Summary
Ein Verfahren zur Extraktion aus mikrobiellen Metaboliten planktonischen Gemeinden vorgestellt. Ganze Gemeinde Probenahme durch Filtration auf speziell präparierten Filter erreicht. Nach der Gefriertrocknung sind wasserlösliche Metaboliten extrahiert. Dieser Ansatz ermöglicht eine Anwendung des Umweltrechts Metabolomik zu trans-omik Untersuchungen von natürlichen oder experimentellen mikrobiellen Gemeinschaften.
Abstract
Environmental Metabolomik ist ein aufstrebendes Gebiet, die Förderung der neuen Verständnis ist in, wie Organismen reagieren und interagieren mit der Umwelt und miteinander auf biochemischer Ebene ein. Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie ist eine von mehreren Technologien, einschließlich der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), mit äußerst viel versprechend für solche Studien. Vorteile bei NMR sind, dass sie für ungezielte Analysen ist, eine strukturelle Informationen und Spektren können in quantitativer und statistische Weise vor kürzlich verfügbaren Datenbanken der einzelnen Spektren Metaboliten 2,3 abgefragt werden. Darüber hinaus können NMR-Daten mit Daten aus anderen omik Ebenen (zB Transcriptomics, Genomik), um ein umfassenderes Verständnis der physiologischen Reaktionen von Taxa zueinander und die Umwelt bieten 4,5,6 kombiniert werden. Jedoch ist die NMR weniger empfindlich als andere Techniken metabolomische, was es schwierig macht apLage zur natürlichen mikrobiellen Systemen, bei denen Probe Populationen mit geringer Dichte und Metabolit-Konzentrationen niedrig, um Stoffwechselprodukte von gut definierten und leicht extrahierbar Quellen wie ganze Gewebe, Körperflüssigkeiten oder Zellkulturen. verglichen werden können Folglich haben die wenigen direkten Umweltaspekte metabolomische Studien von Mikroben durchgeführt, um Datum, um Kultur-oder leicht definiert High-Density-Ökosysteme wie Wirt-Symbiont-Systeme, konstruiert Co-Kulturen oder Manipulationen des Darms Umgebung, in der Markierung mit stabilen Isotopen kann beschränkt zusätzlich verwendet werden, um zu verbessern NMR-Signale 7,8,9,10,11,12. Methoden, die die Konzentration und Sammlung von Umweltdaten zu erleichtern Metaboliten in Konzentrationen für die NMR fehlen. Seit den letzten Augenmerk wurde auf die Umwelt Metabolomics von Organismen im Gewässer, in denen viel von der Energie-und Materialfluss von der Plankton-Gemeinschaft 13,14 vermittelt wird, gegeben worden ist, haben wir eine Methode zur Konzentration entwickelttion und Extraktion der gesamten Gemeinde-Metaboliten aus planktonischen mikrobiellen Systemen durch Filtration. Im Handel erhältliche hydrophilen Poly-1 ,1-Difluorethen (PVDF) Filter sind speziell behandelt, um vollständig zu entfernen extrahierbaren, die ansonsten als Verunreinigungen in den nachfolgenden Analysen auftreten. Diese behandelten Filter werden dann verwendet, um die Umwelt oder experimentellen Proben von Interesse zu filtern. Filter, die das nasse Probenmaterial werden lyophilisiert und wasserlöslichen Metaboliten werden direkt für die konventionelle NMR-Spektroskopie mit Hilfe eines standardisierten Kaliumphosphat Extraktionspuffer 2 extrahiert. Die Daten aus diesen Methoden abgeleitet werden können statistisch ausgewertet werden, um sinnvolle Muster zu identifizieren, oder mit anderen omik Ebenen für umfassende Verständnis von Gemeinschaft und Funktion des Ökosystems.
Protocol
1. Filter Vorbereitung auf Extrahierbare entfernen
- Verwendung von 25 mm Durchmesser 0,22 um Porengröße Durapore PVDF hydrophilen Filter (Millipore). Die Filter sollten in einem sauberen 500 ml-Pyrex-Becherglas mit einer Pinzette. Vorspülen dreimal mit destilliertem Wasser. Swirl gut wie Sie, um die Filter aus aneinander kleben zu verhindern spülen. Dann werden 300 ml Milli-Q (Millipore) oder eine gleichwertige hochwertiges Wasser. Autoklav um die vollständige Entfernung der extrahierbaren von den Filtern zu erleichtern.
- Abgießen, Milli-Q und dreifach wieder spülen Sie die Filter, diesmal mit Milli-Q. Mit einer Pinzette Ort individuelle Filter auf einem sauberen und trockenen Oberfläche (z. B. Alufolie) und entweder trocken zu einem vernünftigen Temperatur (zB 37 ° C) oder an der Luft trocknen. Die Filter sind nun einsatzbereit.
2. Filtration des Probenmaterials
- Zur Demonstration dieses Protokolls kann ein Millipore Edelstahl 3-Platz-Filter Verteiler mit 25-mm-Filter Mikroanalyse Säulen mit Glas unterstütztund eine mechanische Pumpe verwendet werden. Unter aseptischen Bedingungen legen Sie eine einzelne 25-mm-Filter auf dem Filter Säulenfuß, wenden Sie die Spalte und spannen zusammen.
- Last 15 ml der Probe auf die Säule, öffnen Sie die Stop-Ventil auf dem Filter vielfältig, und schalten Sie die Pumpe. Filtern sie unter leichtem Druck auf dem Aufbrechen der Zellen (<5 kPa) zu minimieren. Andere Pumpen, wie Hand oder einer peristaltischen Pumpe kann zu diesem Protokoll angepasst werden. Für geringere Dichte Proben, aufeinanderfolgende Zugaben von Wasser kann es erforderlich sein, lassen Sie sich nicht die Filter gehen über einen längeren Zeitraum zwischen den Zugaben von Wasser trocken.
- Für marine Proben, nachdem Sie Ihre Probe gefiltert haben, können Sie eine optionale Süßwasser spülen, um das restliche paramagnetischen Ionen in Ihrer Probe und auf dem Filter zu reduzieren. Dies kann mit präziser Abstimmung der Magnet des Spektrometers zu helfen. Einfach sanft fügen Sie eine kleine Menge Wasser und filtriert durch Ihre gesammelten Probe am Ende.
- Nach Filterung beendet ist, schalten Sie die Pumpe, und lassen Sie das Ventil OPEn, so gibt es immer noch Unterdruck unter dem Filter. Entfernen Sie die Klammer und Filter-Spalte.
- Mit der einen Hand, verwenden Sie saubere Pinzette Halt des Filters zu nehmen. Falten Sie den Filter über sich selbst, aber nicht knittert. Mit der anderen Hand mit der Lippe einer sterilen 2-ml Zentrifugenröhrchen Halten Sie die Filter. Lassen Sie die Pinzette verwenden Sie sie dann wieder greifen Sie beide Kanten des Filters. Regrip in einem 45 ° Winkel in den Schoß.
- Setzen Sie den Filter in die 2-ml-Tube und Freisetzung so dass es mit der Probe Seite nach innen öffnet. Sie können bis zu zwei Filter in das sterile 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf diese Weise. Bei Verwendung von zwei Filtern, sicherzustellen, dass sie überlappen so wenig wie möglich. Sofort einfrieren (mindestens -30 ° C).
3. Extraktion von wasserlöslichen Metaboliten
- Lyophilisieren Ihre Proben über Nacht oder für mindestens 10 Stunden.
- Nach der Gefriertrocknung, fügen Sie ein Edelstahl-Brecher in jedes Röhrchen (Tokken). Fügen Sie 750 ul standardisierte KaliumPhosphat-NMR-Puffer in Deuteriumoxid (2 H> 90%) mit 2,2-Dimethyl-2-silapentane-5-sulfonat (DSS)-Norm (KPi; 38,3 mM KH 2 PO 4, 61,7 mM K 2 HPO 4, 0,1 DSS mM, pH 7,0, 90% D 2 O) 2.
- Beschallen die Proben für 5 Minuten bei 4 ° C in einem Wasserbad Ultraschallgerät (Bioruptor, Diagenode), die Zellmaterial aus dem Filter zu entfernen. Entfernen Sie die Filter mit sauberer Pinzette.
- Die Zellen unter Verwendung einer Mühle Brecher (1600 rpm) für 5 Minuten.
- Inkubation bei 65 ° C unter Schütteln (1400 rpm) auf einem Tisch-Schüttler (Eppendorf) für 15 Minuten.
- Entfernen Sie die Metall-Schwein mit sauberer Pinzette, und zentrifugieren Sie die Probe bei 13.000 g für 5 Minuten.
- Beziehen Sie den Überstand direkt an einem NMR-Röhrchen für die NMR-Spektroskopie.
4. NMR-Spektroskopie und Datenanalyse
- Legen Sie Ihre Probe in einem NMR-Spektrometer (hier ein Bruker-DRX-500-Spektrometer ausgestattet mitTXI Sonde mit Dreifach-Achse Gradienten von einem Computer mit XWIN-NMR) gesteuert.
- Erhalten 1D-1 H-NMR-Spektren mit Hilfe geeigneter Methoden bisher veröffentlichten 2,15 aus dem XWIN-NMR-Schnittstelle. In der vorliegenden Studie 1 H-NMR-Spektren wurden an einem DRX-500 Spektrometer bei 500,03 MHz bei 298 K. Restwasser Signale aufgezeichnet wurden von der Watergate-Pulssequenz unterdrückt, mit einer Wiederholrate von 1,2 s. 128 Transienten wurden gesammelt, um 32.000 Datenpunkte pro Spektrum zu erhalten.
- Übertragen Sie die NMR-Daten-Verzeichnisse auf einem PC installiert NMRPIPE Software 16. Verarbeiten Sie die Rohdaten und Set DSS als 0 ppm Verweis dann manuell Phase der Spektren. Digitalisieren Sie die spektralen Daten in eine Reihe von diskreten Werten durch die Integration oder "Binning" sie mit Software wie rNMR, Automics oder zum öffentlichen FT2B Paket aus dem ECOMICS Website ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) 3,17. In thwird beispielsweise wurden Spektren zwischen 0,5 und 10,5 ppm über 0,032 ppm integraler Regionen mit ECOMICS und normalisierte sich entweder auf DSS oder insgesamt Signalintensität integriert. Output-Daten können nun für nachgeschaltete statistische Analyse wie z. B. Hauptkomponentenanalyse (PCA), die freie Software-Pakete wie R 18 verwendet werden.
5. Repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel von 1 H-NMR-Spektren unter Verwendung der obigen Verfahren in Abbildung 1 gezeigt. Diese Proben von zwei Zeitpunkten eines Mikrokosmos Experiment zeigen deutliche Unterschiede aufgrund von Algen Stoffwechselaktivitäten. Die Tag 4-Spektrum zeigt das grosse Vorkommen Peaks, insbesondere in der 3-4 ppm-Bereich im Vergleich zum Tag 1 Probe. Diese Spitzen können Zucker durch blühende Kieselalgen innerhalb des Mikrokosmos produziert zugeschrieben werden. In einem ähnlichen Experiment vergleicht das Wachstum von natürlichem Plankton Gemeinden in künstlichen oder natürlichen Meerwasser, statistische Ansätze such als Principal Component Analysis (PCA) Score-Diagramm aus klassierten NMR-Spektren abgeleitet werden verwendet, um klare metabolische Unterschiede zwischen den beiden Behandlungen (Abb. 2) zeigen, während die Belastung Plots können Peaks innerhalb der Spektren zu identifizieren, die Form der Verteilung der Daten . Solche Ergebnisse können im Vergleich mit Daten von anderen omik Ebenen, wie aus genomischer Fingerabdruckverfahren (Abb. 3). Diese NMR-Peaks können einzeln abgefragt werden (zB an der BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/ ) 19, oder ganze Spektren können statistisch ausgewertet werden (zB mit SpinAssign bei http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search ) 2. In diesem Beispiel waren die Unterschiede zwischen den Behandlungen wegen einer Fülle von Spitzen in der Region Zucker (3,39 ppm bis 4,04 ppm) von Spektren aus natürlichen Planktongemeinschaft Metaboliten, und mehrere Gipfel Merkmal mit den Gemeinden künstlichem Meerwasser wurden vorläufig identified wie Lactat und Formiat mit SpinAssign.
Abbildung 1. Vertreter 1 H-NMR-Spektren von Proben bearbeitet mit diesem Verfahren erhalten. Mikrokosmos Proben wurden vor (Tag 1) und während (Tag 4) einer intensiven Kieselalgenblüte genommen. NMR-Spektren wurden auf einem Bruker DRX-500 mit Signalen normiert auf den internen Standard Peakhöhe (; 0 ppm DSS) durchgeführt.
Abbildung 2. Hauptkomponentenanalyse (PCA) Score-Diagramm gebinnten NMR-Spektren von metabolomes von natürlich abgeleitet mikrobiellen planktonischen Gemeinden in Mikrokosmen mit natürlich gewachsenen (offene Rauten) oder künstlicher (schwarze Kreise) Meerwasser. Klare metabolischen Unterschiede lassen sich im Streudiagramm beobachtet werden. Ein Be-Plot aus einer solchen Analyse können dann verwendet werden, um deutliche Spitzen in der Bedeutung identifizieren werdendas System, wobei diese Peaks können weiter analysiert werden, wie erforderlich.
Abbildung 3. Ein Beispiel für Multi-omik Analyse kombiniert NMR mit genomischen Daten. Gemeinschaft Zusammensetzung auf denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese von 18S (links) und 16S (rechts) rRNA-Gene aus den gleichen Proben wie in Abbildung 2 analysiert Basis zeigt auch verschiedene mikrobielle Gemeinschaft Muster zwischen natürlichen (offene Rauten) und künstliche (schwarze Kreise) Meerwasser Mikrokosmen. Eine solche Korrespondenz zwischen Genom und Metabolom von natürlichen Systemen zeigt den Nutzen dieses Ansatzes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Filtration und Metaboliten Extraktionsverfahren hier gezeigt ermöglicht mikrobiellen Biomasse planktonischen in ausreichender Menge für die NMR-Metabolomik gesammelt werden. Während nur Extraktion von wasserlöslichen Metaboliten mit KPi und 1D 1 H-NMR nachgewiesen wird, können andere Extraktionslösungsmittel und spektroskopische Methoden verwendet werden. Ein gutes Beispiel ist die Verwendung von deuteriertem Methanol als semi-polaren Lösungsmittel, von dem gezeigt wurde, um überlegene NMR-Spektren von heterogenen Proben zu erzeugen und ist weniger empfindlich gegenüber Verunreinigungen durch paramagnetische Ionen, wie sie in marinen Proben 15 gefunden. In solchen Fällen sollte das Pellet aus der Extraktion oben für aufeinanderfolgende Extraktionen erhalten werden. Unsere bisherige Arbeit hat sich die Stabilität der Spektren unter solchen Inkubationszeiten und Temperaturen und die Eignung der direkten wässrige Extraktion für NMR-Spektroskopie 15,20 gezeigt. Doch Forscher können auch lieber Extraktionsschritten ändern, zum Beispiel durch die Verwendung eines denaTuring Schritt, um Enzyme zu inaktivieren vor der Extraktion oder durch Verwendung Rascherstarrungstechnik Methoden, die von einfach Einfrieren der Zellen wie hier dargestellt unterscheiden. Darüber hinaus, während die hier vorgestellten Methoden am besten für die Beobachtung proportional Veränderungen in Metaboliten über Behandlungen, falls gewünscht, geeignet sind, können Filter vorgewogen werden und dann wieder gewogen, nachdem Probe Filtration und Gefriertrocknung zu Trockengewicht oder das Volumen der Probe gefiltert werden können erhalten verwendet werden, um mehr quantitative Metaboliten Quelldaten zu erhalten.
Letztlich wird der Nutzen der NMR für planktonischen Proben durch die Menge der Masse, die erfolgreich gesammelt werden kann, eingeschränkt, auch High-Density-Kulturen können große Mengen (> 100 ml) benötigen, um ausreichend trockener Biomasse zu erhalten. Doch innerhalb eines experimentellen Rahmen, Markierung mit stabilen Isotopen in der Mikro-oder Mesokosmosexperimenten, sind 2D-1 H-13 C heteronuklearen Einquantenkohärenz (HSQC) Ansätze möglich. Ferner haben wir zusätzlich 47 verwendet -mm-Filter und 5-ml-Polypropylen-Röhrchen, die Menge an Biomasse, die für die Extraktion gesammelt werden können, als noch größere Mengen zu erhöhen kann es erforderlich sein (dh> 2 L) für die natürlichen Gemeinschaften aus, z. B. oligotrophen Gewässern, in denen Zelldichten sind gering.
Filtration ist vorteilhaft gegenüber Zentrifugation, wie es unserer Beobachtung ist, dass einige kleinere mikrobiellen Taxa (insbesondere kleine heterotrophe Bakterien) oft nicht gut Pellet. Die Filtration kann manuell in das Feld durchgeführt werden, und dass das Volumen filtriert werden nur durch die Anzahl der verfügbaren Filter beschränkt. Zusätzlich kann überschüssiges Medium oder Wasser in dieser Weise entfernt werden, und die Proben können bei Bedarf gespült werden. Natürlich auch mit Filtration, wird die Gemeinschaft gesammelt, um eine Größenfraktion beschränkt auf die Cutoff-Frequenz, die in diesem Beispiel 0,22 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch Grant-in-Aid for Scientific Research für die Anfechtung der exploratorischen Forschung (JK), und der wissenschaftlichen Forschung (A) (JK und SM) aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Science, and Technology, Japan . Ein RIKEN FPR Gemeinschaft (RCE) lieferten zusätzliche Unterstützung. Die Autoren bedanken sich für Drs. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama und Mami Okamoto, um technische Unterstützung bei den NMR-und statistische Analysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- The R Project for Statistical Computing. , Available from: http://www.r-project.org/ (2010).
- Eldon, L., et al.
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
