Summary
角膜是独特的，因为它没有血管组织。然而，强大的血管的生长和生存，可以在角膜上，通过强有力的血管生成因子诱导。因此，角膜可以与我们提供一个有价值的工具，对血管生成的研究。此协议演示了如何执行角膜口袋检测，以及如何评估使用这个模型的血管生成因子诱导的血管生成的小鼠模型。
Abstract
一个正常的角膜是明确的血管组织。然而，血管可诱发，在强有力的血管生成因子1的角膜成长和生存。这种独特的角膜口袋检测最常用的血管生成研究模型之一。角膜细胞组成的多层次。因此，可以嵌入颗粒含有的血管生成因子在角膜上，探讨其血管生成作用 2,3利益。在这里，我们提供了一步一步示范如何（一）产生血管生成因子含颗粒（二）嵌入到角膜颗粒（三）分析利益的血管生成因子诱导的血管生成。由于碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是已知的最有力的血管生成因子之一，它是用来诱发角膜新生血管形成。
Protocol
所有的设备和试剂使用无菌。批准该协议是由动物护理和使用聂/ NIH委员会（ACUC）（动物研究协议NEI - 553），并根据美国国立卫生研究院的准则和法规执行。
1。产生血管生成因子含有颗粒
在这一部分中，包含利益的血管生成因子的颗粒准备。
- 设为10％（W / V），硫糖铝，用PBS液。贮存在室温下。
- 设为12％（W / V）聚甲基丙烯酸羟乙酯用无水乙醇。贮存在室温下。
- 设为1μg/μL的碱性成纤维细胞生长因子的解决方案。储存在-80 ° C。
- 为了使50颗粒，混合聚甲基丙烯酸羟乙酯，5μL加入1μl硫糖铝，碱性成纤维细胞生长因子原液和4μL，涡旋彻底。
- 在培养皿中放置了一块干净的封口膜，暴露在紫外光下，在组织培养罩15分钟。拖放一个颗粒的封口膜0.2μL的溶液混合。因此，10μL混合液应产生50颗粒。让在室温下干燥1-2小时的颗粒。干燥后的颗粒可以保存在4℃数天，-80 ° C的几个月。
- 用法后，撬，拿起一双镊子提示颗粒。要格外小心，不要打破他们或使他们的春天离。
2。执行鼠标角膜口袋检测
在这一部分，我们将演示如何使一个在小鼠角膜的口袋里，和如何插入一个颗粒的口袋。颗粒中的血管生成因子将逐步释放到角膜周边地区（图1）。在这个演示中，我们使用8个星期的女性C57/Bl6小鼠。
- 鼠标深深系统与氯胺酮（75毫克/公斤）和甲苯噻嗪（经口5mg/kg，腹腔注射）的混合麻醉。这将保持30-60分钟麻醉状态下鼠标。局部麻醉剂（0.5％丙美卡因盐酸）适用于角膜。 5分钟后，一只眼睛在解剖显微镜下修复。
- 一个非常温和的削减是在角膜1.2 -1.4毫米冯格雷夫白内障刀角膜缘（如图1所示）中。要特别小心，不要穿过角膜。
- 一个口袋下的角膜上皮细胞层是由横向插入到中间的角膜刀，并延长刀对角膜缘仔细（图1）。口袋大小，大到足以容纳一个血管生成因子含有颗粒。要非常小心，不要通过角膜穿刺。
- 插入的钳入囊中慢慢对颗粒。尝试尽可能地使颗粒作为平。
- 颗粒植入后，外用眼科抗生素眼膏涂于眼。仪器与动物之间70％的酒精垫被消灭。
- 移动鼠标到一个温暖，干燥的地区，监视它，直到它能够保持直立的姿势，然后返回其家笼。全身性镇痛药（如丁丙诺啡，2毫克/公斤，腹腔注射）和外用抗生素软膏（如庆大霉素）2天，每天两次手术后，鼠标为3天密切监察。预计愈合手术后的最初48小时内完成。口袋里的眼睛，将审查下一个裂隙灯biomicro之间的颗粒植入后4-10天的范围。
3。代表性的成果
- 颗粒植入后7天，鼠标是全身麻醉和局部2.1中所述。
- 诱导的血管生成因子在解剖显微镜下观察角膜的血液船只。在与车辆治疗角膜，没有血管生长可观察到（图2A，车辆治疗角膜）。强大的血管生成与碱性成纤维细胞生长因子治疗角膜，可以看出（图2B）。血管生长，可以评估使用的最大长度（从正常的角膜缘船只的新船的顶部），血管和总血管领域（图2B，用红色虚线在碱性成纤维细胞生长因子的线划定治疗角膜）。其他定量方法也被描述2,5。
图1。一个正常的角膜H＆E染色。存在于正常的角膜无血管，B。请上皮下面的角膜，C层的口袋。装入口袋中嵌入一个颗粒，D 。血管生成因子被释放颗粒，正常的角膜缘血管生长新的血管。
5天之后，IM代表结果图2。种植沉淀。角膜与只包含车辆的颗粒。没有新的血液，在角膜血管的形成。只有预先存在的正常的角膜缘血管可见，B 。一个颗粒含碱性成纤维细胞生长因子与角膜。强大的新血管（点内衬）的增长从预先存在的正常的角膜缘血管。
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Discussion
鼠标角膜口袋检测模型是在1979年首次描述Muthukkaruppan VR和奥尔巴赫R 6。 2,3,7,8不同的实验室已经公布了详细的协议。我们的实验室已修改和 4多年来，在我们的研究使用这种方法。鼠标角膜口袋里的分析是一个很大的重复性相对简单的模型。这种模式的另一个优点是，由于角膜通常缺乏血管在这个实验中，有背景的最低金额。因此，这种模式通常用于研究不同的因素和分子的血管生成作用的领域。与一些较大的动物，如大鼠和家兔的眼睛相比，鼠标的眼睛较小，难以处理。在角膜的口袋里，插入沉淀的过程，尤其是在执行时，此模型中，因此，需要特别照顾。在精确控制的方式，以便它不会穿刺角膜刀必须处理。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们的研究是由美国国立卫生研究院，国家眼科研究所院内研究计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Slit lamp | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Table 1. Equipments | |||
| bFGF (basic fibroblast growth factor) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% in PBS |
| poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% in Ethanol |
| Table 2. Reagents and materials | |||
References
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R.
- Ziche, M.
- Ziche, M., Morbidelli, L.
