Summary
Un método fiable para investigar células ciliadas externas (OHC) las respuestas de móviles, incluyendo electromotility, motilidad lenta y flexión, se describe. Motilidad OHC es provocado por la estimulación con un campo externo eléctrica alterna, y el método tiene la ventaja de la grabación de imágenes a alta velocidad, la iluminación basada en LED, y el software de última generación de imágenes de análisis.
Abstract
OHCS son cilíndricas células sensoriomotora situado en el órgano de Corti, el órgano de la audición en el oído interno de mamíferos. El nombre de "células ciliadas" deriva de su paquete de características apical de los estereocilios, un elemento crítico para la detección y transducción de energía de sonido 1. OHCS son capaces de cambiar de forma alargada, se acortan y doblar-en respuesta a la estimulación eléctrica, mecánica y química, una respuesta motora se considera crucial para la amplificación de las señales acústicas coclear 2.
Estimulación induce OHC dos respuestas diferentes móviles: i) electromotility, la motilidad rápida aka, cambios en la longitud en el rango de microsegundos derivados de propulsión eléctrica, cambios conformacionales en proteínas motoras densamente empaquetadas en OHC membrana plasmática, y ii) la motilidad lenta, los cambios de forma en el milisegundos a segundos amplia participación de la reorganización del citoesqueleto 2, 3. OHC flexión se asocia con electromotility, y el resultado tanto de una distribución asimétrica de proteínas motoras en la membrana plasmática lateral, o la estimulación eléctrica asimétrica de las proteínas de motor (por ejemplo, con un campo eléctrico perpendicular al eje longitudinal de las células) 4. Estímulos mecánicos y químicos inducen respuestas móviles esencialmente lenta, a pesar de los cambios en las condiciones iónicas de las células y / o su entorno también puede estimular la membrana plasmática incrustado proteínas motoras 5, 6. Dado que las respuestas OHC móviles son un componente esencial del amplificador coclear, el análisis cualitativo y cuantitativo de esas respuestas en las frecuencias acústicas móviles (aproximadamente desde 20 Hz a 20 kHz en los seres humanos) es un asunto muy importante en el campo de la audición de investigación 7.
El desarrollo de nueva tecnología de imágenes que combina alta velocidad de cámaras de video, los sistemas de LEDs de iluminación, y un sofisticado software de análisis de imagen ofrece ahora la posibilidad de realizar estudios cualitativos y cuantitativos fiables de la respuesta de los móviles OHCS aislado a un campo externo eléctrica alterna (EAEF) 8. Esta es una técnica sencilla y no invasiva que evita la mayor parte de las limitaciones de los enfoques anteriores 9-11. Por otra parte, el sistema de iluminación basados en LED proporciona brillo extremo con insignificantes los efectos térmicos de las muestras y, debido a la utilización de la microscopía de vídeo, resolución óptica es de al menos 10 veces mayor que con las técnicas convencionales de microscopía de luz 12. Por ejemplo, con el montaje experimental se describe aquí, los cambios en la longitud de la célula de alrededor de 20 nm puede ser rutinaria y detectar con seguridad en las frecuencias de 10 kHz, y esta resolución puede mejorarse aún más en las frecuencias más bajas.
Estamos seguros de que este enfoque experimental ayudará a ampliar nuestra comprensión de los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la motilidad OHC.
Protocol
1. El aislamiento de OHCS
- Iniciar este procedimiento por la extracción de los huesos temporales cobayas, ratones o su modelo de mamíferos.
- A continuación, abra los huesos temporales utilizando una pinza de martillo con el fin de exponer a la cóclea, y sumérgelas en Leibovitz L-15. Eliminar el exceso de hueso con cuidado, manteniendo la cubierta ósea intacta. Considerando que este es un procedimiento general aplicable a los huesos temporales de otras especies de mamíferos, pequeños cambios en la técnica puede ser necesaria cuando se trata de huesos temporales de animales muy pequeños. En los animales viejos de la bulla es generalmente calcificadas, la introducción de una complicación adicional para el procedimiento.
- Bajo observación microscópica, abra la región apical de la cóclea y eliminar estría vascular y el ligamento espiral con la punta de una hoja de bisturí # 11, un punto de recogida micro y una pinza fina.
- Tome el órgano de Corti fuera del modiolo coclear con la pinza, y lo puso en la colagenasa 1mg/ml en L-15 a temperatura ambiente durante 5 min.
- Si OHCS de vueltas basal de la cóclea se necesitan, retire la cubierta ósea que cubre la base de la cóclea con la selección, y separar el espiral del hueso temporal con el bisturí antes de retirar el órgano de Corti.
- Transferir el órgano de Corti a la cámara de grabación utilizando una jeringa de 50 l Hamilton. Después, se disocian las células por el reflujo a través de la aguja.
2. La instalación experimental
- Esquema de la alternancia de campo eléctrico externo (EAEF) del generador y su vinculación con el sistema de captura de la imagen (Fig. 1). El circuito de control se llevó a cabo especialmente en el Centro de Ingeniería de la House Ear Institute.
- El montaje experimental utilizado en nuestros experimentos se compone de un microscopio Axiovert 135TV invertido (Zeiss, Thornwood, NY) con un sistema de iluminación alternativo basado en LED (LED de alta potencia del sistema 36AD3500, Lightspeed Technologies, Campbell, CA), dos micromanipuladores electrónico (Eppendorf "PatchMan", Alemania), controlado por PC ultra-alta velocidad Photron FastCam X 1024 PCI cámara (Photron Inc. EE.UU.) en el puerto de Keller y una cámara CCD más regulares en el puerto trinocular. La cámara FastCam es capaz de captar imágenes a frecuencias altas (hasta 100.000 fps) y alta resolución (por ejemplo, 1024 x 1024 píxeles a 1000 fps, 512 x 128 a 10.000 fps, 384 x 96 a 18.000 fps, y así sucesivamente). Las imágenes proporcionadas por la cámara de alta velocidad son observadas directamente en el monitor del PC, mientras que la cámara CCD está conectada a un monitor diferente. El sistema de iluminación LED, trabaja en dos modos distintos: analógico de baja potencia y alta potencia digital. Todos los procedimientos preliminares (colocación de electrodos, la colocación de células, el enfoque, etc) se realizan utilizando el modo analógico de baja potencia. La iluminación de alta potencia se activa por la apertura del obturador de la cámara y luego apagado por el cierre del obturador, lo que facilita la disipación del calor. Software casero, también desarrollado en la Casa central del oído Instituto de Ingeniería, que se ejecutan en el mismo PC controla el disparador de la cámara de alta velocidad, el sistema de iluminación basados en LED, y la EAEF. Una cámara de fotos digital convencional en el puerto frontal permite imágenes fijas como sea necesario. (Fig. 2 A).
- Electrodos (dos 0,25 mm de diámetro con una distancia de los cables de Ag punta de 0,8 mm) se ven obligados a utilizar la posición de uno de los micromanipuladores electrónico. Posición de los electrodos es monitoreado de forma visual ya través de la imagen microscópica, un cambio en el plano focal de la imagen indica que los electrodos tocó el fondo de la cámara experimental. Inicialmente, el campo eléctrico se calibra con un electrodo externo. Este electrodo mide el potencial eléctrico en diferentes puntos, lo que genera un "mapa" del campo eléctrico. Si una sola célula aislada ciliadas externas se coloca entre las puntas de los electrodos con su eje longitudinal paralelo a la EAEF aplicada, se moverá alargar y acortar a la misma frecuencia del campo eléctrico. Si la célula se coloca perpendicular al campo un tipo diferente de respuesta OHC (flexión) puede ser observado e investigado. (Fig. 2 B)
3. EAEF la estimulación y la captura de imágenes
- Cuatro protocolos de estimulación se pueden seleccionar diferentes (Fig. 3):
- continua de frecuencia única (Fig. 3 A). Tenga en cuenta que el tipo de modo de estímulo, frecuencia, amplitud de onda y se pueden seleccionar con el hecho en casa de software de control (círculos rojos).
- frecuencia irrumpió sola (Fig. 3 B). La longitud de las ráfagas y las diferencias entre estalló también seleccionables.
- barrido lineal (Fig. 3 C). Las frecuencias iniciales y finales son seleccionables.
- multi-estimulación (Fig. 3 D). Una sola frecuencia y barridos lineales se pueden combinar en un solo experimento. Después de seleccionar los parámetros correspondientes, el software de control se configura el sistema y permite al operador para iniciar la luz la grabación sincronizada de vídeo y la estimulación de células haciendo clic en un botón enla pantalla del ordenador.
- Las imágenes se capturan en formato AVI para su posterior análisis en las frecuencias altas.
4. Resultados representante
- En esta película, dos células ciliadas externas aisladas muestran cambios en la longitud o la curvatura cuando son estimulados con un campo externo eléctrica alterna que es paralela o transversal, respectivamente, a su eje longitudinal. (Película # 2).
- Respuestas OHCS móviles son analizadas off-line mediante el software ProAnalyst (Xcitex Inc., Cambridge, MA). "Característica de seguimiento" en función de este software proporciona la distancia entre dos puntos de cuadro por cuadro (Fig. 4). Durante celular acortando la distancia entre los puntos seleccionados en el vértice (placa cuticular, color rojo) y la base de la célula (polo basal, de color verde) es más pequeño, y aumenta con la elongación celular. La película muestra el software de análisis cuadro por cuadro los cambios en la longitud. El panel en la parte inferior de la imagen muestra la huella del movimiento. En este ejemplo, el cambio total de longitud es de 6,5 píxeles.
- "Adaptación al suelo" en función de software ProAnalyst puede detectar automáticamente borde de la celda y medir el área de la sección óptica (Fig. 5).
- Microesferas de poliestireno a la solución de baño de forma aleatoria y firmemente se adhieren a la membrana plasmática (Fig. 6 A). Diferentes microesferas se pueden seleccionar de forma simultánea y automáticamente el software puede rastrear todos ellos fotograma a fotograma. De esta manera, las células se pueden dividir en secciones y la motilidad de cada sección evaluada de forma independiente. (Fig. 6 A)
- Mediante la selección de las microesferas se encuentra en los bordes laterales de la imagen de la célula, los cambios en la longitud de cada segmento y los cambios en el ángulo del respeto de un segmento a otro (flexión) también puede ser evaluado independientemente. (Fig. 6B)
Figura 1. Diagrama del generador EAEF y sus vínculos con el sistema de captura de imágenes.
Figura 2. A) Imagen de la instalación experimental. B) Detalle de la platina del microscopio, con caricaturas de los electrodos y una sola OHC colocado entre ellos, con su eje longitudinal paralelo al campo eléctrico.
Figura 3. Una interfaz de usuario) del software de control de fabricación casera configurado para una sola frecuencia de estimulación. Los parámetros seleccionados son un círculo rojo. B) La interfaz de usuario de la fabricación casera de software de control configurado para la estimulación del estallido de una sola frecuencia. C) Interfaz de usuario de la fabricación casera de software de control configurado para la estimulación de barrido lineal. D) Interfaz de usuario del software de control de fabricación casera configurada para multi-estimulación.
Figura 4. Fotograma de una OHC con dos puntos seleccionados en la base (verde) y el vértice (rojo) de la célula, respectivamente, utilizando la "función de seguimiento de" la función del software ProAnalyst. La curva debajo de la celda muestra los cambios periódicos en la distancia entre los puntos seleccionados relacionados con la estimulación eléctrica. Traslado de la barra de diferentes marcos verticales pueden ser seleccionados para el análisis individual.
Figura 5. La "adaptación al suelo" en función de ProAnalyst detecta el borde de la celda y automáticamente medir el área de la sección óptica.
Figura 6. Una imagen) capturados de una OHC aislados decorado con microesferas de poliestireno (arriba), y la misma imagen con cinco microesferas seleccionadas individualmente (abajo). Un color se le asignó a cada microesfera, y sus desplazamientos pueden ser individualmente y de forma automática el marco seguimiento por imagen, analizadas y comparadas. B) Los segmentos de longitud arbitraria se puede definir mediante la selección de microesferas de poliestireno se encuentra en los bordes de la celda, y los cambios en la longitud de estos segmentos, así como cambios en la orientación de un segmento respecto a los demás (células de flexión) puede ser evaluado de forma automática el marco de marco con el software de análisis de imagen.
Movie 1. Aislamiento de Indias OHCS cerdo. Haga clic aquí para ver el video
Movie 2. OHCS paralela y perpendicular a la EAEF mostrando electromotility típicas y las respuestas de flexión. Haga clic aquí para ver el video
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Discussion
El método experimental que aquí se presenta permite estimar las respuestas OHC móviles en el rango de kHz sin ningún tipo de restricción al movimiento de la célula. Diferentes protocolos de estimulación, marcadores adicionales (microesferas), así como los cambios en la orientación de la celda con respecto al campo eléctrico, hacen que sea posible investigar nuevos aspectos de la motilidad OHC con un nivel de detalle que antes eran inaccesibles. Otros métodos, como por ejemplo los que utilizan fotodiodos 9 o láser Doppler vibrometría 10, requieren de un estricto control de la posición de la celda. Aquí, en cambio, todas las mediciones se llevan a cabo entre los puntos pertenecientes a la misma celda, y todos los desplazamientos sólo se asocia con cambios en la forma de la célula y no con su movimiento con respecto a un marco de referencia externo. Mediciones fiables de la sección transversal OHC son también fáciles de obtener, lo que permite una estimación de los cambios rápidos en el volumen de COH. Además, el continuo desarrollo de las cámaras más rápido y más sensible y mejor software de análisis de imagen, garantizar una mejora continua en la calidad del método. Una desventaja de la técnica, no hay control sobre el potencial eléctrico a través de la membrana plasmática, es una limitación compartida con todos los métodos actuales utilizados para evaluar la motilidad OHC en el rango de kHz.
Por lo tanto, el método descrito aquí puede ser una herramienta importante para la audiencia de investigación, capaces de proporcionar nuevas pistas e importantes sobre los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a las respuestas de móviles OHCS '
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El trabajo apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 de investigación principal, y las IES. Su contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representan necesariamente la posición oficial del NIH o instituciones de educación superior. Los autores declaran no tener ningún conflicto existentes o potenciales de interés.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 | GIBCO, by Life Technologies | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
References
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