Onderzoeken van buitenste haarcel beweeglijkheid met een combinatie van externe Alternating elektrisch veld Stimulatie en High-speed Image Analysis

Summary

Een betrouwbare methode om buiten haar cel (OHC) beweeglijke reacties, waaronder electromotility, trage motiliteit en buigen, te onderzoeken is beschreven. OHC beweeglijkheid wordt opgewekt door stimulatie met een externe wisselend elektrisch veld, en de methode maakt gebruik van high-speed foto-opname, op basis van LED-verlichting, en de laatste generatie beeldanalyse-software.

Abstract

OHCS zijn cilindrische sensomotorische cellen in het orgaan van Corti, het gehoororgaan in het binnenoor zoogdieren. De naam "haarcellen" is afgeleid van hun karakteristieke apicale bundel van stereocilia, een cruciaal element voor de detectie en de transductie van geluid energie ^1. OHCS zijn in staat om te veranderen van vorm langwerpig, verkorten en buig-in reactie op de elektrische, mechanische en chemische prikkeling, een motorische respons beschouwd als cruciaal voor cochleaire versterking van akoestische signalen ^2.

OHC stimulatie leidt tot twee verschillende beweeglijke reacties: i) electromotility, alias snel motiliteit, veranderingen in de lengte in de microseconde range afgeleid van elektrisch aangedreven conformationele veranderingen in de motorische eiwitten dicht verpakt in OHC plasmamembraan, en ii) trage beweeglijkheid, vorm veranderingen in de milliseconde tot seconde met gebruikmaking van het cytoskelet reorganisatie ^{2, 3.} OHC buigen wordt geassocieerd met electromotility, en het resultaat ofwel van een asymmetrische verdeling van de motor-eiwitten in de laterale plasmamembraan, of asymmetrische elektrische stimulatie van de motorische eiwitten (bijvoorbeeld met een elektrisch veld loodrecht op de lange as van de cellen) ^4. Mechanische en chemische prikkels veroorzaken in wezen langzaam beweeglijke reacties, ook al veranderingen in de ionische voorwaarden van de cellen en / of hun omgeving kunnen ook de plasmamembraan-embedded motoreiwitten ^{5, 6} stimuleren. Sinds OHC beweeglijk reacties zijn een essentieel onderdeel van de cochleaire versterker, de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van deze beweeglijke reacties op akoestische frequenties (ruwweg van 20 Hz tot 20 kHz bij de mens) is een zeer belangrijke zaak op het gebied van het gehoor onderzoek ^7.

De ontwikkeling van nieuwe imaging technologie combineert high-speed videocamera's, LED-verlichting op basis van systemen, en geavanceerde beeldanalyse-software biedt nu de mogelijkheid om een ​​betrouwbare kwalitatieve en kwantitatieve studies van de beweeglijke reactie van geïsoleerde OHCS uit te voeren om een ​​extern wisselend elektrisch veld (EAEF) ^8. Dit is een eenvoudige en niet-invasieve techniek die het grootste deel van de beperkingen van eerdere benaderingen ^9-11 omzeilt. Bovendien is de LED-verlichting op basis van systeem biedt extreme helderheid met een te verwaarlozen thermische effecten op de monsters en, als gevolg van het gebruik van video-microscopie, optische resolutie is minstens 10 maal hoger dan bij conventionele lichtmicroscopie technieken ^12. Bijvoorbeeld met de experimentele opstelling hier beschreven, kunnen veranderingen in cel lengte van ongeveer 20 nm routinematig en betrouwbaar gedetecteerd bij een frequentie van 10 kHz, en deze resolutie verder verbeterd kan worden bij lagere frequenties.

We zijn ervan overtuigd dat deze experimentele aanpak zal bijdragen aan ons begrip van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen OHC motiliteit uit te breiden.

Protocol

1. Isolatie van OHCS

1. Begin deze procedure door het oogsten van tijdelijke botten van cavia's, muizen of uw zoogdieren diermodel.
2. Open vervolgens de tijdelijke botten met behulp van een hamer tang om het slakkenhuis bloot te leggen, en dompel hen in Leibovitz L-15. Verwijder voorzichtig het bot teveel, waardoor de benige omhulsel intact. Overwegende dat dit een algemene procedure van toepassing is op tijdelijke beenderen van een zoogdiersoort, kunnen er kleine wijzigingen aan de techniek noodzakelijk zijn bij het omgaan met tijdelijke botten van een zeer kleine dieren. In het oude dieren is de bulla is meestal verkalkt, de invoering van een extra complicatie voor de procedure.
3. Onder microscopische observatie, de apicale regio van de cochlea open en verwijder stria vascularis en spiraal ligament met behulp van de punt van een # 11 scalpel, een micro-punt kiezen en een fijne pincet.
4. Neem het orgaan van Corti af van het cochleair modiolus met behulp van de pincet, en zet het in 1mg/ml collagenase in L-15 bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
5. Als OHCS van basale windingen van de cochlea nodig zijn, verwijdert u het benige omhulsel met betrekking tot de basis van het slakkenhuis met de pick, en apart de spiraal van de temporale bot met de scalpel voordat u het orgaan van Corti.
6. Overdracht het orgaan van Corti de opname kamer met behulp van een 50 ul Hamilton spuit. Daarna dissociëren cellen door reflux door de naald.

2. Experimentele opstelling

1. Schema van de externe Alternating elektrische veld (EAEF) generator en hun banden met het beeld vast te leggen systeem (afb. 1). De controle circuits is speciaal geïmplementeerd bij de Engineering Kern van het Huis Ear Institute.
2. De experimentele opstelling gebruikt worden in onze experimenten bestaat uit een Axiovert 135TV omgekeerde microscoop (Zeiss, Thornwood, NY) met een alternatief op basis van LED-verlichting systeem (High Power LED Systeem-36AD3500, Lightspeed Technologies, Campbell, CA), twee elektronische micromanipulators (Eppendorf "Patchman", Duitsland), een PC-gestuurde ultra-high speed Photron Fastcam X 1024 PCI-camera (Photron USA Inc) in de Keller-poort en een extra gewone CCD-camera in de trinoculaire haven. De Fastcam camera is in staat om beelden vast te leggen bij hoge frequenties (tot 100.000 beelden per seconde) en hoge resolutie (bijv. 1024 x 1024 pixels bij 1000 bps, 512 x 128 bij 10.000 fps, 384 x 96 op 18.000 fps, en ga zo maar door). De beelden die door de high-speed camera worden direct waargenomen in de PC-monitor, terwijl de CCD-camera is aangesloten op een andere monitor. De LED-verlichting op basis van het systeem werkt in twee verschillende modi: low-power analoge en digitale high-power. Alle voorbereidende procedures (elektroden positionering, cel positionering, focus, etc) worden uitgevoerd met behulp van de low-power analoge modus. De high-power verlichting wordt ingeschakeld door het diafragma van de camera sluiter en vervolgens uitgeschakeld door de sluiter, het vergemakkelijken van warmteafvoer. Zelfgemaakte software, ook ontwikkeld in de House Ear Institute techniek Core, die op dezelfde PC bestuurt de trekker van het high-speed camera, de LED-verlichting op basis van het systeem, en de EAEF. Een conventionele digitale foto camera aan de voorzijde poort zorgt voor nog frames nodig. (Afb. 2 A).
3. Elektroden (twee 0,25 mm-diameter Ag draden met de punt afstand van 0,8 mm) zijn gedreven om positie met behulp van een van de elektronische micromanipulators. Elektroden 'positie is visueel en door de microscopische afbeelding gecontroleerd; een verandering in het brandvlak van het beeld geeft aan dat de elektroden van de bodem van de experimentele kamer aangeraakt. In eerste instantie is het elektrische veld gekalibreerd met behulp van een externe elektrode. Deze elektrode meet de elektrische potentiaal op verschillende punten, het genereren van een "kaart" van het elektrische veld. Als een enkele geïsoleerde buitenste haarcel wordt geplaatst tussen de uiteinden van de elektroden met zijn lengteas parallel aan de toegepaste EAEF, zal verplaatsen verlengen en verkorten op dezelfde frequentie van het elektrische veld. Als de cel wordt loodrecht op het veld een ander type OHC respons (buigen) kunnen worden waargenomen en onderzocht. (Afb. 2 B)

3. EAEF stimulatie en beeld vast te leggen

1. Vier verschillende stimulatie protocollen selecteerbaar (afb. 3):
   1. continue enkele frequentie (afb. 3 A). Merk op dat stimulus-modus, frequentie, amplitude en golf type kan worden geselecteerd met de home-made control software (rode cirkels).
   2. barstte enkele frequentie (afb. 3 B). De lengte van de uitbarstingen en de kloof tussen barsten ook selecteren.
   3. lineaire sweep (afb. 3 C). De eerste en laatste frequenties worden geselecteerd.
   4. multi-stimulatie (afb. 3 D). Enkele frequentie en lineaire veegt kunnen worden gecombineerd in een enkel experiment. Na het selecteren van de bijbehorende parameters, de besturingssoftware configureert het systeem en kan de operator aan het licht-gesynchroniseerde video-opname en de cel stimulatie te starten door te klikken op een knop inhet computerscherm.
2. Beelden worden vastgelegd in AVI-formaat voor verdere analyse bij hoge frequenties.

4. Representatieve resultaten

1. In deze film, twee geïsoleerde buitenste haarcellen tonen de veranderingen in de lengte of kromming wanneer ze worden gestimuleerd met een externe Alternating elektrisch veld dat parallel of transversaal, respectievelijk, om hun lengteas. (Movie # 2).
2. OHCS beweeglijk reacties worden geanalyseerd off-line met behulp van ProAnalyst software (Xcitex Inc, Cambridge, MA). "Feature Tracking" functie in deze software zorgt voor de afstand tussen twee punten frame-by-frame (afb. 4). Tijdens de celdeling het verkorten van de afstand tussen de punten geselecteerd aan de top (cuticulair plaat, rode kleur) en de basis van de cel (Basaal paal, groen van kleur) is kleiner, en neemt toe met de celstrekking. De film toont de software de analyse van beeld-voor-beeld van de veranderingen in de lengte. Het paneel aan de onderkant van de afbeelding toont de sporen van de beweging. In dit voorbeeld, de totale verandering in de lengte is ongeveer 6,5 pixels.
3. "Contour Tracking" functie in ProAnalyst software kan detecteren cel rand en automatisch te meten op het gebied van de optische gedeelte (fig. 5).
4. Polystyreen microsferen toegevoegd aan het bad oplossing willekeurig en stevig hechten aan de plasmamembraan (Fig. 6 A). Verschillende microsferen kunnen gelijktijdig worden geselecteerd, en kan de software automatisch volgen ze allemaal frame per frame. Op deze manier kunnen de cellen worden onderverdeeld in secties en de beweeglijkheid van elke sectie afzonderlijk geëvalueerd. (Fig. 6 A)
5. Door het selecteren van microsferen gelegen aan de zijkanten van de cel beeld, veranderingen in de lengte van elk segment en de veranderingen in de hoek van een segment ten opzichte van andere (buiging) kan ook afzonderlijk worden geëvalueerd. (Fig. 6B)

Figuur 1. Schema van de EAEF generator en hun banden met het beeld vast te leggen systeem.

Figuur 2. A) Foto van de experimentele opstelling. B) Detail van de microscoop podium, met spotprenten van de elektroden en een OHC geplaatst tussen hen met zijn lengteas parallel aan het elektrisch veld.

Figuur 3. A) Gebruikersinterface van de zelfgemaakte control software geconfigureerd voor single-frequentie stimulatie. De geselecteerde parameters worden omcirkeld in het rood. B) Gebruikersinterface van de home-made besturingssoftware geconfigureerd voor burst single-frequentie stimulatie. C) Gebruikersinterface van de home-made besturingssoftware geconfigureerd voor lineaire sweep stimulatie. D) Gebruikersinterface van de zelfgemaakte control software geconfigureerd is voor multi-stimulatie.

Figuur 4. Single frame van een OHC met twee punten geselecteerd aan de basis (groen) en de apex (rood) van de cel, respectievelijk met de "Feature tracking" functie van de ProAnalyst software. De curve onder de cel geeft de periodieke veranderingen in de afstand tussen de geselecteerde punten in verband met elektrische stimulatie. Het verplaatsen van de verticale balk verschillende frames kunnen worden geselecteerd voor individuele analyse.

Figuur 5. De "Contour Tracking" functie in ProAnalyst detecteert de cel rand en automatisch te meten op het gebied van de optische sectie.

Figuur 6. A) Captured beeld van een geïsoleerde OHC versierd met polystyreen microsferen (boven), en hetzelfde beeld met vijf microsferen individueel geselecteerde (onder). Een andere kleur was toegewezen aan elke microsfeer, en hun verplaatsingen kunnen individueel en automatisch worden gevolgd frame voor frame, geanalyseerd en vergeleken. B) segmenten van willekeurige lengte kan worden gedefinieerd door het selecteren van polystyreen microsferen gelegen aan de rand van de cel, en veranderingen in de lengte van deze segmenten, alsmede veranderingen in de richting van een segment opzichte van anderen (cel buigen) kan automatisch worden geëvalueerd frame frame met de beeldanalyse-software.

Film 1. Isolatie van cavia OHCS. Klik hier om video te bekijken

Movie 2. OHCS parallel en loodrecht op de EAEF met typische electromotility en buigen van de reacties. Klik hier om video te bekijken

Discussion

De experimentele methode hier beschreven staat schatten OHC beweeglijk reacties in het kHz bereik zonder enige beperking om beweging van de cel. Verschillende stimulatie protocollen, extra markers (microbolletjes), maar ook veranderingen in de oriëntatie van de cel met betrekking tot het elektrische veld, maken het mogelijk om nieuwe aspecten van de OHC beweeglijkheid onderzocht met een niveau van detail voorheen ontoegankelijk. Andere methoden, bijvoorbeeld die met behulp van fotodiodes ⁹ of laser Doppler vibrometry ^10, vereisen een strenge controle van de positie van de cel. Hier, daarentegen, worden alle metingen tussen de punten die behoren tot dezelfde cel, en elke verplaatsing wordt alleen geassocieerd met veranderingen in cel vorm en niet met hun beweging ten opzichte van een extern referentiekader. Betrouwbare metingen van cross-sectional OHC gebied zijn ook gemakkelijk te verkrijgen, die het mogelijk maakt een schatting van de snelle veranderingen in de OHC volume. Daarnaast is de voortdurende ontwikkeling van snellere en meer gevoelige camera's en betere software voor beeldanalyse, staan ​​garant voor een continue verbetering van de kwaliteit van de methode. Een nadeel van de techniek, geen controle op de elektrische potentieel in de plasmamembraan, is een beperking gedeeld met alle huidige methoden die worden gebruikt om OHC motiliteit evalueren in het kHz bereik.

Zo zou de methode die hier beschreven worden een belangrijk instrument voor het horen van onderzoek, in staat om nieuwe en belangrijke aanwijzingen over de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan beweeglijke reacties OHCS '

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15	GIBCO, by Life Technologies	21083
Collagenase (Type 4)	Sigma-Aldrich	C5138	1mg/mL in L-15