Summary
Ultraschall gezielte Mikroblasen Destruction (UTMD) können verwendet werden, um ortsspezifische Abgabe von bioaktiven Molekülen, einschließlich therapeutischer Gene zu richten, um Organe zugänglich Ultraschall, wie Herz und Leber Ziel sein
Abstract
In UTMD, bioaktive Moleküle, wie negativ geladenen Plasmid-DNA-Vektoren kodieren ein Gen von Interesse sind, um die kationische Schalen von Lipid-Mikrobläschen-Kontrastmittel 7-9 aufgenommen. In Mäusen diesen Vektor-tragenden Mikrobläschen kann intravenös oder direkt an den linken Ventrikel des Herzens verabreicht werden. In größeren Tieren können sie auch durch eine intrakoronare Katheter infundiert werden. Die Nachlieferung aus dem Kreislauf zu einem Zielorgan erfolgt durch akustische Kavitation bei einer Resonanzfrequenz der Mikrobläschen. Es scheint wahrscheinlich, dass die mechanische Energie, die durch die Zerstörung von Mikrobläschen Ergebnisse in transient Porenbildung in oder zwischen den Endothelzellen der Mikrovaskulatur der Zielregion 10 erzeugt. Als Ergebnis dieser Sonoporation Effekt ist die Transfektionseffizienz in und über den Endothelzellen verbessert und Transgen-kodierende Vektoren sind in das umgebende Gewebe abgelagert. Plasmid-DNA im Blutkreislauf schnell abgebaut wird durch Nukleasen in das Blut, das reduziert die Wahrscheinlichkeit von Lieferungen in Nicht-beschallten Gewebe und führt zu sehr spezifischen Ziel-Orgel Transfektion.
Protocol
1. Mikroblasen Stoffaufbereitung
- In 10 ml PBS-Mix 200 mg 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholin und 50 mg 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylethanolamin mit 1 g Glucose.
- Erhitzen Sie die Mischung in kochendes Wasserbad 20-30 Minuten, Pipette Mischen alle 5 Minuten.
- Die Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden für bis zu 6 Monaten.
2. Mikroblasen Vorbereitung
- Werfen Sie einen 250 ul der vorbereiteten Mikroblasen Stammlösung und Inkubieren bei 40 ° C für 15 Minuten.
- Die vorgewärmte Mikroblasen Lösung wird dann auf einem 1,5 mL Mikroröhrchen mit 50 ul von Glycerin übertragen.
- 1-2 mg der gereinigten Plasmid-DNA, die einen Ausdruck für das Gen von Interesse (gereinigt in diesem Beispiel von Qiagen Endotoxin frei MegaPrep Kit, Qiagen, Germantown, MD, mit einer optimalen Konzentration von 4mg/ml) zu konstruieren. 2,4) Phosphat-gepufferte Salzlösung ist, um ein Endvolumen von 500 ul zugegeben. Endotoxin frei Qiagen maxipreps verwendet werden, sowie sterile PBS, um die Sterilität zu gewährleisten.
- Die Luft in der Mikroröhrchen wird dann mit Octafluorpropan Gas ersetzt.
- Die Mikroröhrchen wird dann kräftig in eine zahnärztliche Amalgamator für 20 Sekunden geschüttelt.
- Der Unterstand mit Rest-DNA und Puffer, die nicht der Mikrobläschen ist gebunden wird dann vorsichtig entfernt und die Mikrobläschen-Schicht wird dreimal mit sterilem PBS gewaschen, um ungebundene DNA zu entfernen, und auf Eis zwischen jedem Waschgang. Wir in der Regel erreichen eine verbindliche Effizienz von 30-40%. Alle Reagenzien sind steril und Sorgfalt gemacht, um eine Kontamination zu minimieren.
- Die Plasmid-DNA-gebundenen Mikrobläschen werden dann auf Eis gelegt bis zu zwei Stunden bis zur Verwendung.
- Der Unterstand aus dem Mikroröhrchen nach dem Mischen und dem PBS Waschungen entfernt werden, können verwendet werden, um die Konzentration der ungebundenen DNA, und ebenso die Menge gebunden, auf die bekannten ursprünglichen Konzentration zu bestimmen, durch Messung der optischen Dichte der Lösung bei einer Wellenlänge von 260nm mit einem Spektralphotometer.
3. Gerätekalibrierung
- Vor dem ersten Gebrauch muss ein 1 MHz Kavitation Wandler zu kalibrieren, um eine ordnungsgemäße mechanische Index und Impulsfolgefrequenz zu gewährleisten. Eine Tauchpumpe 1 MHz, 13mm, unscharf Wandler ist ein 20 MHz Funktion / Arbitrary Waveform Generator über einen Leistungsverstärker verbunden.
- Der Wandler ist in einem Kunststoff-Behälter voller Wasser platziert, direkt an einem Hydrophon, was zu einem 500-MHz-Oszilloskop wurde über einen Ladungsverstärker verbunden abzielen.
- Waveform können Frequenz, Amplitude, Burst-Zyklus, und Leistungsverstärkung alle geändert, um die ordnungsgemäße duty cycle und mechanischen Index optimal auf die Mikrobläschen kavitieren erhalten. Für dieses spezielle Experiment haben wir das System auf einem mechanischen Index entspricht ~ 1,3 bei 1 MHz kalibriert.
4. Mikroblasen Lieferung & UTMD
- Vor Mikroblasen Lieferung und UTMD wurden C57BL / 6 Mäuse mit 100mg/kg Ketamin und Xylazin 5mg/kg durch IP Injektion.
- Mikroblasen Lieferung wurde intravenös über eine direkte Injektion in den linken Ventrikel des Herzens oder durch Schwanzvene Katheterisierung verabreicht. Für die direkte kardiale Injektion wird ein Volumen von bis zu 100 ul der Plasmid-DNA-beladenen Mikrobläschen Lösung durch eine 30-Gauge-Nadel an der vorderen 4 th Interkostalraum unter Ultraschall-Visualisierung eingefügt in die linke Herzkammer injiziert.
- Die Mikrobläschen Lösung Bolus aus dem linken Ventrikel Injektion wird visualisiert mit Visual Sonics "38 MHz Hochfrequenz-Schallkopf in einer stationären Position auf dem Thorax der Maus in eine lange Achse Ansicht mit VisualSonics gelegt" Vevo 2100 Imaging System. Alle Spritzen und Nadeln sind steril, die Versicherung der sterilen Umgebung möglich, dass diese Injektionen.
- Unmittelbar nach der Injektion wird Mikroblasen Zerstörung out für ca. 5 Minuten mit einem zweiten, kleineren niedrige Frequenz von 1,0 MHz Schallkopf statt direkt über das gewünschte Organ, Targeting Zerstörung dieser Region durchgeführt. In diesem Beispiel wurde der Ultraschall in die Leber bei einer Pulsfrequenz von 1,0 MHz verabreicht wird, mit einem mechanischen Index entspricht ca. 1,3-1,5 und Impulsfolgefrequenz Zeitraum von 100 ms für alle 20 Zyklen. Alternativ kann der Puls gated die EKG der Maus (in diesem Experiment nicht gezeigt), um einen Ausbruch von 3 Bilder von Ultraschall, alle 4-6 Herzzyklen. Wir erhalten eine höhere Effizienz der Transfektion mit Protokollen, die das Kapillarbett können zum Nachfüllen mit Blasen zwischen den Bursts von Ultraschall.
5. Alternative Lieferung Methode
Wir entschieden uns für die interventrikulären Injektion aufgrund der Komplexität des Verfahrens Highlight, aber in vielen Fällen, wie zB längere Infusion von Mikrobläschen, eine Schwanzvene injection ist die bevorzugte Methode. Für die Schwanz-Vene Methode der Mikrobläschen Lieferung, ist die Maus betäubt die gleiche Weise. Eine Spritze mit der Plasmid-DNA-gebundenen Mikrobläschen ist es, eine 27-Gauge-Nadel / Schwanzvene Katheter verbunden. Die Schwanzvene Katheter in die distalen Drittel der entweder den rechten oder linken seitlichen Adern, die entlang der Schwanz der Maus eingefügt. Die Spritze mit der Mikrobläschen in einer Infusionspumpe, die automatisch verwaltet eine einheitliche voreingestellten Volumen der Lösung über eine vorgegebene Zeit gelegt. Wir ziehen in der Regel 200-300μl einer Rate von 3ml/hour.
Tierversuche
Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit guter Tier Praxis von den zuständigen nationalen und / oder lokale Tierschutz Körper definiert behandelt, und alle tierischen Arbeit wurde durch den zuständigen Ausschuss genehmigt (University of Hawaii Institutional Animal Care und Verwenden Committee, Zulassungsnummer 07-100 -3). Entsprechende Narkose (Ketamin / zylazine) verwendet wurde und Analgetika (Bupivacain und Buprenorphin) zur Verfügung standen, aber nicht erforderlich.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Die Wirksamkeit des UTMD-vermittelte Plasmid-DNA Lieferung kann durch eine Vielzahl von Methoden abhängig von der Gene in das Konstrukt, wie codierte ausgewertet werden, aber nicht beschränkt; Luciferase in-vivo-Bildgebung, B-gal ex vivo-Färbung, und / oder Immunhistologie. Insbesondere in vivo Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht es, die Anwesenheit und die Dauer der Genexpression seriell in Mäusen mit einem Plasmid kodierend für eine Biolumineszenz-Reportergen (Luciferase) transfiziert überwachen. Die Xenogen In Vivo Imaging System (IVIS) (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) ist für die Biolumineszenz Bildgebung verwendet. Die Bilder werden in der Regel von allen Mäusen ersten Tag nach UTMD vermittelte Transfektion genommen und wiederholt sich alle drei vor vier Tagen bis Biolumineszenz Genexpression ist nicht mehr visuell erkennbar durch das System (Abbildung 1). Zur Vorbereitung Mäuse für Biolumineszenz Bildgebung, Mäuse zuerst eine IP Injektion des Luciferase-Reporter-Sonde D-Luciferin (Caliper Life Sciences) und dann narkotisiert ~ 3 Minuten später. Bioverteilung der D-Luciferin-Substrat darf für ~ 10 Minuten ablaufen, bevor das Tier in der IVIS Bildgebung Kammer platziert und ein Ganzkörper-Bild zu scannen genommen wird. Während der Akquisition werden die Photonen aus der Firefly-Luciferase / D-Luciferin photochemische Reaktion emittiert gemessen. Abbildung 1 zeigt auch, ähnlich IVIS Biolumineszenz Bildgebung der Leber nach UTMD und Abbildung 2 ist ein Epifluoreszenz (100X) Bild der transfizierten Leber mit Hilfe eines anti-Luciferase primärer Antikörper (Sigma-Aldrich) und AlexFluor-568 konjugierten sekundären Antikörper (Invitrogen) . Es ist klar zu sehen, dass die UTMD vermittelte Transfektion Leber hat nicht nur die Endothelzellen betroffen, aber die hepatocyes auch.
Abbildung 1 Xenogen / IVIS Bildgebung des Herzens UTMD behandelten Mäusen (A) Negative Control Mouse:.. Plasmid + PBS, gefolgt von Herz gerichtet UTMD, (B) Behandlung Mouse: Plasmide + Mikrobläschen durch Herz gefolgt gerichtet UTMD und (C) Behandlung Maus : Plasmid + Mikrobläschen von Leber, gefolgt gerichtet UTMD.
Abbildung 2. Immunhistochemie der Leber UTMD (anti-Luciferase in rot). (A) Plasmid ohne UTMD und (B) Plasmid mit UTMD. Konfokale Bild (100X); Kerne sind DAPI blau angefärbt.
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Discussion
UTMD stellt einen neuartigen Ansatz zur Gentransfer. Als Plattform-Technologie kann es mit jedem der vielen möglichen Gentherapie-Strategien kombiniert werden, um eine Vielzahl von bioaktiven Molekülen, wenn ein hohes Maß an Gewebsspezifität gewünscht zu liefern. Die wichtigsten biologischen Einschränkung der Technik ist die geringe Effizienz der Transfektion. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Zugänglichkeit der Zielorgan zu Ultraschall, die deutlich durch Eingriffe Knochen oder in der Luft verringert werden kann. Die Technik erfordert die Optimierung von Technik, basierend auf Zielgewebe 11 sowie ein grundlegendes Verständnis von Akustik, zu Gewebeschäden 11 und die Effizienz zu steigern begrenzen. Dennoch bietet sie eine kostengünstige, schnelle und reproduzierbare Vorgehensweise bei der Bewertung der Wirkung von Gewebe-spezifische Transgenexpression und kann eine wirksame Therapie für Erkrankungen, bei denen geringe Transgenexpression nützlich sein könnte, zu liefern.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Zuschüsse hat NHLBI HL080532, NHLBI HL073449, NCRR RR16453 und ein AHA Nationale Grant-in Aid Award (RVS) enthalten. Ein besonderer Dank geht an die Entfernung Course Design und Consulting (DCDC)-Gruppe, dcdcgroup.org, für ihre Unterstützung mit Video-Produktion und dem US Department of Education Grant No P336C050047, dass die DCDC gegründet verlängert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine | Sigma-Aldrich | P-5911 | component of the microbubble lipid shell |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine | Sigma-Aldrich | P-3275 | component of the microbubble lipid shell |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | thought to stabilize the microbubbles |
| phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | believed to prevent microbubbles from coalescing |
| Octafluoropropane gas | Airgas | N/A | inert gas used in clinical applications |
| VialMix dental amalgamator | Bristol-Myers Squibb | N/A | |
| 1 MHz, 13mm, unfocused transducer | Olympus Corporation | A303S-SU | |
| 20 MHz Function/Arbitrary Waveform Generator | Agilent Technologies | 33220A | |
| Power Amplifier | Krohn-Hite Co. | Model 7500 | |
| Hydrophone | Bruel and Kjaer | Type 1803 | |
| Charge Amplifier | Bruel and Kjaer | Type 2634 | |
| 500 MHz Oscilloscope | LeCroy | 9354L | |
| VisualSonics’ Vevo 2100 Imaging System with 34 MHz transducer | VisualSonics, inc. | 2100 | |
| 27G one inch tail vein catheters | VisualSonics, inc. | N/A | |
| Genie Plus infusion pump | Kent Scientific | GENIE |
References
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