Microfabricated Post-Array-detectores (mPADs): un enfoque para aislar las fuerzas mecánicas

Summary

En este vídeo, que muestran cómo fabricar y utilizar microfabricated detectores de POST (mPADs) para evaluar la modulación de la contractilidad celular.

Abstract

En este video, vamos a presentar nuestro enfoque para medir fuerzas de tracción celular utilizando una matriz de microfabricated de los puestos. Fuerzas de tracción se generan a través de la miosina-actina de las interacciones y juegan un papel importante en nuestra fisiología. Durante el desarrollo, que permiten a las células se mueven de un lugar a otro con el fin de formar las estructuras iniciales de los tejidos. Ayudar a las fuerzas de tracción en los procesos de curación. Son necesarios para el cierre adecuado de las heridas o la migración y el rastreo de los leucocitos a través de nuestro cuerpo. Estas mismas fuerzas pueden ser perjudiciales para nuestra salud en el caso de la metástasis del cáncer o de crecimiento vascular hacia un tumor. El método más común para el estudio de células in vitro ha sido la de utilizar un vaso o un plato de poliestireno. Sin embargo, la rigidez de los soportes hace que sea imposible medir físicamente las fuerzas de tracción de células, y son relativamente pocos los métodos para estudiar las fuerzas de tracción. Nuestro laboratorio ha desarrollado una técnica para superar estas limitaciones. El método se basa en una matriz vertical de voladizos flexible, la rigidez y la escala de tamaño de las cuales son tales que las células individuales repartidas en muchos voladizos y desviar en el proceso. Los pilares que utilizamos son de 3 m de diámetro, 10 m de altura, y se configuran en una matriz regular con 9 m de centro a centro de separación. Sin embargo, estas dimensiones físicas pueden ser fácilmente variar para acomodar una variedad de estudios. Empezamos con un maestro de silicio, pero el final de los mensajes están hechos de caucho de silicona llamado poli (dimetil-siloxano), o PDMS. Podemos medir las deflexiones bajo un microscopio y calcular la magnitud y dirección de las fuerzas de tracción necesaria para producir las desviaciones observadas. Llamamos a estos sustratos microfabricated post-serie de detectores o mPADs. Aquí le mostraremos cómo fabricar y utilizar la mPADs para evaluar las modulaciones de la contractilidad celular.

Protocol

Maestro fabricación de moldes de silicona

Litografía

Materiales:

• 75 obleas de silicio mm
• SU-8 2 fotosensible negativa (Microchem, Boston, MA)
• N2

Método:

1. Deshidratar oblea de Si a 120 º C durante 2 horas.
2. La superficie de la capa de ozono UV tratar durante 7 minutos para eliminar materia orgánica.
3. Superficie N2 golpe para eliminar las partículas.
4. Aplicar SU-8 2 para cubrir el 70% de la superficie (aproximadamente 10 ml de obleas de 75 mm).
5. Giran a 2000 rpm durante 20 segundos con 300 rpm de aceleración / s.
6. Lugar de la oblea en una placa y una rampa de temperatura ambiente a 95 ° C.
7. Softbake el fotoprotector durante 15 minutos a 95 ° C.
8. Inundaciones exponer las placas para los 20 a 25 mJ/cm2 dosis a 365 nm (I-line) para formar la capa inferior.
9. Aplicar SU-8 2 para la capa fotosensible segundos.
10. Giran a 550 rpm durante 20 segundos con 300 rpm de aceleración / s para una película de aproximadamente 11 micras de espesor.
11. Lugar de la oblea en una placa y una rampa de temperatura ambiente a 65 ° C.
12. Softbake la oblea a 65 ° C durante 5 minutos.
13. Rampa de la zona de cocción de 65 ° C a 95 ° C.
14. Softbake la oblea por 55 minutos a 95 ° C.
15. Oblea de enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
16. Alinear a la máscara de MPAD en la oblea y exponer de 95 a 100 mJ/cm2 dosis a 365 nm (I-line).
17. Lugar de la oblea en una placa y una rampa de temperatura ambiente a 95 ° C.
18. Después de la exposición hornear el fotoprotector durante 25 minutos a 95 ° C.

Desarrollar

Materiales:

• Platos de 100 mm de vidrio (5)
• Propileno glicol metil éter acetato (PGMEA)
• Isopropanol (IPA)
• N2

Método:

1. En una campana química, llenar cinco platos con PGMEA (2), IPA, y hexano (2).
2. Mantenga la oblea en primera PGMEA durante 10 segundos
3. Agite la oblea durante 50 segundos
4. Transferencia de láminas hasta la segunda PGMEA con menisco de PGMEA.
5. Agite por 5 segundos.
6. Transferencia de obleas para la API de menisco de PGMEA.
7. Agite durante 20 segundos.
8. Transferencia de láminas hasta la primera IPA.
9. Agite por 5 segundos.
10. Transferencia de láminas hasta la segunda IPA.
11. Agite por 5 segundos.
12. Quite rápidamente la oblea de la IPA segundo con menisco de la IPA y seco, con N2
13. Inspeccione el patrón.
14. Hardbake de obleas de 120 ° C durante 14-20 horas para entrecruzar SU-8.
15. Dados de la oblea con un cortador de diamantes
16. Monte la oblea en un portaobjetos de vidrio con epoxi
17. Fluorosilanize la oblea (vea las instrucciones en el moldeo de replicación)

Replicación de moldeo de mPADS

Molde negativo

Materiales:

• De aluminio desechables peso barco
• Polidimetilsiloxano (PDMS) de base y agente de curado (Dow, Midland, MI)
• Razorblade
• Silano: (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahyrooctyl)-1-triclorosilano
• Portaobjetos de vidrio
• Pasteur de vidrio con una pipeta

Método:

1. Mix PDMS 10:1 en peso y desgasificar en bajo vacío durante 1 hora para eliminar las burbujas.
2. Silicio lugar principal de moho en bote de aluminio.
3. Verter 50-60 g de PDMS sobre molde maestro en bote de aluminio.
4. Degas al vacío durante 30 minutos para eliminar las burbujas.
5. Soplar atrapados en la superficie las burbujas de aire en PDMS con ráfaga rápida de N2.
6. Barco Coloque en el horno de convección a 110 ° C durante 15 minutos hasta que esté firme PDMS.
7. Cortar bote de aluminio.
8. Con hoja de afeitar, recortar PDMS debajo de silicio maestro.
9. Pelar PDMS lejos de maestro de silicio con un movimiento lento y constante en una dirección para evitar la destrucción del maestro.
10. Inspeccione el maestro de silicio de los daños.
11. Cortar el molde negativo en 4 trozos.
12. Repita los pasos 1-10 para un gran lote de moldes negativos.
13. Plasma de oxígeno tratar molde negativo de 1,5 minutos para activar la superficie, o
14. La capa de ozono tratamiento de molde negativo durante 10 minutos para activar la superficie.
15. Colocar los moldes negativos en desecador con características MPAD expuestos.
16. Propagación 250-500 L de silano en portaobjetos de vidrio en el centro de desecador
17. Vidrio lugar pastos pipeta con 150-200 L de silano en la punta dentro de un desecador.
18. Cámara de vacío para evaporar moldes negativos de silano y un abrigo de> 14 horas.

mPADS

Materiales:

• Polidimetilsiloxano (PDMS) de base y agente de curado (Dow, Midland, MI)
• De boca ancha de pipetas desechables
• 2 "x 3" portaobjetos de vidrio
• Escriba vidrio
• N2

Método:

1. Mix PDMS 10:1 en peso y desgasificar en bajo vacío durante 1 hora para eliminar las burbujas.
2. encaje silanizada moldes negativos en la 'cruz'
3. Pipeta de PDMS en los moldes negativos de modo que las características están completamente cubiertos con un espesor de 1 mm.
4. Espere 30 minutos para que cualquier burbuja de aire en el PDMS a la altura de la superficie. </ Li>
5. En el 30 'el tiempo de inactividad, el polvo de 22x22mm (No. 2) cubreobjetos de vidrio con una corriente de N2.
6. Plasma de oxígeno portaobjetos de vidrio tratar mitades durante 1,5 minutos para limpiar y activar vidrio
7. Soplar atrapados en la superficie las burbujas de aire en PDMS con ráfaga rápida de N2.
8. Coloque con cuidado el borde del vidrio cubreobjetos de PDMS con la cara limpia de plasma frente a la PDMS. Baje lentamente el portaobjetos de vidrio para que el pleno PDMS contacto con la superficie de vidrio entero y evitar burbujas de aire queden atrapados debajo de la lámina de vidrio.
9. Colocar los moldes montados en el horno de convección a 110 ° C durante 20 horas para curar completamente.
10. Retire los moldes del horno y dejar enfriar a temperatura ambiente.
11. Mantenga portaobjetos de vidrio con una mano en la parte superior y poco a poco la cáscara negativo de distancia del molde negativo de la parte inferior para liberar el MPAD.
12. Inspeccione el MPAD bajo un microscopio para los puestos se derrumbó.
13. Re-silanizar molde a través de plasma y silano cada cuatro piezas de fundición. La vida útil del molde negativo para la replicación buena es de aproximadamente 6.20 moldes.

Las células de siembra en mPADS

Estampado

Materiales:

• PDMS sellos para la UCP (ver Tien, J & Chen, CS, en los métodos de la Ingeniería de Tejidos, 2001, pp 113-120.)
• Etanol (100% y 70%)
• El agua esterilizada desionizada
• 50 ug / ml fibronectina humana en agua destilada estéril (BD Biosciences)
• 5 ug / ml Solución DII se filtra con membrana de 0,2 micras (D-3886, Molecular Probes, OR)
• 2% Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, Nueva Jersey)
• Fosfato Buffer 1X solución.
• 100 mm x 25 mm caja de petri (4)
• 150 mm x 25 mm caja de petri (2)
• Lámina de aluminio
• N2
• Pinzas
• Hood estéril

Método:

1. Recorte el exceso de PDMS mPADs
2. Si el sello PDMS se ha utilizado previamente, sonicar sellos en etanol al 100% durante 5 minutos para depurar las proteínas contaminantes.
3. En campana estéril, mantener los sellos en sus lados con unas pinzas y seco con N2 tras caer sellos en etanol 100% frescos y agua estéril
4. Lugar en 150 mm placa de Petri con el trabajo hacia arriba.
5. Alícuota de gotas de solución de fibronectina en cada estampilla. Comience con las esquinas de cada uno de los sellos, y luego los bordes, y, por último, las regiones del interior. Inicialmente, la superficie del sello PDMS es hidrofóbica, pero se convierte en hidrófila la proteína es absorbida. De trabajo "afuera hacia adentro", cambia el ángulo de contacto del PDMS, para que un menor volumen de la solución de fibronectina es totalmente necesario para cubrir el sello.
6. Deje reposar durante 1 hora en la capilla de la adsorción de proteínas.
7. Lavar con agua DI sellos vertiendo en un plato y dejar que el nivel del agua aumentará en los sellos.
8. Lavado de sellos en 100 mm placa de Petri con agua DI.
9. Retire y seque con N2.
10. MPADS ozono tratar durante 7 minutos para activar la superficie de sellado.
11. Bajo el capó, el sello mPADS mediante la colocación de sello en el borde MPAD y suavemente bajar para hacer un contacto pleno. Golpee suavemente la parte superior de la estampilla con pinzas para asegurar que todas las áreas tienen un buen contacto, pero tenga cuidado de no contraer los mensajes.
12. Retire con cuidado sellos con unas pinzas.
13. MPADS sumergirse en 100 mm placa de Petri con un 100% de etanol durante unos 15 segundos. Mantenga microagujas de deshumectación durante la transferencia mediante la transferencia rápida entre los platos.
14. MPADS sumergirse en 100 mm placa de Petri con 70% de etanol durante unos 15 segundos.
15. MPADS sumergirse en 100 mm placa de Petri con agua destilada para ~ 15 segundos.
16. MPADS sumergirse en el segundo 100 mm placa de Petri con agua destilada para ~ 15 segundos.
17. MPADS sumergirse en 150 mm placa de Petri con agua destilada.
18. MPADS sumergirse en 150 mm placa de Petri con 100 ml de solución de DII.
19. Cubra con papel aluminio y remoje por 1 hora.
20. MPADS sumergirse en 100 mm placa de Petri con agua destilada para ~ 15 segundos.
21. MPADS sumergirse en 150 mm placa de Petri con 10 ml de Pluronics 2% y 90 ml de PBS a la concentración total de Pluronics 0,2%.
22. Cubra y remoje por 1 hora.
23. MPADS sumergirse en 100 mm placa de Petri con agua destilada para ~ 15 segundos.
24. MPADS sumergirse en el segundo 100 mm placa de Petri con agua destilada para ~ 15 segundos.
25. MPADS sumergirse en la tercera 100 mm placa de Petri con PBS durante unos 15 segundos.

Siembra

Materiales:

• Celda elegida línea
• Tripsina-EDTA (0,25% de tripsina con EDTA • 4NA, Cat Gibco. N º 25200-056)
• El crecimiento medio
• Fosfato Buffer 1X solución.

Método:

1. En campana estéril, mPADS lugar en 100 mm placa de Petri y se llenan de medio ml 17.
2. Colocar placa de Petri en la incubadora se caliente a 37 ° C
3. Suspender las células a través de la tripsina
4. Aspirado varias veces para romper los cúmulos de células.
5. Pipeta de suspensión de células en la placa de Petri con la mPADS. Añadir estas células se mantendrán las células individuales (sin contactos célula-célula) en el momento del análisis. La cantidad exacta de las células a añadir es de tipo celular específico ydepende del área de la celda difusión y la tasa de crecimiento.
6. Suavemente se dispersan las células en placa de Petri con pippetting lento.
7. Lugar en la incubadora durante 2 horas para permitir que las células se asiente y se adhieren a microagujas.
8. Inspeccione mPADS para ver si las células se han extendido. Las células tienen aspecto aplanado y el período de seis o más mensajes.
9. Si las células se propagan, la transferencia de mPADS a los nuevos platos de Petri de 100 mm con 21 ml de medio fresco.
10. El mPADS está listo para su experimento.

Tinción y montaje mPADS

Fijación

Materiales:

• Agua desionizada
• Paraformeldahyde (16%) vial
• Fosfato solución tampón 10X.
• Fosfato Buffer 1X solución.

Método:

1. En un tubo de centrífuga de 50 ml, agregar 30 ml de DI, 10 ml de paraformeldahyde (vial completo), y 4,5 mL de PBS 10X para la solución de fijación.
2. Añadir ~ 25 ml de solución fijadora a un 100 mm placa de Petri.
3. Sumergir suavemente MPAD con las células en la fijación de plato y dejar incubar durante 20 minutos.
4. MPADS sumergirse en 100 mm plato con 1X PBS tres veces.
5. Listo para inmunoticción y montaje.

Análisis de las fuerzas celular en mPADS

Microscopía confocal

Materiales:

• Microscopio confocal
• Objetivo 63X
• Cubos de filtros de anticuerpos secundarios
• Filtro verde cubo (rodamina) para DII imágenes de microagujas.

Método:

1. MPADs lugar en el escenario y encontrar células individuales con 300 ms de exposición, no hurgar en la basura.
2. Tapas de la imagen de microagujas de imagen superior.
3. Z utilizando el control de lectura, captura de imágenes de microagujas de imagen inferior.
4. Imagen de los otros canales que tienen manchas en (Hoechst, phalloidin etc)

Análisis de Imágenes

Materiales:

• MATLAB con Image Processing Toolbox

Método:

1. Girar y registro de imágenes superior e inferior
2. Centroides medida de fondo (sin desviarse) y altos puestos (desviado)
3. Calcular el desplazamiento
4. Utilizando la constante del resorte de los puestos (conocido, depende de la geometría post), calcular vector de fuerza en cada puesto
5. El análisis de errores se basa en la capacidad de resolver las fuerzas, y depende de la resolución de la imagen y la resolución de detección de centroide
6. Organizar los datos según sus necesidades a medida - por ejemplo, magnitudes, la fuerza y ​​/ o dirección, como un curso a tiempo, muchas mediciones en diferentes condiciones, etc