Summary
अल्ट्रासाउंड लक्षित microbubble विनाश (UTMD) साइट विशिष्ट bioactive अणुओं के वितरण चिकित्सकीय जीन सहित, सीधा, दिल और जिगर के रूप में अल्ट्रासाउंड के लिए सुलभ अंगों को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है
Abstract
UTMD, नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए प्लाज्मिड ब्याज की एक जीन एन्कोडिंग वैक्टर के रूप में bioactive अणु, में, लिपिड microbubble विपरीत एजेंट 7-9 की धनायनित गोले करने के लिए जोड़ रहे हैं. इन चूहों में वेक्टर ले जाने microbubbles दिल के बाएं वेंट्रिकल नसों या सीधे प्रशासित कर सकते हैं. बड़े जानवरों में वे भी एक intracoronary कैथेटर के माध्यम से संचार किया जा सकता है. प्रचलन से एक लक्ष्य अंग के बाद प्रसव microbubbles के एक गुंजयमान आवृत्ति ध्वनिक cavitation द्वारा होता है. यह संभावना लगता है कि यांत्रिक ऊर्जा में या लक्षित 10 क्षेत्र के microvasculature के endothelial कोशिकाओं के बीच क्षणिक ताकना गठन में microbubble विनाश परिणाम द्वारा उत्पन्न . इस sonoporation प्रभाव का एक परिणाम के रूप में, में और endothelial कोशिकाओं भर अभिकर्मक दक्षता को बढ़ाया है, और transgene एन्कोडिंग वैक्टर आसपास के ऊतकों में जमा कर रहे हैं. प्लाज्मिड संचलन में शेष डीएनए तेजी है रक्त है, जो आगे गैर - sonicated ऊतकों को प्रसव की संभावना को कम कर देता है और अति विशिष्ट लक्ष्य अंग अभिकर्मक होता है में न्युक्लिअसिज़ द्वारा अपमानित है.
Protocol
1. Microbubble शेयर तैयारी
- 10 में पीबीएस की mls 1 ग्राम ग्लूकोज के साथ 200 1,2 - dipalmitoyl - एस.एन. - glycero 3 - phosphatidylcholine और 50 मिलीग्राम मिलीग्राम 1,2 dipalmitoyl - एस.एन. - glycero-3-phosphatidylethanolamine मिश्रण.
- उबलते पानी के स्नान 20-30 मिनट में मिश्रण गर्मी, पिपेट हर 5 मिनट के मिश्रण.
- समाधान 4 ° C में संग्रहीत किया जा सकता है 6 महीने के लिए.
2. Microbubble तैयारी
- तैयार microbubble शेयर समाधान सेते हैं और 40 में ° सी 15 मिनट के लिए एक 250 μl लो.
- पूर्व गर्म microbubble समाधान तो एक 1.5 एमएल microtube ग्लिसरॉल के 50 μl युक्त स्थानांतरित किया है.
- प्लाज्मिड डीएनए एन्कोडिंग एक अभिव्यक्ति हित के जीन (4mg/ml की एक इष्टतम एकाग्रता के साथ Qiagen endotoxin MegaPrep मुक्त किट, Qiagen, Germantown, एमडी, द्वारा इस उदाहरण में शुद्ध) के लिए निर्माण शुद्ध 1-2 मिलीग्राम. 2.4) खारा फास्फेट बफर 500 μl के अंतिम मात्रा में जोड़ा जाता है. Endotoxin मुक्त Qiagen maxipreps प्रयोग किया जाता है, के रूप में बाँझ पीबीएस के रूप में अच्छी तरह से क्रम में बाँझपन को सुनिश्चित है.
- microtube में हवा तब Octafluoropropane गैस के साथ जगह है.
- microtube तो 20 सेकंड के लिए एक दंत amalgamator में सख्ती हिल.
- subnatant युक्त अवशिष्ट डीएनए और बफर कि microbubbles के लिए बाध्य नहीं है तो ध्यान से हटा दिया है और microbubble परत बाँझ पीबीएस के साथ तीन बार धोया जाता है स्वाधीन डीएनए निकालने के लिए, और प्रत्येक धोने चक्र के बीच बर्फ पर रखा है. हम आमतौर पर 30-40% की एक बाध्यकारी दक्षता हासिल है. सभी अभिकर्मकों बाँझ कर रहे हैं और देखभाल करने के लिए संक्रमण को कम करने के लिए किया जाता है.
- प्लास्मिड डीएनए बाध्य microbubbles के लिए तो बर्फ पर रखा उपयोग करें जब तक दो घंटे के लिए.
- मिश्रण और washes पीबीएस के बाद microtube से हटा दिया, subnatant अनबाउंड डीएनए की एकाग्रता है, और इसी तरह बाध्य राशि ज्ञात प्रारंभिक एकाग्रता पर आधारित निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उपयोग 260nm की एक तरंग दैर्ध्य पर इस समाधान के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर.
3. उपकरण अंशांकन
- पहले का उपयोग करने के लिए पहले, एक 1 मेगाहर्ट्ज cavitation transducer करने के लिए उचित यांत्रिक सूचकांक और नाड़ी पुनरावृत्ति को सुनिश्चित करने के लिए calibrated किया जा जरूरत है. एक submergible 1 मेगाहर्ट्ज, 13mm, अनफोकस्ड transducer एक 20 मेगाहर्टज फंक्शन / एक शक्ति एम्पलीफायर के माध्यम से मनमाना तरंग जनरेटर से जुड़ा है.
- transducer पानी से भरा एक प्लास्टिक कंटेनर में रखा जाता है, एक hydrophone है, जो एक प्रभारी प्रवर्धक के माध्यम से किया गया है एक 500 मेगाहर्ट्ज आस्टसीलस्कप से जुड़े सीधे उद्देश्य है.
- तरंग, आवृत्ति, आयाम, फट चक्र, और शक्ति प्रवर्धन सभी उचित कर्तव्य चक्र और यांत्रिक सूचकांक microbubbles cavitate इष्टतम प्राप्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. यह विशेष रूप से प्रयोग के लिए, हम 1 मेगाहर्ट्ज पर एक यांत्रिक 1.3 ~ बराबर सूचकांक प्रणाली calibrated है.
4. Microbubble डिलिवरी और UTMD
- Microbubble डिलीवरी और UTMD पहले, C57BL 6 / चूहों आईपी इंजेक्शन के माध्यम से ketamine और 5mg/kg xylazine 100mg/kg साथ anesthetized थे.
- Microbubble डिलीवरी नसों के द्वारा एक प्रत्यक्ष इंजेक्शन के माध्यम से दिल के बाएं वेंट्रिकल में या पूंछ नस कैथीटेराइजेशन के माध्यम से प्रशासित किया गया था. सीधे हृदय इंजेक्शन के लिए, एक 30 गेज सुई के माध्यम से दिल के बाएं वेंट्रिकल में अल्ट्रासोनिक दृश्य के तहत पूर्वकाल 4 वें पसलियों के बीच अंतरिक्ष में डाला प्लास्मिड डीएनए लोड microbubble समाधान के 100 μl एक मात्रा अंतःक्षिप्त है .
- microbubble समाधान बाईं interventricular इंजेक्शन से परिणामस्वरूप सांस कल्पना दृश्य Sonics Vevo 2100 इमेजिंग सिस्टम '38 मेगाहर्ट्ज उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड VisualSonics का उपयोग कर एक लंबे अक्ष दृश्य में माउस की छाती पर एक स्थिर स्थिति में रखा transducer' का उपयोग. सभी सीरिंज और सुई बाँझ कर रहे हैं, सबसे बाँझ वातावरण इन इंजेक्शनों के लिए संभव बीमा.
- तुरंत इंजेक्शन के बाद, microbubble विनाश ~ 5 मिनट एक दूसरा, छोटे आकार कम आवृत्ति 1.0 मेगाहर्ट्ज transducer का उपयोग सीधे वांछित अंग पर आयोजित किया है, इस क्षेत्र को विनाश लक्ष्यीकरण के लिए किया जाता है. इस उदाहरण में, अल्ट्रासाउंड, 1.0 मेगाहर्ट्ज की एक नाड़ी पुनरावृत्ति आवृत्ति पर जिगर को दिलाई एक यांत्रिक सूचकांक 1.3-1.5 लगभग बराबर है, और एमएस के 100 पल्स हर 20 चक्र के लिए पुनरावृत्ति की अवधि के साथ. वैकल्पिक रूप से, नाड़ी अल्ट्रासाउंड के 3 फ्रेम, हर 4-6 हृदय चक्र का एक फट के लिए माउस के ईसीजी के लिए gated (इस प्रयोग में नहीं दिखाया गया है) किया जा सकता है. हम प्रोटोकॉल है कि अल्ट्रासाउंड के फटने के बीच बुलबुले के साथ फिर से भरना करने के लिए केशिका बिस्तर की अनुमति के साथ अभिकर्मक के अधिक से अधिक दक्षता प्राप्त करते हैं.
5. वैकल्पिक वितरण पद्धति
हम interventricular प्रक्रिया की जटिलता के कारण इंजेक्शन को उजागर करने के लिए चुना है, लेकिन microbubbles के लंबे समय तक प्रेरणा, एक पूंछ नस में जैसे कई मामलों मेंjection पसंदीदा तरीका है. पूंछ नस microbubble डिलीवरी की विधि के लिए, माउस anesthetized उसी तरह है. एक सिरिंज प्लास्मिड डीएनए बाध्य microbubbles युक्त एक 27 गेज / सुई पूंछ नस कैथेटर से जुड़ा है. पूंछ नस कैथेटर या तो माउस की पूंछ के साथ कि सही है या छोड़ दिया पार्श्व नसों के बाहर तीसरे में डाला जाता है. microbubbles युक्त सिरिंज एक जलसेक पंप है कि स्वचालित रूप से समय का एक पूर्व निर्धारित अवधि में एक समान समाधान की पूर्व निर्धारित मात्रा प्रशासन में रखा गया है. आम तौर पर हम 3ml/hour की दर पर 200 300μl बिगोना.
पशु उपयोग
सभी जानवरों अच्छा जानवर के अभ्यास के साथ अनुसार सुसंगत राष्ट्रीय और / या स्थानीय पशु कल्याण निकायों द्वारा परिभाषित के रूप में संभाल रहे थे, और सभी जानवर काम उपयुक्त समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (हवाई संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय, अनुमोदन संख्या 07-100 -3). उपयुक्त संज्ञाहरण (/ ketamine zylazine) का उपयोग किया था और दर्दनाशक दवाओं (Bupivicaine और buprenorphine) उपलब्ध थे, की आवश्यकता नहीं यद्यपि.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
निर्माण, जैसे इनकोडिंग जीन पर निर्भर करता है तरीकों की एक किस्म के माध्यम से UTMD की मध्यस्थता डीएनए प्लाज्मिड वितरण की प्रभावशीलता का मूल्यांकन किया जा सकता है, लेकिन सीमित नहीं है, vivo इमेजिंग, बी लड़की पूर्व vivo धुंधला , और / या में luciferase immunohistology. विशेष रूप में, vivo में bioluminescence इमेजिंग में एक उपस्थिति और जीन अभिव्यक्ति की अवधि एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग एक bioluminescent रिपोर्टर जीन (luciferase) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट चूहों में serially पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है. Vivo इमेजिंग प्रणाली (IVIS) में Xenogen (कैलिपर लाइफ साइंसेज, Hopkinton, एमए) bioluminescent इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है. छवियाँ को आम तौर पर सभी UTMD मध्यस्थता अभिकर्मक के बाद पहले दिन चूहों के ले रहे हैं और हर तीन से चार दिन दोहराया है जब तक bioluminescent जीन अभिव्यक्ति नेत्रहीन प्रणाली (चित्रा 1) के माध्यम से detectable नहीं रह गया है. Bioluminescent इमेजिंग के लिए चूहों को तैयार करने के लिए, चूहों पहले luciferase रिपोर्टर की एक आईपी इंजेक्शन प्राप्त डी luciferin (कैलिपर लाइफ साइंसेज) जांच और फिर anesthetized कर रहे हैं ~ 3 मिनट के बाद. डी luciferin सब्सट्रेट के biodistribution ~ 10 मिनट के लिए आगे बढ़ना पहले जानवर IVIS इमेजिंग कक्ष में रखा गया है और एक पूरे शरीर की छवि स्कैन लिया जाता है की अनुमति दी है. अधिग्रहण के दौरान, जुगनू luciferase / डी luciferin प्रकाश रासायनिक प्रतिक्रिया से उत्सर्जित फोटॉनों मापा जाता है. चित्रा 1 UTMD निम्नलिखित जिगर के समान IVIS bioluminescent इमेजिंग दिखाता है, और चित्रा 2 ट्रांसफ़ेक्ट जिगर के epifluorescence (100X) छवि एक विरोधी luciferase प्राथमिक (सिग्मा Aldrich) एंटीबॉडी और AlexFluor-568 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (Invitrogen) का उपयोग . यह स्पष्ट है कि UTMD मध्यस्थता जिगर अभिकर्मक न केवल endothelial कोशिकाओं को प्रभावित किया है, लेकिन hepatocyes के रूप में अच्छी तरह से.
चित्रा 1 / Xenogen IVIS हृदय की इमेजिंग इलाज चूहों (ए) नकारात्मक नियंत्रण माउस UTMD:. प्लाज्मिड + पीबीएस हृदय निर्देशित UTMD द्वारा पीछा किया, (बी) उपचार माउस: प्लाज्मिड + हृदय द्वारा पीछा microbubbles निर्देशित UTMD, और (सी) उपचार माउस . प्लाज्मिड + जिगर द्वारा पीछा microbubbles UTMD निर्देशित.
चित्रा 2. जिगर UTMD के immunohistochemistry (विरोधी लाल रंग में - luciferase) (ए) कोई UTMD के साथ प्लाज्मिड, और (बी) UTMD के साथ प्लाज्मिड . Confocal (100X) छवि, नाभिक DAPI नीले दाग रहे हैं.
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Discussion
UTMD जीन डिलीवरी के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है. एक मंच प्रौद्योगिकी के रूप में यह कई संभावित जीन थेरेपी रणनीतियों के किसी के साथ संयुक्त किया जा सकता है है, जब ऊतक विशिष्टता के एक उच्च डिग्री वांछित है bioactive अणुओं की एक असंख्य देने. तकनीक का मुख्य जैविक सीमा अभिकर्मक के कम दक्षता है. एक अन्य महत्वपूर्ण विचार अल्ट्रासाउंड, जो स्पष्ट रूप से हड्डी या हवा के बीच द्वारा कम किया जा सकता है के लिए लक्ष्य अंग की पहुँच है. तकनीक तकनीक का लक्ष्य 11 ऊतक पर आधारित अनुकूलन के रूप में अच्छी तरह के रूप में ध्वनिकी के एक बुनियादी समझ की आवश्यकता है, ऊतक 11 नुकसान और दक्षता में वृद्धि की सीमा. हालांकि, यह ऊतक विशेष transgene अभिव्यक्ति के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक सस्ता, तेजी से, और repeatable दृष्टिकोण प्रदान करता है, और जहां transgene अभिव्यक्ति के निम्न स्तर उपयोगी हो सकता है है विकारों के लिए प्रभावी चिकित्सा वितरित कर सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
अनुदान समर्थन NHLBI HL080532, NHLBI HL073449, RR16453 NCRR, और एक अहा राष्ट्रीय अनुदान सहायता पुरस्कार (RVS के लिए) शामिल है. विशेष धन्यवाद दूरी कोर्स डिजाइन और वीडियो उत्पादन के साथ उनकी सहायता के लिए परामर्श समूह (DCDC), dcdcgroup.org, और शिक्षा अनुदान P336C050047 सं कि DCDC की स्थापना की अमेरिका विभाग बढ़ाया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine | Sigma-Aldrich | P-5911 | component of the microbubble lipid shell |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine | Sigma-Aldrich | P-3275 | component of the microbubble lipid shell |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | thought to stabilize the microbubbles |
| phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | believed to prevent microbubbles from coalescing |
| Octafluoropropane gas | Airgas | N/A | inert gas used in clinical applications |
| VialMix dental amalgamator | Bristol-Myers Squibb | N/A | |
| 1 MHz, 13mm, unfocused transducer | Olympus Corporation | A303S-SU | |
| 20 MHz Function/Arbitrary Waveform Generator | Agilent Technologies | 33220A | |
| Power Amplifier | Krohn-Hite Co. | Model 7500 | |
| Hydrophone | Bruel and Kjaer | Type 1803 | |
| Charge Amplifier | Bruel and Kjaer | Type 2634 | |
| 500 MHz Oscilloscope | LeCroy | 9354L | |
| VisualSonics’ Vevo 2100 Imaging System with 34 MHz transducer | VisualSonics, inc. | 2100 | |
| 27G one inch tail vein catheters | VisualSonics, inc. | N/A | |
| Genie Plus infusion pump | Kent Scientific | GENIE |
References
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