חקירות תנועתיות החיצונית Cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה

Summary

שיטה אמינה לחקור תא השיער החיצוניים (OHC) תגובות ניעתי, כולל electromotility, תנועתיות איטית כיפוף, הוא תיאר. תנועתיות OHC הוא שהושרו על ידי גירוי חיצוני עם שדה חשמלי לסירוגין, ואת השיטה מנצלת את הקלטת במהירות גבוהה התמונה, מבוססי LED תאורה, הדור האחרון התמונה תוכנת ניתוח.

Abstract

OHCs הם גלילי תאים הסנסורית ממוקם האיבר של קורטי, איבר השמיעה בתוך האוזן הפנימית יונקים. השם "תאים שיער" נובעת צרור apical האופיינית שלהם stereocilia, אלמנט קריטי עבור איתור התמרה של אנרגיה צליל ^1. OHCs מסוגלים לשנות צורה, להאריך, לקצר, לכופף בתגובה גירוי חשמלי, מכני כימי, תגובת המנוע נחשב חיוני שבלול הגברה של אותות אקוסטיים ^2.

הגירוי גורם OHC ניעתי שתי תגובות שונות: i) electromotility, תנועתיות מהירה aka, שינויים באורך בטווח המיקרו נגזר חשמלית המונעת שינויים קונפורמציה בחלבונים מנוע בצפיפות בקרום פלזמה OHC, ו ב) תנועתיות איטית, משנה את צורתו ב אלפית שנייה כדי שניות טווח מעורבים מחדש cytoskeletal ^{2, 3.} OHC כיפוף קשורה electromotility, והתוצאה גם מהפצת אסימטרית של חלבונים מנוע בקרום פלזמה לרוחב, או גירוי חשמלי אסימטרית של חלבונים אלה המנוע (למשל, עם שדה חשמלי הניצב לציר הארוך של התאים) ^4. גירויים מכניים וכימיים לעורר תגובות ניעתי איטי בעיקרו, למרות שינויים בתנאי יוניים של תאים ו / או בסביבה שלהם יכול גם לעורר את הפלזמה קרום מוטבע מנוע חלבונים ^{5, 6.} מאז התגובות OHC ניעתי הם מרכיב חיוני של המגבר שבלול, ניתוח איכותי וכמותי של התגובות הללו ניעתי בתדרים אקוסטי (בערך מ - הרץ 20-20 קילוהרץ בבני אדם) היא עניין חשוב מאוד בתחום של שמיעה המחקר ^7.

הפיתוח של טכנולוגיית הדמיה חדש המשלב מהירות גבוהה במצלמות וידאו, מערכות מבוססות LED תאורה, תוכנה מתוחכמת ניתוח התמונה עכשיו מספק את היכולת לבצע איכותי ואמין מחקרים כמותיים התגובה ניעתי של OHCs מבודד לשדה חשמלי חיצוני לסירוגין (EAEF) ^8. זוהי טכניקה פשוטה ולא פולשנית אשר עוקף את רוב המגבלות של הגישות הקודמות ^9-11. יתר על כן, מערכת תאורה מבוססי LED מספק בהירות קיצוני עם אפקטים תרמיים מבוטל על דגימות, ובשל השימוש במיקרוסקופ וידאו, רזולוציה אופטית הוא לפחות פי 10 יותר מאשר עם טכניקות קונבנציונאלי מיקרוסקופ אור ^12. למשל, עם הגדרת הניסוי המתואר כאן, שינוי אורך התא של כ -20 ננומטר יכול להיות שגרתי זוהה באופן מהימן בתדירויות של 10 קילוהרץ, ועל החלטה זו ניתן לשפר עוד יותר בתדרים נמוכים.

אנו בטוחים כי זו גישה ניסויית יסייע להרחיב את הבנתנו את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הסלולר תנועתיות OHC.

Protocol

1. בידוד של OHCs

1. בגין הליך זה על ידי קצירת עצמות הזמני של שרקנים, עכברים או מודל בבעלי חיים יונקים שלך.
2. לאחר מכן, לפתוח את עצמות הזמני באמצעות ניפר המכשפות על מנת לחשוף את השבלול, וכן לטבול אותם ליבוביץ L-15. הסרת עודף עצם בזהירות, תוך שמירה על מעטפת גרמית ללא פגע. בעוד שמדובר בהליך הכללי החלים על עצמות הזמני של כל מיני יונקים, שינויים קלים הטכניקה ייתכן שיהיה צורך בהתמודדות עם עצמות הזמני מבעלי חיים קטנים מאוד. אצל בעלי חיים בן בולה הוא מסויד בדרך כלל, מציגה סיבוך נוסף להליך.
3. תחת תצפית Microscopical, לפתוח את האזור apical של שבלול ולהסיר vascularis stria והרצועות ספירלה באמצעות קצה של להב # 11 אזמל, נקודת מיקרו לקטוף פינצטה בסדר.
4. קח את איבר קורטי מן כישור שבלול באמצעות פינצטה, ושמתי אותו collagenase 1mg/ml ב-L-15 בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
5. אם OHCs מתוך הופך הבסיס של שבלול יש צורך, להסיר את הקליפה גרמית המכסה את הבסיס של שבלול עם לבחור את, ולהפריד את הספירלה של העצם הטמפורלית באמצעות להב סכין המנתחים לפני הסרת איברים של קורטי.
6. העברת איברים של קורטי לתא הקלטה באמצעות מזרק 50 μL המילטון. לאחר מכן לנתק את התאים על ידי ריפלוקס דרך המחט.

2. ניסיוני ההתקנה

1. תרשים של גנרטור חשמלי חיצוני לסירוגין שדה (EAEF) ואת הקישורים שלהם עם מערכת ללכוד תמונה (איור 1). מעגלי הבקרה בוצעה במיוחד בבסיס הנדסה של האוזן בית המכון.
2. הגדרת הניסוי נעשה שימוש בניסויים שלנו מורכב מיקרוסקופ Axiovert הפוכה 135TV (Zeiss, Thornwood, ניו יורק) עם מערכת מבוססי LED חלופה תאורה (הספק גבוה LED System-36AD3500, לייטספיד טכנולוגיות, קמפבל, CA), שני micromanipulators אלקטרוניים (Eppendorf "Patchman", גרמניה), מחשב שבשליטת גבוהה במיוחד מהירות Photron Fastcam X 1024 PCI המצלמה (Photron ארה"ב Inc) בנמל קלר מצלמת CCD נוסף קבוע בנמל trinocular. המצלמה Fastcam מסוגל ללכוד תמונות בתדרים גבוהים (עד 100.000 fps) ברזולוציה גבוהה (למשל, 1024 x 1024 פיקסלים על 1000 fps, 512 x 128 ב 10,000 fps, 384 x 96 ב 18,000 fps, וכן הלאה). התמונות שמספקת המצלמה במהירות גבוהה הם נצפו ישירות לצג המחשב, בעוד מצלמה CCD מחובר צג שונים. מערכת תאורה מבוססי LED עובד בשני מצבים שונים: צריכת חשמל נמוכה אנלוגי הספק גבוה דיגיטלית. כל הנהלים ראשוני (מיקום האלקטרודות, מיקום התא, פוקוס, וכו ') מבוצעים באמצעות מצב צריכת חשמל נמוכה אנלוגי. תאורה כוח גבוהה מופעל על ידי הצמצם של תריס המצלמה ואז כיבה ידי סגירת תריס, בהנחיית פיזור חום. תוכנה תוצרת בית, שפותחה גם על האוזן Core בית הנדסה המכון, פועל על אותו המחשב שולט על ההדק של המצלמה במהירות גבוהה, מערכת תאורה מבוססי LED, ואת EAEF. מצלמה קונבנציונאלי תמונה דיגיטלית בנמל מול מאפשר עדיין מסגרות לפי הצורך. (איור 2).
3. אלקטרודות (שני 0.25 מ"מ בקוטר החוטים Ag עם המרחק קצה 0.8 מ"מ) מונעים לתפקיד באחת micromanipulators אלקטרוניים. עמדת אלקטרודות מנוטר ויזואלית באמצעות תמונה מיקרוסקופית, שינוי במישור המוקד של התמונה עולה כי האלקטרודות נגע בתחתית תא הניסוי. בתחילה, השדה החשמלי הוא מכויל באמצעות אלקטרודה חיצונית. אלקטרודה זו מודדת את הפוטנציאל החשמלי בנקודות שונות, יצירת "מפה" של שדה חשמלי. אם תא בודד ומבודד השיער החיצוני ממוקם בין קצות האלקטרודות עם מקביל לציר האורך שלה EAEF מיושם, זה יהיה מהלך מתארך וקיצור באותה התדירות של השדה החשמלי. אם התא ממוקם בניצב לשדה מסוג אחר OHC תגובה (כיפוף) ניתן להבחין וחקר. (איור 2 ב ')

3. EAEF גירויים לכידת תמונה

1. ארבעה פרוטוקולים גירוי שונים לבחירה (איור 3):
   1. תדר אחד רציף (איור 3). שימו לב לסוג מצב גירוי, תדירות, משרעת הגל ניתן לבחור באמצעות תוצרת בית תוכנה מלאה (עיגולים אדומים).
   2. תדר בודד bursted (איור 3 ב). אורכו של התפרצויות הפערים בין פרץ גם הם לבחירה.
   3. לטאטא ליניארי (איור 3 ג). תדרים התחלתי וסופי הם לבחירה.
   4. רב גירוי (איור 3 ד '). תדר יחיד וסוחף ליניארי ניתן לשלב בניסוי יחיד. לאחר בחירת הפרמטרים המתאימים, תוכנת בקרת התצורה של המערכת מאפשרת למפעיל ליזום אור מסונכרן הקלטת וידאו גירוי התא ידי לחיצה על לחצן יחידאת מסך המחשב.
2. תמונות נלכדים בפורמט AVI לניתוח נוסף בתדרים גבוהים.

4. נציג תוצאות

1. בסרט זה, שני תאים מבודדים השיער החיצונית להראות שינויים באורך או עקמומיות כאשר הם מקבלים גירוי חיצוני עם שדה חשמלי לסירוגין כי הוא מקביל או משוכל, בהתאמה, על ציר האורך שלהם. (סרט # 2).
2. התגובות OHCs ניעתי מנותחים off-line באמצעות תוכנת ProAnalyst (Xcitex Inc, Cambridge, MA). "מעקב תכונה" לתפקד תוכנה זו מספקת את המרחק בין שתי נקודות מסגרת לפי מסגרת (איור 4). במהלך תא לקצר את המרחק בין נקודות שנבחרו (צלחת Cuticular; צבע אדום) שיא ובסיס של התא (מוט בסל; צבע ירוק) הוא קטן יותר, עולה עם התארכות התא. הסרט מראה את תוכנת ניתוח מסגרת לפי מסגרת השינויים באורך. הפאנל בתחתית התמונה מראה את עקבות של התנועה. בדוגמה זו, הכוללת את השינוי באורך כ 6.5 פיקסלים.
3. "קונטור מעקב" פונקציה בתוכנה ProAnalyst יכול לזהות קצה סלולריים באופן אוטומטי למדוד את השטח של החלק האופטי (איור 5).
4. פוליסטירן microspheres הוסיף לפתרון אמבטיה באקראי בתוקף לצרף הממברנה פלזמה (איור 6). Microspheres שונים ניתן לבחור בו זמנית, התוכנה יכולה לעקוב באופן אוטומטי אחר כל אחד מהם תמונה אחר תמונה. בדרך זו, התאים מתחלקים בחלקים ועל תנועתיות של כל מקטע הוערכו באופן עצמאי. (איור 6)
5. על ידי בחירה microspheres ממוקמת בשולי התמונה לרוחב של התא, שינויים באורך של כל פלח ושינוי זווית של כבוד קטע אחד על השני (כיפוף) יכול גם להעריך באופן עצמאי. (איור 6 ב)

איור 1. דיאגרמה של הגנרטור EAEF ואת הקישורים שלהם עם מערכת לכידת תמונה.

2. איור תמונה) של הגדרת הניסוי. ב) פירוט של השלב מיקרוסקופ, עם הקריקטורות האלקטרודות לבין OHC יחיד להציב ביניהם עם ציר האורך שלו מקביל לשדה החשמלי.

איור 3. ממשק המשתמש) של התוכנה לשלוט תוצרת בית מוגדר גירוי יחיד בתדר. הפרמטרים שנבחרו בעיגול אדום. ב) ממשק המשתמש של התוכנה תוצרת בית שליטה מוגדר גירוי פרץ יחיד בתדר. ג) ממשק משתמש של תוכנה תוצרת בית שליטה מוגדרת לגירוי לטאטא לינארי. ד) ממשק משתמש של התוכנה לשלוט תוצרת בית מוגדר גירוי רב.

איור 4. בודד של OHC עם שתי נקודות שנבחר בבסיס (ירוק) לבין איפקס (אדום) של התא, בהתאמה, באמצעות "מעקב תכונה" פונקציה של התוכנה ProAnalyst. עקומת מתחת לתא מראה את השינויים התקופתיים של המרחק בין נקודות נבחרים הקשורים גירוי חשמלי. הזזת פס אנכי מסגרות שונות ניתן לבחור לניתוח בודדים.

איור 5. "מעקב קונטור" לתפקד ProAnalyst מזהה את קצה סלולריים באופן אוטומטי למדוד את השטח של החלק האופטי.

איור 6. Image) של שבויים OHC מבודדים מעוטרים פוליסטירן microspheres (למעלה), ואת אותה התמונה עם חמישה microspheres נבחרים בנפרד (התחתון). צבע שונה הוצב microsphere כל אחד, התקות שלהם יכול להיות בנפרד באופן אוטומטי על ידי מעקב אחר מסגרת מסגרת, ניתחו והשוו. ב) קטעים באורך שרירותי ניתן להגדיר על ידי בחירת פוליסטירן microspheres ממוקם בשולי התא, שינויים באורך של מגזרים אלה, כמו גם שינויים בכיוון של כבוד קטע אחד לאחרים (תא כיפוף) ניתן להעריך באופן אוטומטי על ידי מסגרת מסגרת עם תוכנת עיבוד תמונה.

סרט 1. בידוד OHCs קביה. לחץ כאן כדי לצפות וידאו

סרט 2. OHCs מקבילים בניצב EAEF מראה אופייני electromotility ותגובות כיפוף. לחץ כאן כדי לצפות וידאו

Discussion

שיטת הניסוי המוצג כאן מאפשר לאמוד תגובות OHC ניעתי בטווח kHz ללא הגבלה כלשהי לתנועה של התא. פרוטוקולים שונים של גירוי, סמנים נוספים (microspheres), כמו גם שינויים בכיוון של התא ביחס השדה החשמלי, מאפשרים לחקור היבטים חדשים של תנועתיות OHC עם רמת הפירוט נגישים קודם לכן. שיטות אחרות, כגון אלו באמצעות photodiodes ⁹ או לייזר דופלר vibrometry ^10, דורשים פיקוח הדוק של העמדה של התא. כאן, לעומת זאת, כל המדידות מתבצעות בין נקודות השייכות באותו תא, וכל תזוזה קשור רק שינויים בצורת התא לא עם התנועה שלהם לגבי מסגרת חיצונית של הפניה. מדידות של אמינים באזור OHC חתך גם להשיג בקלות, אשר מאפשר הערכה של שינויים מהירים בהיקף OHC. בנוסף, פיתוח מתמשך של מצלמות מהר יותר רגיש וטוב תוכנת ניתוח התמונה, להבטיח שיפור מתמשך באיכות של השיטה. החיסרון של השיטה, אין שליטה על הפוטנציאל החשמלי על פני קרום פלסמה, הוא מגבלה משותפת עם כל השיטות הקיימות בשימוש כדי להעריך את תנועתיות OHC בטווח קילוהרץ.

לכן, השיטה המתוארת כאן עשויה להיות כלי חשוב במחקר שמיעה, מסוגל לספק רמזים חדשים וחשובים על המנגנונים המולקולריים שבבסיס הסלולר התגובות ניעתי "OHCs

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15	GIBCO, by Life Technologies	21083
Collagenase (Type 4)	Sigma-Aldrich	C5138	1mg/mL in L-15