Summary
Ultrason Hedeflenen Mikro Destruction (UTMD), ultrason ile kalp ve karaciğer gibi organlar, hedef, terapötik genler de dahil olmak üzere, biyoaktif moleküllerin siteye özgü teslimat, doğrudan kullanılabilir
Abstract
Gibi negatif yüklü ilgi bir gen kodlayan plazmid DNA vektörleri UTMD, biyoaktif moleküllerin lipid mikrokabarcık kontrast ajanlar 7-9 katyonik kabukları eklenir. Farelerde bu vektör taşıyan mikro kabarcık kalbin sol ventrikül intravenöz veya doğrudan uygulanabilir. Büyük hayvanlarda onlar da intrakoroner bir kateter aracılığıyla infüze olabilir. Dolaşımdan bir hedef organ sonraki teslim mikro kabarcık rezonans frekansta akustik kavitasyon oluşur. Bu mekanik enerji, ya da hedef bölgedeki 10 mikrovasküler endotel hücreleri arasındaki geçici gözenek oluşumuna mikrokabarcık imha sonuçları tarafından üretilen olası görünüyor . Bu sonoporation etkinin bir sonucu olarak, gelişmiş ve endotel hücreleri arasında transfeksiyon verimliliği ve transgen kodlama vektörler çevreleyen doku içine yatırılır. Nükleazlar-sonicated olmayan dokulara daha teslim olasılığını azaltır ve oldukça belirli bir hedef organ transfeksiyon yol açar, kan dolaşımını kalan plazmid DNA hızla düşer.
Protocol
1. Mikro stok hazırlama
- 10 ml PBS 1 gr glukoz 200 mg 1,2-dipalmitoyl-sn Glycéro-3-fosfatidilkolin ve 50 mg 1,2 dipalmitoyl-sn-Glycéro-3-phosphatidylethanolamine karıştırın.
- Pipet her 5 dakikada bir karıştırma, karışım kaynar su banyosunda 20-30 dakika ısıtın.
- Çözüm, 6 aya kadar 4 ° C saklanabilir.
2. Mikro Hazırlık
- 40 mikrokabarcık hazırlanan stok solüsyonu ve inkübe ° C 15 dakika boyunca 250 ul çekin.
- Sonra önceden ısıtılmış mikrokabarcık çözüm 50 ul gliserol içeren 1,5 mL mikrotüp aktarılır.
- Bir ifade ilgi gen (bu örnekte 4mg/ml optimal bir konsantrasyon ile Qiagen Endotoksin ücretsiz MegaPrep kiti, Qiagen, Germantown, MD, saflaştırılmış) inşa kodlayan plazmid DNA saflaştırılmış 1-2 mg. 500 ul nihai hacmi 2.4) Fosfat-tamponlu salin eklenir. Endotoksin ücretsiz Qiagen maxipreps kısırlık sağlamak için de steril PBS olarak kullanılır.
- Mikrotüp hava, sonra Octafluoropropane gaz ile değiştirilir.
- Mikrotüp sonra, 20 saniye boyunca bir diş amalgamator kuvvetlice çalkalanır.
- Mikro kabarcık bağlı değildir subnatant içeren kalıntı DNA ve tampon daha sonra dikkatlice çıkarılır ve mikrokabarcık katman unattached DNA kaldırmak için steril PBS ile üç defa yıkanır ve her yıkama döngüsü arasında buz konur. Biz genellikle% 30-40 bağlayıcı bir verimlilik elde edin. Tüm reaktifler steril ve bakım kontaminasyonu en aza indirmek için yapılır.
- Plazmid DNA bağlı mikro kabarcık, iki saat sonra, kullanılıncaya kadar buz üzerinde yukarı yerleştirilir.
- Karıştırma ve PBS yıkar sonra mikrotüp kaldırılır subnatant, bu çözümün kullanılarak 260nm dalga boyunda optik yoğunluk ölçüm bağlanmamış DNA konsantrasyonu, ve aynı şekilde bilinen ilk konsantrasyon dayalı bağlı miktarını belirlemek için kullanılır. Bir spektrofotometre.
3. Cihazları Kalibrasyonu
- İlk kullanımdan önce, 1 MHz kavitasyon transdüser uygun mekanik indeksi ve darbe tekrarlama sağlamak için kalibre edilmesi gerekir. Bir dalgıç 1 MHz, 13mm, odaklanmamış transdüser bir güç amplifikatörü ile 20 MHz Fonksiyon / Keyfi Dalga Şekli Jeneratörü bağlı.
- Dönüştürücü bir şarj amplifikatör ile 500 MHz osiloskop bağlı olmuştur hidrofon, doğrudan doğruya hedef, su dolu bir plastik kap konur.
- Dalga, frekans, genlik, patlama döngüsü ve amplifikatör gücü, uygun görev döngüsü ve mikro kabarcık cavitate optimal mekanik indeksi elde etmek için modifiye edilebilir. Bu deneme için, 1 MHz'de ~ 1.3 eşdeğer mekanik bir dizin sistemi kalibre var.
4. Mikro Teslimat & UTMD
- Mikrokabarcık teslimat ve UTMD önce C57BL / 6 fareler IP enjeksiyon yoluyla 5mg/kg ketamin ve ksilizin 100mg/kg ile anestezi edildi.
- Mikro teslim veya kuyruk ven kateterizasyonu ile kalbin sol ventrikül içine direkt enjeksiyon yoluyla intravenöz verildi. Doğrudan kalp enjeksiyon için 100 plazmid DNA yüklü mikrokabarcık çözüm ul hacmi, kalbin sol ventrikül içine ultrasonik görüş altında ön 4. interkostal eklenen bir 30 gauge iğne ile enjekte edilir .
- Sol interventriküler enjeksiyon kaynaklanan mikrokabarcık çözüm bolus Vevo 2100 Görüntüleme Sistemi Visual Sonics 'fare toraks VisualSonics kullanarak uzun eksen üzerinde sabit bir konumda yerleştirilmiş 38 MHz yüksek frekanslı ultrason probu' kullanılarak görüntülenmiştir. Bu enjeksiyonlar için mümkün olan en steril ortamda sigortalanması Tüm şırınga ve iğneler, steril.
- Enjeksiyonu takiben hemen, mikrokabarcık imha ~ 5 dakika ikinci bir küçük boyutlu düşük frekanslı 1.0 MHz transduser kullanılarak, istenilen organ üzerindeki doğrudan düzenlenen bu bölgede imha hedef için yapılır. Bu örnekte, ultrason mekanik yaklaşık 1,3-1,5 indeksi eşdeğeri, ve her 20 döngüleri için 100 ms darbe tekrarlama süresi, darbe tekrarlama frekansı 1.0 MHz karaciğer verildi. Alternatif olarak, darbe ultrason 3 kare, her 4-6 kalp döngüleri bir patlama (bu denemede gösterilmez) fare EKG gated olabilir. Biz ultrason patlamaları arasında kabarcıkları ile dolum kapiller yatak izin protokolleri ile transfeksiyon daha fazla verim almak.
5. Alternatif Dağıtım Yöntemi
Prosedürün karmaşıklığı nedeniyle interventriküler enjeksiyon vurgulamak için seçti, ancak mikro kabarcık uzun süreli infüzyon, bir kuyruk ven gibi birçok örnekleri,Enjeksiyon tercih edilen yöntemdir. Mikrokabarcık teslim kuyruk ven yöntemi için, fare, aynı şekilde anestezi. 27 iğne / kuyruk ven kateteri, plazmid DNA bağlı mikro kabarcık içeren bir şırınga bağlıdır. Kuyruk fare kuyruğu boyunca ya sağ ya da sol lateral damarları distal ven kateteri yerleştirilir. Mikro kabarcık içeren şırınga zaman önceden belirlenmiş bir süre içinde çözüm bir üniforma önceden ayarlanmış otomatik olarak yöneten bir infüzyon pompası yerleştirilir. Biz genellikle 3ml/hour bir oran 200-300μl demlenmeye.
Hayvan kullanımı
Bütün hayvanlar iyi hayvan uygulama ile ilgili ulusal ve / veya yerel hayvan refahı organları tarafından tanımlandığı şekliyle uygun olarak ele alındı ve tüm hayvan çalışmaları (Hawaii Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi, onay numarası 07-100 uygun komitesi tarafından kabul edildi -3). Uygun anestezi (ketamin / zylazine) kullanılan ve analjezikler (bupivakain ve Buprenorfin) ama gerekli değil, mevcut idi.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
UTMD aracılı plazmid DNA teslim etkinliği, yapı gibi kodlanmış genler bağlı yöntemlerden çeşitli aracılığıyla değerlendirilir, ancak bunlarla sınırlı değildir; B-gal ex vivo boyama, in vivo görüntüleme, ve / veya lusiferaz İmmunohistolojik. Özellikle, in vivo biyoparlaklık görüntüleme bir seri bir plazmid kodlama bioluminescent muhabiri geni (lusiferaz) ile transfekte farelerde gen ekspresyonu varlığı ve süresi izlemenize olanak sağlar. Vivo Görüntüleme Sistemi (IVIS) Xenogen (Kaliper Yaşam Bilimleri, Hopkinton, MA) bioluminescent görüntüleme için kullanılır. Görüntüler genellikle tüm fareler UTMD aracılı transfeksiyon sonra ilk gün alınır ve bioluminescent gen ekspresyonu artık görsel sistem (Şekil 1) saptanabilir kadar her üç dört gün tekrarlanır. Bioluminescent görüntüleme için fareler hazırlamak için, fare ilk prob D-luciferase (Kaliper Yaşam Bilimleri) ve daha sonra anestezi ~ 3 dakika sonra lusiferaz muhabiri bir IP enjeksiyon almak. D-luciferase substrat Biodistribution hayvan IVIS görüntüleme odasında yerleştirilir ve bir tam vücut imajı taraması çekilmeden önce ~ 10 dakika boyunca devam etmesine izin verilir. Satın alma sırasında, ateşböceği lusiferaz / D-luciferase fotokimyasal reaksiyon yayılan fotonlar ölçülür. Şekil 1 UTMD aşağıdaki karaciğer benzer IVIS bioluminescent görüntüleme göstermektedir ve Şekil 2 lusiferaz bir anti-primer antikor (Sigma-Aldrich) ve AlexFluor-568 konjuge sekonder antikor (Invitrogen) kullanarak transfekte karaciğer Epifloresans (100X) görüntü . UTMD aracılı karaciğer transfeksiyon endotel hücreleri sadece etkiledi görmek için açıktır, ama hepatocyes yanı.
Şekil 1 Xenogen / IVIS kardiyak görüntüleme tedavi edilen farelerde UTMD (A) Negatif Kontrol Fare:. Plazmid + PBS kardiyak yönettiği UTMD takip, (B) Tedavi Fare: Plazmid + kalp tarafından takip Mikrobaloncuklar UTMD yönettiği ve (C) Tedavi Fare karaciğer tarafından takip Plazmid + Mikrobaloncuklar UTMD yönetti.
Şekil 2 hiçbir UTMD karaciğer UTMD İmmünohistokimya (anti-lusiferaz kırmızı) (A) Plazmid ve (B) UTMD Plazmid. Konfokal görüntü (100X); çekirdekleri DAPI lekeli mavi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UTMD gen teslimat için yeni bir yaklaşımı temsil ediyor. Bir teknoloji platformu olarak, doku özgüllüğü yüksek derecede istenilen biyoaktif moleküllerin sayısız sunmak için birçok potansiyel gen tedavisi stratejileri ile kombine edilebilir. Tekniğin ana biyolojik sınırlama transfeksiyon en düşük verim. Bir başka önemli husus, belirgin, kemik ya da hava müdahale ederek azalmış olabilir ultrason, hedef organ erişilebilirlik. Bu teknik, doku hasarı 11 ve verimliliği artırmak sınırlamak için, 11 hedef dokuya göre teknik optimizasyonu gibi akustik temel bir anlayış gerektirir . Ancak, doku-spesifik transgen ifade etkisini değerlendirmek için, ucuz, hızlı ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar ve transgen ekspresyonu düşük düzeylerde yararlı olabilir hastalıkları için etkili bir tedavi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Hibe desteği NHLBI HL080532, NHLBI HL073449 NCRR RR16453 ve Hibe Yardım Ödülü (RVS) AHA Milli dahil etmiştir. Mesafe Ders Tasarım ve Danışmanlık (DCDC) grubu, dcdcgroup.org, video üretimi ile yardım için özel bir teşekkür ve DCDC kurdu Eğitim Bursu No P336C050047 US Department of uzatılır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine | Sigma-Aldrich | P-5911 | component of the microbubble lipid shell |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine | Sigma-Aldrich | P-3275 | component of the microbubble lipid shell |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | thought to stabilize the microbubbles |
| phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | believed to prevent microbubbles from coalescing |
| Octafluoropropane gas | Airgas | N/A | inert gas used in clinical applications |
| VialMix dental amalgamator | Bristol-Myers Squibb | N/A | |
| 1 MHz, 13mm, unfocused transducer | Olympus Corporation | A303S-SU | |
| 20 MHz Function/Arbitrary Waveform Generator | Agilent Technologies | 33220A | |
| Power Amplifier | Krohn-Hite Co. | Model 7500 | |
| Hydrophone | Bruel and Kjaer | Type 1803 | |
| Charge Amplifier | Bruel and Kjaer | Type 2634 | |
| 500 MHz Oscilloscope | LeCroy | 9354L | |
| VisualSonics’ Vevo 2100 Imaging System with 34 MHz transducer | VisualSonics, inc. | 2100 | |
| 27G one inch tail vein catheters | VisualSonics, inc. | N/A | |
| Genie Plus infusion pump | Kent Scientific | GENIE |
References
- Bekeredjian, R., Chen, S., Frenkel, P. A., Grayburn, P. A., Shohet, R. V. Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart. Circulation. 108, 1022-1026 (2003).
- Bekeredjian, R., Katus, H. A., Kuecherer, H. F. Therapeutic use of ultrasound targeted microbubble destruction: a review of non-cardiac applications. Ultraschall Med. 27, 134-140 (2006).
- Chen, S. Regeneration of pancreatic islets in vivo by ultrasound-targeted gene therapy. Gene Ther. 17, 1411-1420 (2010).
- Miao, C. H. Ultrasound enhances gene delivery of human factor IX plasmid. Hum Gene Ther. 16, 893-905 (2005).
- Shimoda, M., Chen, S., Noguchi, H., Matsumoto, S., Grayburn, P. A. In vivo non-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor improves revascularisation and restoration of euglycaemia after human islet transplantation into mouse liver. Diabetologia. 53, 1669-1679 (2010).
- Shohet, R. V. Echocardiographic destruction of albumin microbubbles directs gene delivery to the myocardium. Circulation. 101, 2554-2556 (2000).
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications. Bubble Sci Eng Technol. 1, 3-17 (2009).
- Li, H. L. Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances AAV-mediated gene transfection in human RPE cells in vitro and rat retina in vivo. Gene Ther. 16, 1146-1153 (2009).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Newman, C. M., Bettinger, T. Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer. Gene Ther. 14, 465-475 (2007).
- Vancraeynest, D. Myocardial injury induced by ultrasound-targeted microbubble destruction: evidence for the contribution of myocardial ischemia. Ultrasound Med Biol. 35, 672-679 (2009).
