Summary
La cornée est unique en ce qu'il manque les tissus vasculaires. Cependant, une forte croissance des vaisseaux sanguins et la survie peut être induite dans la cornée par de puissants facteurs angiogéniques. Par conséquent, la cornée peut fournir avec nous un outil précieux pour les études de l'angiogenèse. Ce protocole montre comment effectuer le modèle de souris de dosage poche cornée et la façon d'évaluer l'angiogenèse induite par des facteurs angiogéniques en utilisant ce modèle.
Abstract
Une cornée normale est clair des tissus vasculaires. Toutefois, les vaisseaux sanguins peuvent être amenées à se développer et survivre dans la cornée lors de puissants facteurs angiogéniques sont administrés 1. Cette unicité a fait l'essai de la poche cornée l'un des modèles les plus utilisés pour les études de l'angiogenèse. La cornée compose de multiples couches de cellules. Il est donc possible d'intégrer un culot contenant le facteur angiogénique d'intérêt dans la cornée pour enquêter sur ses effets angiogéniques 2,3. Ici, nous offrons une démonstration étape par étape sur la manière de (I) produisent le facteur angiogénique granulés contenant (II) d'intégrer le culot dans la cornée (III) d'analyser l'angiogénèse induite par le facteur angiogénique d'intérêt. Depuis le facteur de croissance fibroblastique de base (bFGF) est connu comme l'un des facteurs les plus puissants angiogéniques 4, il est utilisé ici pour induire l'angiogenèse dans la cornée.
Protocol
Tous les équipements et les réactifs utilisés sont stériles. Le protocole a été approuvé par le soin des animaux et utilisation comité (ACUC) à l'IEN / NIH (protocole de l'étude des animaux IEN-553), et a été réalisée selon les directives du NIH et des règlements.
1. Produire de l'angiogenèse facteur contenant des pastilles
Dans cette partie, les pastilles contenant le facteur angiogénique d'intérêt sont préparés.
- Faire 10% (p / v) de sucralfate avec PBS. Stocker sous la température ambiante.
- Faire 12% (p / v) de poly-HEMA avec de l'éthanol absolu. Stocker sous la température ambiante.
- Faire 1 ug / ul solution de bFGF. Conserver dans -80 ° C.
- Pour faire 50 boulettes, mélangez 5 pl de poly-HEMA, 1 microlitre de sucralfate et 4 pl de solution de stock de bFGF, vortex soigneusement.
- Placer un morceau de parafilm nettoyage dans une boîte de Pétri, l'exposer sous la lumière UV pendant 15 min dans une hotte de culture de tissus. Baisse de 0,2 ul du mélange de solution sur le parafilm pour une pastille. Ainsi, 10 ul du mélange solution devrait rendement de 50 boulettes. Laissez les granulés secs à température ambiante pendant 1-2 heures. Les granulés séchés peuvent être stockés dans 4 oC pendant plusieurs jours, ou -80 ° C pendant plusieurs mois.
- À l'usage, un levier et ramasser les boulettes avec le bout d'une paire de pinces. Soyez extrêmement prudent pour ne pas les casser ou de les faire bondir.
2. La réalisation du test de la souris de poche cornée
Dans cette partie, nous allons démontrer comment faire une poche dans la cornée de souris, et comment insérer une pastille dans la poche. Le facteur angiogénique contenues dans le culot seront libérés progressivement vers les zones environnantes de la cornée (fig. 1). Dans cette démonstration, nous utilisons de 8 semaines féminine C57/BL6 souris.
- La souris est profondément anesthésié systématiquement avec le mélange de kétamine (75 mg / kg) et de xylazine (5mg/kg, injection ip). Cela permet de garder la souris sous un état d'anesthésie pendant 30-60 min. Anesthésique topique (0,5% proparacaïne HCl) est appliquée à la cornée. Après 5 min, corriger un œil sous un microscope à dissection.
- Une coupe très doux est faite au milieu de la cornée 1,2 -1,4 mm de la cornée du limbe (comme illustré dans la figure 1) avec un couteau de Graefe cataracte. Soyez extrêmement prudent de ne pas couper à travers la cornée.
- Une poche est faite sous la couche de l'épithélium de la cornée par horizontalement insérant le couteau dans le milieu de la cornée et l'extension du couteau vers l'attentivement limbe (Fig.1). La taille de la poche doit être assez grande pour accueillir l'un des facteurs angiogéniques granulés contenant. Soyez extrêmement prudent à ne pas percer à travers la cornée.
- Insérez une pastille avec une paire de pince dans la poche lentement. Essayez de faire la boulette aussi plate que possible.
- Après l'implantation de la pastille, une pommade ophtalmique antibiotique topique est appliqué à l'œil. Les instruments sont essuyés avec des tampons d'alcool de 70% entre les animaux.
- Déplacez la souris à un endroit chaud et sec et de le surveiller, jusqu'à ce qu'il soit capable de maintenir une posture droite, puis le ramener dans sa cage à la maison. Analgésiques systémiques (par exemple, buprénorphine, 2 mg / kg, par injection ip) et pommade antibiotique (par exemple la gentamicine) sont donnés deux fois par jour pendant 2 jours après la chirurgie et la souris est étroitement surveillée pendant 3 jours. La guérison est attendue pour compléter dans les 48 premières heures post-opératoires. L'œil avec la poche sera examiné sous un champ lampe à fente entre les jours de 40 à 10 biomicro après l'implantation de granules.
3. Les résultats représentatifs
- Sept jours après l'implantation de granulés, la souris est anesthésiée par voie systémique et topique tel que décrit en 2.1.
- Observez les vaisseaux sanguins dans la cornée induite par le facteur angiogénique sous un microscope à dissection. Dans la cornée traités avec le véhicule, pas de croissance des vaisseaux sanguins peut être observée (Fig. 2A, traité avec le véhicule cornée). Dans la cornée traitée avec le bFGF, l'angiogenèse robuste peut être vu (figure 2B). La croissance des vaisseaux sanguins peuvent être évalués en utilisant la longueur maximale des vaisseaux sanguins (des vaisseaux limbiques normale au sommet des nouveaux navires), et les superficies totales des vaisseaux sanguins (Fig. 2B, délimitée par une ligne rouge en pointillés dans le bFGF traités cornée). Autres méthodes de quantification ont également été décrites 2,5.
Figure 1. Une cornée. Normal avec coloration H & E. Aucun navire de sang existe dans une cornée normale. B. Faire une poche sous la couche épithélium de la cornée. C. Intégrer une pastille dans la poche. D. Le facteur angiogénique est libéré à partir du culot, et de nouveaux vaisseaux sanguins se développer à partir des vaisseaux normaux limbique.
Figure 2. Résultat représentatif cinq jours après implantation de la pastille. Une. Cornée avec un culot contenant le seul véhicule. Aucune formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans la cornée. Seuls les pré-existante normale vaisseaux limbiques sont visibles. B. Cornée avec un culot contenant le bFGF. Robuste nouveaux vaisseaux sanguins (dot-alignés) est née de la pré-existante normale vaisseaux limbiques.
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Discussion
La cornée de souris test poche modèle a été décrit pour la première en 1979 par Muthukkaruppan VR et Auerbach R 6. Des protocoles détaillés ont été publiés par différents laboratoires 2,3,7,8. Notre laboratoire a modifié et utilisé cette méthode dans nos études depuis de nombreuses années 4. Le dosage de la souris de poche cornée est un modèle relativement simple avec grande reproductibilité. Un autre avantage de ce modèle est que, depuis la cornée manque normalement les vaisseaux sanguins, il ya une quantité minimale de base dans ce dosage. Par conséquent, ce modèle est couramment utilisé par le champ d'étudier l'effet de différents facteurs angiogéniques et des molécules. Comparativement aux yeux de certains grands animaux, tels que les rats et les lapins, les yeux de souris sont plus petites et difficiles à manipuler. Une attention particulière est donc requise lors de l'exécution de ce modèle, en particulier pendant les processus de prise de la poche dans la cornée et l'insertion de la pastille. Le couteau doit être manipulé d'une manière contrôlée avec précision afin que ce ne sera pas la perforation de la cornée.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Notre recherche est soutenu par le Programme de recherche intra-muros des NIH, l'Institut National Eye.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Slit lamp | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Table 1. Equipments | |||
| bFGF (basic fibroblast growth factor) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% in PBS |
| poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% in Ethanol |
| Table 2. Reagents and materials | |||
References
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R.
- Ziche, M.
- Ziche, M., Morbidelli, L.
