Summary
Надежный метод для исследования внешней волосковых клеток (OHC) подвижных ответов, в том числе electromotility, медленный моторики и изгиб, описывается. OHC подвижность, вызванные стимуляцией с внешнего переменного электрического поля, и метод использует преимущества высокоскоростной записи изображения, светодиодной подсветки, а в прошлом поколении анализа изображений программное обеспечение.
Protocol
1. Выделение OHCs
- Начните эту процедуру уборки височных костей из морских свинок, мышей или вашей модели млекопитающих животных.
- Затем откройте височных костей использованием молоточек щипцы, чтобы разоблачить улитки, и погрузить их в Лейбовиц L-15. Удалить кости избыток аккуратно, сохраняя костлявая оболочка без изменений. Хотя это общая процедура применима к височных костей любых видов млекопитающих, незначительные изменения в технике может быть необходимо при работе с височных костей от очень маленьких животных. В старых животных булла, как правило, кальцинированная, представляя дополнительные сложности в процедуру.
- Под микроскопических наблюдений, открытые апикальной области улитки и снять полоску сосудистой и спиральные связки с помощью иглы № 11 лезвие скальпеля, микро точки забрать и штраф пинцет.
- Возьмите органа Корти от от кохлеарной Modiolus использованием пинцета, и положил его в 1mg/ml коллагеназы в L-15 при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Если OHCs от базальной оборотах улитки нужны, удалить костные оболочки покрытие основания улитки с выбором, и отдельные спирали от височной кости использованием лезвие скальпеля перед удалением органа Корти.
- Передача органа Корти к записи камеры использовании шприца 50 мкл Hamilton. После этого отделить клетки от рефлюкса через иглу.
2. Экспериментальная установка
- Схема внешнего переменного электрического поля (EAEF) генератора и их связи с системой захвата изображения (рис. 1). Схема управления была специально осуществляться на инженерно Ядро Дом уха института.
- Экспериментальная установка в наших экспериментах, состоит из Axiovert 135TV инвертированный микроскоп (Zeiss, Торнвуд, Нью-Йорк) с альтернативной светодиодной системы освещения (High Power LED System-36AD3500, Lightspeed Technologies, Кэмпбелл, штат Калифорния), два электронных микроманипуляторами (Eppendorf "Patchman", Германия), PC-контролируемое ультра-высокой скорости Photron FastCAM х 1024 PCI камеры (Photron США Inc) в Келлер порта и дополнительных регулярных ПЗС-камеры в тринокулярный порт. Камера FastCAM способен вести съемку на высоких частотах (до 100 000 кадров в секунду) и высоким разрешением (например, 1024 х 1024 пикселей на 1000 кадров в секунду, 512 х 128 на 10000 кадров в секунду, 384 х 96 на 18000 кадров в секунду, и так далее). Снимки предоставлены высокоскоростные камеры непосредственно наблюдаемых в монитор компьютера, в то время как ПЗС-камера подключается к другой монитор. Светодиодной подсветкой Система работает в двух различных режимах: маломощных аналоговых и мощные цифровые. Все предварительные процедуры (электроды позиционирования, сотовые позиционирования, фокус и т.д.) выполняются с помощью маломощного аналоговом режиме. Мощных освещение включается отверстие затвора камеры, а затем выключить на закрытие затвора, что облегчает отвод тепла. Домашнее программное обеспечение, также разработанная в Доме уха Основные института машиностроения, работающих на одном компьютере управления курок высокоскоростной камерой, светодиодной системы освещения, а EAEF. Обычный цифровой фотоаппарат в передний порт позволяет кадры по мере необходимости. (Рис. 2).
- Электроды (два 0,25 мм в диаметре Ag провода с наконечником расстояние 0,8 мм) приводятся в положение, используя один из электронных микроманипуляторами. Положение электродов контролируется визуально, так и через микроскопические изображения, изменения в фокальной плоскости изображение показывает, что электроды коснулся нижней части экспериментальной камеры. Первоначально, электрическое поле калибруется с помощью внешнего электрода. Этот электрод меры электрического потенциала в различных точках, создавая "карту" электрического поля. Если одной изолированной внешней волосковых клеток помещается между концами электродов с его продольной осью параллельно применяются EAEF, она будет двигаться удлинения и сокращения на той же частоте электрического поля. Если ячейка находится перпендикулярно к полю другого типа OHC ответа (изгиб) можно наблюдать и исследовать. (Рис. 2 Б)
3. EAEF стимуляции и захват изображения
- Четыре различных протоколов стимуляции выбор (рис. 3):
- непрерывный одной частоте (рис. 3). Обратите внимание, что стимулом режим, частота, амплитуда и волны типа могут быть выбраны с помощью самодельного программного обеспечения управления (красные кружки).
- лопнула одной частоте (рис. 3 б). Длина очередей и разрывы между взрыв также выбрать.
- линейной развертки (рис. 3 C). Начальная и конечная частоты выбора.
- мульти-стимуляции (рис. 3 D). Одночастотный и линейной развертки могут быть объединены в одном эксперименте. После выбора соответствующих параметров, программное обеспечение управления настраивает систему и позволяет оператору инициировать световых синхронизирована запись видео-и стимуляции клеток, нажав одну кнопку вэкране компьютера.
- Изображения захватываются в формате AVI для дальнейшего анализа на высоких частотах.
4. Представитель Результаты
- В этом фильме две изолированные внешние волосковые клетки показать изменения в длину и кривизну, когда они стимулируются с внешнего переменного электрического поля, параллельный или поперечный, соответственно, к их продольной оси. (Видео # 2).
- OHCs подвижных ответы анализируются автономном использовании ProAnalyst программное обеспечение (Xcitex Inc, Кембридж, Массачусетс). "Функция отслеживания" функции в этом программное обеспечение обеспечивает расстояние между двумя точками кадр за кадром (рис. 4). В ячейке сокращения расстояния между точками, выбранными на вершине (кутикулы пластины; красный цвет) и база ячейки (базальной полюса; зеленого цвета) меньше, и увеличивается с сотовыми удлинения. В фильме показана программное обеспечение анализа кадр за кадром изменения в длине. Панели в нижней части изображения показывает следы движения. В этом примере общее изменение в длину около 6,5 пикселей.
- "Контур слежения" функции в ProAnalyst программное обеспечение способно обнаружить края ячейки и автоматически измерить площадь оптического сечения (рис. 5).
- Полистирол микросферы добавить в ванну решение случайным и прочно прикрепить к плазматической мембране (рис. 6). Различные микросферы могут быть выбраны одновременно, и программное обеспечение может автоматически отслеживать все их кадр за кадром. Таким образом, клетки могут быть разделены на разделы и подвижность каждого раздела оценивается независимо друг от друга. (Рис. 6)
- Выбрав микросферы расположены на боковых краев изображения клетки, изменения в длину каждого сегмента и изменением угла из одного сегмента в отношении других (изгиб) может быть также проведена независимая оценка. (Рис. 6Б)
Рисунок 1. Схема генератора EAEF и их связи с системой захвата изображения.
Рисунок 2.) Изображение экспериментальной установки. Б) Деталь столике микроскопа, с карикатур электродами и одним верхним распределительным валом помещен между ними с его продольной осью, параллельной электрического поля.
Рисунок 3.) Пользовательский интерфейс домашнее программное обеспечение для управления настроен на одной частоте стимуляции. Выбранные параметры обведены красным цветом. Б) Пользовательский интерфейс самодельного программного обеспечения управления настроены на взрыв одночастотный стимуляции. С) Пользовательский интерфейс самодельного программного обеспечения управления настроена для линейных стимуляции развертки. D) Пользовательский интерфейс домашнее программное обеспечение для управления настроена для мульти-стимуляции.
Рисунок 4. Отдельный кадр OHC с двумя точками, выбранными на основании (зеленый) и вершины (красный) ячейки, соответственно, с использованием "Функция отслеживания" функции ProAnalyst программного обеспечения. Кривая ниже ячейка показывает периодические изменения расстояния между выбранными точками связаны с электрической стимуляции. Перемещение вертикальной чертой различных кадров могут быть выбраны для индивидуального анализа.
Рисунок 5. "Контур слежения" функции в ProAnalyst обнаруживает края ячейки и автоматически измерять области оптической части.
Рисунок 6.) Захваченные образ изолированного OHC украшены полистирола микросфер (вверху), и то же изображение с пятью микросферы индивидуально подобранных (внизу). Другой цвет был назначен в каждой микросферы, и их перемещений может быть индивидуально и автоматически отслеживаются кадр за кадром, анализируются и сравниваются. Б) Сегменты произвольной длины может быть определено путем выбора полистирола микросфер расположены по краям клетки, и изменения в длине этих сегментов, а также изменения в ориентации одного сегмента по отношению к другим (ячейка изгиба) может быть автоматически оценивается кадр рама с программного обеспечения для анализа изображений.
Фильм 1. Выделение морских OHCs свиньи. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео
Фильм 2. OHCs параллельно и перпендикулярно EAEF с типичными electromotility и изгиб ответов. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Экспериментальный метод, представленные здесь дает оценки OHC подвижных ответы в кГц без каких-либо ограничений на движение клетки. Различные протоколы стимуляции, дополнительных маркеров (микросферы), а также изменения в ориентации ячейки по отношению к электрическому полю, позволяют исследовать новые аспекты моторики OHC с уровнем детализации ранее недоступные. Другие методы, например, те, которые используют фотодиоды 9 или лазерного доплеровского виброметрии 10, требуют жесткого контроля положения клетки. Здесь, в отличие, все измерения проводятся между точками, принадлежащими к той же ячейке, и каждое перемещение связано только с изменением формы клеток, а не с их движением по отношению к внешней системе отсчета. Надежные измерения площади поперечного сечения OHC также легко получить, что позволяет быстро оценки изменения объема OHC. Кроме того, постоянное развитие быстрее и более чувствительные камеры и лучшего программного обеспечения для анализа изображений, гарантируют постоянное совершенствование качества метода. Недостаток техники, никакого контроля на электрический потенциал через плазматическую мембрану, это ограничение распространяется среди всех существующих методов, используемые для оценки OHC подвижность в кГц.
Таким образом, метод, описанный здесь, может быть важным инструментом для слуховых исследований, способных обеспечить новые и важные ключи к пониманию клеточных и молекулярных механизмов, лежащих OHCs 'подвижных ответы
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья Гранты R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 исследований Core, и вузов. Ее содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH или вуза. Авторы заявляют ни одна из существующих или потенциальных конфликтов интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 | GIBCO, by Life Technologies | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
References
- Frolenkov, G. I. Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).
- Ashmore, J. Cochlear outer hair cell motility. Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).
- Dallos, P., Fakler, B. Prestin, a new type of motor protein. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).
- Frolenkov, G. I. Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field. Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells. Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells. Hear Res. 208, 1-12 (2005).
- Ashmore, J.
- Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field. Hearing Research. , (2011).
- Dallos, P., Evans, B. N. High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum. Science. 268, 1420-1421 (1995).
- Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).
- Santos-Sacchi, J. On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter. J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).
- Inoué, S. Video Microscopy. , Plenum Press. New York. (1986).
