המתואר כאן הוא שונה במקצת מזו המתוארת במקור על ידי טומלינסון ו Ready ^4. זה מאפשר ניתוח מורפולוגי של כל התאים פרט לתאי חרוט שקוף. בנוסף, פיגמנט של R-תאים (ראשי חץ כחול באיור. 2 ו -3) יכול לשמש כסמן התא אוטונומי עבור גנוטיפ של תא-R, דרישות הגנטי ובכך הגנים משנה של R-תאים יכולים בנקל ייקבע ^5,6.

Protocol

1. טוס לנתיחה ראש

1. ודא שיש לך את כל החומרים בהישג יד (כולל שקופיות מצופה ג'לטין). הכן glutaraldehyde ו fixatives אוסמיום (ראה להלן). לפי גנוטיפ להטביע, glutaraldehyde 200μl aliquot פתרון לתקן את הצינורות בתוך 1.5 מ"ל על הקרח.
2. הרדימי זבובים על כרית CO ₂ (אנחנו בדרך כלל לנתח שבעה ראשים עפים להטביע שישה אחוזים גנוטיפ במקרה ראש אחד נהרס במהלך ההליך).
3. החזק מעט בעיתונות החזה של הצד לעוף, הגב, עם פינצטה ולהשתמש אזמל חד לחתוך את הראש.
4. לייצב את הראש לטוס ידי נגיעה בצוואר עם פינצטה ובזהירות לחתוך חלק קטן של עין אחת. זו משפרת חדירה של מקבע (אם אתם מתכוונים להשתמש במקטעים העין לניתוח המשובטים, לחתוך את העין עם שיבוטים או לא קטן). הימנע מנגיעה ומזיק העין שלמים אשר מאוחר יותר להיות מחולק.
5. מגע ראש עם פינצטה או אזמל על פני השטח של החתך מעל העין ולהעביר את הראש לתוך מקבע glutaraldehyde / פוספט על הקרח (ראשי קרובות לצוף על גבי מקבע) ראשי גזור לא צריך להיות כל הזמן לתקן glutaraldehyde למשך זמן ארוך יותר יותר מאשר 15 דקות לפני תוספת של אוסמיום. חזור על שלבים 1.2-1.5 עם זבובים אחרים של גנוטיפ זהה.

2. קיבוע והטבעה (להשתמש בכפפות במשך כל השלבים!)

1. ספין flyheads בצנטריפוגה Eppendorf דקה 1 בסל"ד 10,000. המשך גם אם הראש לא לשקוע.
2. הוסף 200μl של פתרון ₄ OSO ולתקן במשך לפחות 30 דקות עד 1 שעה על הקרח.
3. בעזרת פיפטה פסטר, להסיר את הפתרון glutaraldehyde / אוסמיום (לוודא שימוש נכון לרשות נהלים בזבוז!) ולהחליפו פתרון אוסמיום 200μl. לדגור על הקרח במשך 1-6 שעות. תמיד להבטיח את ראשיהם מכוסים לגמרי בנוזל ולא להסיר את כל הפתרון כמו ראשי או העיניים עלול להתמוטט!
4. בעזרת פיפטה פסטר, להשליך מקבע, להוסיף אתנול 0.5-1ml 30% ו דגירה במשך לפחות 5 דקות על קרח (כדי לוודא שימוש נכון סילוק פסולת הליכים מאז אתנול מכיל כעת אוסמיום!).
5. חזור על השלב עם מעל 50%, 70%, (80%), 90% ו 100% אתנול פעמיים. כלול את הצעד אתנול 80% אם באמצעות העיניים לניתוח מיקרוסקופית אלקטרונים. לאחר השלב לשטוף 70%, הדגימות ניתן להסיר את הקרח.
6. החלף את אתנול עם נפח שווה של פרופילן אוקסיד (נדיפים, להמשיך לעבוד למכסה המנוע). דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
7. חזור על לשטוף פרופילן אוקסיד. עבודה בקבוצות אם עיבוד גנוטיפים רבים במקביל, כדי למנוע התמוטטות של העיניים עקב התאדות של פרופילן אוקסיד.
8. הסר ביותר של פרופילן אוקסיד באמצעות פיפטה העברת פלסטיק, להוסיף על 500μl של 01:01 שרף: פתרון פרופילן אוקסיד. לאזן בין לילה בטמפרטורת החדר.

3. הטבעת ואת הסדר בתוך תבניות

1. ודא שכל תבניות מסומנים כדי לעקוב אחר גנוטיפים שונים שלך, ולאחר מכן למלא את תבניות עם שרף 100%. אל תמלא יותר מדי (לא 'ההרים הגבוהים' על פני השטח של תבניות כאשר מסתכל ישר על פני התבנית). השתמש שרף קשה לניתוח EM.
2. בעזרת פיפטה להעביר, להסיר את שרף 50% מן הראשים, להחליף עם שרף 100%, דגירה של 3-4 שעות בטמפרטורת החדר. כראשי הם הסתננו עם שרף, הם ישקעו לתחתית הצינור.
3. בעזרת קיסם כי נפגעה על משטח קשה פעם אחת כדי ליצור וו קטן, להעביר ראש אחד בזמן לתוך תבנית.
4. רדיד אלומיניום במקום על שטח העבודה של היקף הניתוחים שלך ולהגן עליו מפני דליפות שרף.
5. בעזרת איזמל המנתחים ונראה כאילו מערבולת שלך, היקף הראש מעט שרף בזהירות להזיז אותו לתחתית התבנית קרוב לסוף הצביע.
6. בזהירות ליישר את פני השטח של העין (!) הצוואר שלם (או מטוס העתיד שלך חתך אם אתה רוצה להיות חתכים) למטה עם הקיר הקדמי של עובש, והקפד לשמור את פני השטח של העין משיק בערך חצי ראש קוטר מהקיר עובש. במקרים נדירים, מתמוטט העין אשר ניתן לראות חלל ריק בין פני השטח את העין ואת הראש לציפורן. אם יש לך עין התמוטט, להחליף אותו עם העין חילוף 7 ^ה.
7. חזור עם ראשי כל. פעם עשיתי עם מערכים כל, לבדוק מחדש את כל העיניים כדי לוודא שהם לא זז כאשר אתה מוסר את המחט של שרף.
8. אם יש לך בעיה עם העיניים לנוע כאשר אתה מסיר את איזמל המנתחים, מקם את העין לפי הצורך, לחזור בו במהירות את המחט מעט מן הראש ואז לאט לאט להוציא את המחט לגמרי.
9. אופים את תבניות לילה בשעה 70 ° C.

4. זמירה ו חתך

1. הסר חוסמת מוקשה מתבניות על ידי כיפוף תבניות, kמסלול eeping מהם לחסום מתאים אשר גנוטיפ (למשל חנות צלוחיות קטנות הנצנץ).
2. עבור זמירה, השתמש צ'אק מתאים microtome שלך ​​כי הוא רכוב על הפנים גוש של פלסטיק או אלומיניום. הר אבן לקצץ, עין למעלה, צ'אק.
3. על פי היקף לנתיחה באמצעות סכין גילוח מצופה טפלון בירך, בזהירות לחתוך רק את השכבה העליונה של הבלוק שלך. זה ישאיר משטח אשר ברור כי אתה צריך לראות את העין ולכן יכול לחזות את מטוס העתיד של חתך. הימנע חיתוך האצבעות!
4. חותכים את עודפי פלסטיק משני צידי הראש בחזית (כלומר, מה היה אמור להיות החלק העליון של התבנית כאשר ליישר את העיניים) עד שרוב הפלסטיק סביב ראשו נכרת. עדיף להתקרב לאט לאט הראש על ידי חיתוך שכבות דקות רבות של פלסטיק.
5. באמצעות סכין גילוח נקי, להסיר בזהירות שכבות דקיקות מהחלק העליון של העין במישור המדויק שאתה רוצה בהמשך (בדרך כלל בנקודת השקה העין, בזווית קלה אל פני השטח את התבנית המקורית).
6. המשך עד שאתה פשוט להתחיל לחתוך את המשטח החיצוני של העין. הקפד להשתמש באזורים נקי של הלהב כדי לקבל משטח מבריק, שקוף, מה שהופך את היישור קל יותר microtome.
7. כדי לשמור על סכיני גילוח, סכיני להשתמש יותר עבור גס זמירה סביב הצדדים של הבלוק ולהשתמש להב טרי עבור זמירה קנס (חתך ראשון 4.6). בסופו של דבר יהיה לך פירמידה צדדית שלושה עם צמרת מוטה מעט חתוכים, שמתאים מטוס סעיף העתיד שלך.
8. הר לחסום microtome. חתך בפועל ישתנו בהתאם לסוג של microtome ולא יהיה מתואר בפירוט כאן. אנו משתמשים Sorvall MT5000 עם סכין יהלום באיכות histo לקצץ 0.5 ל 1μm חלקים. ניתוח מיקרוסקופי אור, שינויים קלים עובי סעיף לא משנה. אם שיבוטים חתך מסומן על ידי חלק לבן + transgene, 1μm סעיפים כדי להבטיח שיהיה מספיק גרגרי פיגמנט סמוך rhabdomeres לכל סעיף (איור 2).
9. מדורים יצוף על פני המים. הרם first סעיפים 20-30 עם סיום שטוח של קצה-Q עץ מתחת פני המים בתנועה וסיבוב ולהעביר אותם לתוך טיפת מים בשקופית זכוכית מצופה ג'לטין (שמר על צלחת חימום בסביבות 100 ° C ).
10. חזור עם עוד 20-30 חלקים. חכו עד שהמים התאדו וחתכים מקל לשקופית. בדרך כלל, קטעים של 3 עיניים מסודרות בשלושה טורים (שלוש עיניים) על ידי שורות twp (למעלה / למטה חלקים) משתלבים היטב בשקופית אחת.

5. מכתים ניתוח מיקרוסקופי

1. אלא אם כן שיבוטים חתך, קטעי הכתם. המקום שקופיות עם קטעים על בלוק חימום נקבע על 90 ° C. לוותר Toluidine כחול פתרון מכתים מתוך מזרק 30 מ"ל מצורף מסנן 0.22μm לשקופית ואת הכתם למשך 10 שניות. מיד לשטוף נרחב עם מים מזוקקים. האוויר יבש.
2. בעזרת פיפטה העברת פלסטיק, להפיץ 3 טיפות DPX הרכבה בינונית לשקופית ומכסים coverslip. למעלה עם 3 מטבעות ולתת בינוני להקשיח הרכבה (לילה למשל בטמפרטורת חדר).
3. תמונה עם מיקרוסקופ אור. השתמש בעדשה או 5x 10x למצוא קטע טוב ולאחר מכן לעבור עדשה שמן 63x טבילה עבור ניתוח מפורט וצילום. אנחנו בדרך כלל להשתמש בהגדרות בניגוד שלב, אבל darkfield אופטיקה לעבוד גם כן.

6. נציג התוצאות:

רוב לעיתים קרובות, עיניים המוטבעים פלסטיק ניתוח מפורט של חיצוני פנוטיפים עין גס זוהה כחלק מסך גנטי או בתהליך של בדיקה גנטית אינטראקציות עם גנים ידוע להשפיע גם מבנה העין הקוטביות כללית או. תוצאות אופייניות של חלקים עין מוצגים באיור 3. Wild-type האומטידיה (איור 3A) להראות משלימים photoreceptor מלא מוקף סריג של תאים פיגמנט. לעומת זאת, פזילה (stbm, aka ואן ^גוך-7) מוטציה, את הקוטביות ommatidial אבד, למרות משלימים photoreceptor מלא קיים, סיבוב כירליות הם אקראיים (איור 3B). יתר על כן, מאז אלל stbm מחולק היה aw ^- הרקע, גרגרי פיגמנט חסרים באיור. 3B. איור 3C מציג דוגמה של ניתוח משובט. תסיסנית Rho קינאז (drok) נדרש סיבוב ommatidial כמו גם על שלמות מבנית של העין ^8. הומוזיגוטים drok ² שיבוטים ניתן לזהות על ידי העדר פיגמנט בתאי הפיגמנט ואת rhabdomeres (בדרך כלל, שיבוטים הם חסרי עיניים הנגרמת באמצעות-FLP ו-P-אלמנט עם גן הביע בתוקף סמן לבן המשלימה w רקע ^- מוטציה בטבע סוג ורקמות הטרוזיגוטיים). זה ובכך ניתן לזהות אזורים מוטציה על ידי חוסר פיגמנט. בשל האוטונומיה תאים של פיגמנטציה של ה-R-CElls שהוזכר קודם לכן, גנוטיפ של הפרט R-תאים ניתן לקבוע (ראה ראשי חץ באיור. 3C).

באיור 1. העין תסיסנית היא מערכת מודל מצוינת עבור הביולוגים מאז, בניגוד המשטח החלק של העין wild-type (א), את פני השטח של העין מוטציה היא חיצונית גסה לעתים קרובות (ב), מעיד על פנוטיפים עין הבסיסית . ב כל הדמויות, הקדמי הוא שמאלה הגבי הוא למעלה. תמונות באדיבות ד"ר ג'ניפר קרטיס, NMSU, Las Cruces, NM, ארה"ב.

איור 2. תמונות מיקרוסקופיות של אור האומטידיה אחד מחולק באמצעות השיטה המתוארת. רק שבעה R-תאים גלויים בכל פעם לכל אומטידיום, מאז R7 שקרים על גבי R8. (א ', א') ברמה R7, גוף התא של R7 מזוהה בין R1 ו-R6 (חץ צהוב "). לעומת זאת, ברמה R8 (ב), גוף התא של R8 מזוהה בין R1 ו R2 (חץ צהוב ב '). ראשי חץ כחול מסמנים את גרגרי פיגמנט שיכול לשמש כסמן תאים אוטונומיים פיגמנט.

איור 3. סעיפים משיק דרך wild-type (A), stbm (B) drok (C) מוטציה העיניים מבוגר תסיסנית. שרטוטים להלן הסעיפים לציין את הקוטביות של האומטידיה (ראה (א) על החצים). המעגלים מייצגים האומטידיה עם פגמים להשלים את photoreceptor. קווי זהב מייצגים את קו הגב / הגחון של סימטריה (קו המשווה). בניגוד האומטידיה גם אוריינטציה של wild-type (A), הארגון מישוריים הולך לאיבוד מוטציה stbm (B). ראוי לציין, כי סעיף של מוטציה stbm הראו חסר פיגמנט בשל w שלה ^- רקע מוטנטים. (ג) כי מוטציות drok הם קטלניים, הם צריכים להיות מנותח שיבוטים. לכן, תאים פיגמנט הם wild-type או הטרוזיגוטיים (ראשי חץ כחול מלא), בעוד R-תאים חסר פיגמנט (ראשי חץ כחול פתוח) הם מוטנטים הומוזיגוטים. בנוסף לפגמים סיבוב, מוטנטים drok גם להראות פגמים מבניים לרבות מספרי חסר או עודף של R-תאים. שימו לב לניתוח המשובטים, קטעי אינם מוכתמים כדי למנוע טשטוש גרגרי פיגמנט.

Discussion

שימוש תסיסנית כאורגניזם מודל, מסכי הגנטי הוביל לזיהוי של רבים מן החברים המייסדים של משפחות גנים חיוניים ביותר של מסלולי איתות שמור ביותר אאוקריוטים גבוה כולל בני אדם. מאז, בתנאי מעבדה, עין פונקציונלי הוא לוותר להישרדות, העין היא רקמה במיוחד גם מתאים הגילוי של פונקציות גן הרומן ההערכה של רשתות גנטיות. ניתוח Ultrastructural העין לטוס באמצעות השיטה המתוארת ובכך הובילו תגליות בסיסיות הרלוונטיות לפיתוח המחלה. בתחילה, ניתוח תא בודד המשובטים בוצעה באמצעות רנטגן שיבוטים המושרה בשילוב עם ידוע תאים אוטונומיים סמנים קשר הדוק רצסיבי. לאחרונה, את הזמינות של מערכת FLP / FRT כדי ליצור שיבוטים יש להקל במידה רבה את הניתוח פנוטיפי של מוטציות קטלניות בסעיפים ^6,9 העין.

ניתוח סעיפים העין אינה מוגבלת סעיפים משיק המתואר כאן. אם תרצה, בראש ניתן ליישר בכיוון כלשהו בתוך תבניות וחתכים רוחביים ניתן להשיג ללמוד רבדים עמוקים יותר בראש כגון lamina ואת לשד. פרוטוקול המתואר כאן הוא אפוא בשיטה תכליתי עבור ניתוח עיניים וראש מבוגרים מבני תסיסנית.

Materials

General equipment: For general fly husbandry see 10 Standard dissection microscope (e.g. Nikon SMZ-645 Stereo Zoom Microscope), preferably with a ring light source to prevent casting a shadow of your hands. CO2 Fly pad, covered with 3MM Whatman paper to provide protection against dirt during dissection. Gelatin coated slides: dissolve 10g gelatin and 1g CrKSO4x 12 H2O in 1L water on a heating plate (bring almost to a boil, takes approximately 2 hrs). Dip well washed (soap) and rinsed (dH2O) slides in holders into gelatin solution and air-dry covered with foil overnight. Heating oven (70°C; old vacuum ovens that were used for nitrocellulose filter drying are well suited for this purpose). Microtome capable of ultrathin sectioning (0.5-1 μm thick sections), e.g. those used by electron microscopy facilities. We use a Sorvall MT5000 Ultramicrotome with a Histo quality diamond knife. Glass knives also work. Fixation solutions: Prepare a stock solution of 0.2 M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Prepare 2% glutaraldehyde in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2 (can be stored at 4°C for 4 weeks). Make at least enough to have 200μl per genotype you want to embed. Keep on ice. Osmium solution: 2% OsO4 in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Make only enough to have 200μl per genotype you want to embed, since the solution cannot be stored. Keep on ice. Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette. Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use. Staining solution: 1% Toluidine-blue in 1% Borax. Soft Hard Resin A 54g 50g Hardener B 44.5g 50g Accelerator C 2.5g 1.75g Plasticizer D 10g 0.75g Table 1. Resin preparation To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol. Reagent Supplier Catalog number Fly pad e.g. Genesee 59-119 Glutaraldehyde Sigma G7526-10 X 10 ML OsO4 Polysciences,Inc. 0972A-20 Propyleneoxide Fisher 04332-1 Scalpel handles, for #3 Fisher 22080046 Scalpel blades #11 Fisher 08-916-5B Transfer pipettes Fisher 13-711-7M Durcupan (R) ACM resin Sigma (Fluka) 44610-1EA Steel dissecting needle Fisher S17346 BEEM flat embedding mold Electron Microscopy Sci. 70904-12 Teflon coated razor blades Electron Microscopy Sci. 71970 Q-tip (sterile swabs) Fisher 14-959-81 Glass slides Fisher 12-550-143 Cover slips No 1, 22X60 mm Fisher 12-531K Gelatin Fisher ICN96010280 Cr(III) K SO4 dodecahydrate Sigma 243361 Diamond Histo knife, 6mm Diatome US 60-His Toluidine Blue O Fisher BP107-10 Borax (Na-Tetraborate) Fisher AC20629-1000 DPX mounting medium Sigma 44581-100ML Table 2. Materials