Summary
М клеток в специализированные фолликула связанных эпителия покрытие Пейеровы бляшки играют важную роль для слизистой иммунологического в кишечнике-лимфоидной ткани. Здесь мы описали метод оценки бактериального трансцитоза клетками М
Abstract
Внутри нашего кишечнике обитает огромное количество синантропных бактерий. Поверхности слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта постоянно подвергаются им, а иногда и к патогенам. Кишкой лимфоидной ткани (GALT) играют ключевую роль для индукции иммунного ответа слизистой оболочки к этим микробам 1, 2. Чтобы инициировать иммунный ответ слизистой оболочки, слизистой оболочки антигены должны быть перевезены из просвета кишечника через эпителиальный барьер в организованных лимфоидных фолликулов, такие как патчи Пейера. Этот антиген трансцитоза опосредовано специализированные эпителиальные клетки M 3, 4. М клетки атипичных эпителиальных клеток, которые активно фагоцитируют макромолекул и микробов. В отличие от дендритные клетки (ДК) и макрофаги, которые ориентированы на антигены в лизосомы для деградации, М клетки главным образом transcytose внутренним антигенам. Это энергичные трансцитоза макромолекулярных через ячейки M обеспечивает антиген к основной организованной лимфоидных фолликуловг, как полагают, необходимо для начала антиген-специфического иммунного ответа слизистой оболочки. Однако молекулярные механизмы, использующие этот антиген поглощение клетками М известно мало. Ранее мы уже сообщали, что гликопротеин 2 (GP2), особенно выраженные на апикальной мембране плазмы М клетки среди энтероцитов, служит рецептором для transcytotic подмножество синантропных и патогенных энтеробактерий, в том числе кишечной палочки и сальмонеллы enterica серовар Typhimurium (S. Typhimurium ), признав FimH, компонента типа я пили на бактериальные наружной мембраны 5. Здесь мы представляем метод применения патча мыши Пейера кишечного анализа цикла для оценки бактериальной поглощение клетками M. Этот метод является улучшенной версией мыши кишечная петля анализа описанных выше 6, 7. Улучшение точек таковы: 1. Изофлюрана был использован в качестве анестетика. 2. Примерно в 1 см лигируют кишечного включая циклПатч ING Пейера была создана. 3. Бактерии рассмотрен клетки М были помечены флуоресцентно флуоресценции реагента маркировки или гиперэкспрессией флуоресцентного белка, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP). 4. М клеток фолликула связанных эпителия покрытие патч Пейера были обнаружены целые монтажа immunostainig с анти антитела GP2. 5. Флуоресцентные бактериальных трансцитоза клетками М наблюдались с помощью конфокальной микроскопического анализа. Патч мыши Пейера кишечного анализа цикла может дать ответ какую комменсальной или патогенных бактерий трансцитоз клетками М, и может привести нам понять молекулярный механизм, как стимулировать иммунную систему слизистой оболочки через ячейки M.
Protocol
1. Подготовка бактериальных клеток
- Подряд глицерина заполненный люминесцентные бактерии (например, GFP выражения S. Typhimurium) на LB агар пластины, содержащей 100 мкг / мл ампициллина.
- Культура одну колонию из LB агар на ночь в 2 мл новая среда LB.
- Добавить 0,5 мл бактериальной культуры в 4,5 мл питательной среды LB и инкубировать до оптической плотности 1,0 при 600 нм достигается.
- Урожай бактериальных клеток путем центрифугирования (3000 мкг, 5 мин, 4 ° С).
- Удалите супернатант и мыть два раза с 5,0 мл стерильного фосфатного буфера физиологический раствор (PBS).
- Ресуспендируют бактериальных гранул с 5 мл PBS, а также использовать 50 мкл суспензии, содержащей около 10 7 колониеобразующих единицы (КОЕ) в качестве посевного.
- В случае использования флуоресцентно меченных бактерии, бактериальные клетки были помечены флуоресценции реагента маркировки в соответствии со стандартом протокола.
2.nesthesia
- Заполните небольшую пластиковую коробку (10 х 10 х 5 см) с 5% (объем / объем) испаряется изофлуран в смеси с воздухом (расход: 200 мл / мин).
- Обезболить восьми до шестнадцати-слабых-летний мужчина или женщина мышей в поле.
- Перемещение мышей вскрытии таблицы после наркоза.
- Постоянно обезболить мышей на 2% (объем / объем) испаряется изофлуран в смеси с воздухом (расход: 200 мл / мин) (рис. 1). Это терминал процедуры.
3. Патч цикл лигируют Пейера анализа
- Надрезать 1 см кожи живота, а затем сократить брюшной брюшины наркозом мыши и вывезти тонкой кишки содержащие патч Пейера.
- Лигировать кишечника с мулине, пряжа, заботясь, чтобы избежать кровеносных сосудов. Примечание: только связываются с одной стороны кишечника, и оставить другой стороны свободно.
- Inject 50 мкл бактериальной суспензии или PBS (контроль) с помощью шприца в патч цикл лигируют Пейера на свободе сязь кишечника (рис. 2).
- Привязка свободную сторону, и закрыть живот мышки при клипа.
- Через 1 ч, удалите лигируют патч цикл Пейера и эвтаназии мышь шейки дислокации.
- Акцизный Пейера патч от патча цикл лигируют Пейера.
- Мигает апикальной стороне патч Пейера по 1 мл PBS с использованием шприца придает иглу для удаления избытка слизистой жидкости и бактерий. Мигает патч Пейера еще два раза.
4. Всего окрашивания монтировать и конфокальной микроскопический анализ патч Пейера
- Fix патч Пейера в Cytofix BD / Cytoperm решение на льду в течение 1 часа.
- Вымойте патч Пейера три раза с 1 мл BD Пермь / промывочного буфера в течение 5 минут, а затем блок с 1 мл блокирующего буфера, содержащего 0,1% (вес / объем) сапонин, 0,2% (вес / объем) BSA в PBS в течение 30 мин на льда.
- Добавить 200-кратного разбавленный антимышиным GP2 моноклональные антитела (5 мкг / мл), образец для обнаруженияМ клеток.
- Выдержите в течение 2 часов при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
- Промыть три раза с 1 мл холодного PBS, затем добавить 200-кратного разбавленный анти-IgG-антител крысы сопряженных с DyLight549 (20 мкг / мл) для образца.
- Инкубируйте образцы на льду в течение 2 часов.
- Промыть три раза с 1 мл холодного PBS, затем добавить 50-кратное разбавленный Alexa 633 сопряженных фаллоидином к образцу для обнаружения F-актина.
- Инкубируйте на льду в течение 2 часов.
- Вымойте слегка с 1 мл холодного PBS. Затем поместите 3:57 образцах круглого остекления на слайде, и вставлять образцов в 30% раствор глицерина в PBS на слайде (рис. 3).
- Соблюдайте образцов с DM-IRE2 конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и деконволюции DeltaVision Восстановление микроскопом.
5. Представитель Результаты:
Образец пример мыши лигируют патч Пейера цикл анализа с GFP-брюшного тифаmurium наблюдалось при деконволюции DeltaVision Восстановление микроскопа (рис. 4). GFP-S. Typhimurium является трансцитоз по GP2 М + клеток. Патч мыши Пейера кишечного анализа цикла может определить вид синантропных или патогенных бактерий, которые могут быть трансцитоз клетками M.
Рисунок 1. Анестезия мышей в испаряется изофлуран состоянии. Испаряясь изофлуран было поставлено анестезии посвященный аппарата (левая сторона).
Рисунок 2. Резюме патч лигируют Пейера кишечного анализа цикла. Флуоресцентные бактериальной суспензии вводили с помощью шприца в патч цикл лигируют Пейера на свободе стороны кишечника.
Рисунок 4. Пример мыши лигируют патч Пейера цикл анализа с GFP-S. Typhimurium. GP2, о котором сообщается, как M ячейки специфическим маркером 5, окрашивали анти-мышиных антител GP2 (красный). Образце наблюдалось с деконволюции микроскопом DeltaVision реставрации. GFP-выражения S. Typhimurium был одним из локализованных с GP2 на апикальной мембране клеточной плазмы М и в субапикально цитоплазматических везикул (наконечники стрел). Top, апикально. Нижняя и боковые, боковые взгляды. Шкала бар: 10 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Инкубационный период патча лигируют Пейера с бактериальной суспензии, как правило, в течение 1 часа наблюдать бактериальный включения в клетках M. В случае 4 часа инкубации, бактерии часто обнаруживаются в зоне Т-клеток патчей Пейера. Как испаряются изофлуран анестезии ингаляционными мог держать мышей стабильной, времени инкубации патч лигируют Пейера с бактериальной суспензии продолжается до наблюдать бактерии, которые перемещаются в Т-клеточной зоны в патче Пейера. Важным моментом этого эксперимента состоит, чтобы заботиться, чтобы не поцарапать кровеносный сосуд, когда лигирования кишечника. В случае не использования GFP-выразил бактерий, мы могли бы альтернативно использовать флуоресцентно меченых бактерий коммерческими флуоресценции реагента маркировки. Если реагент возможно подавляет бактериальную, который вы хотите использовать, привязанность к молекуле, выраженные на ячейке М, вы должны использовать конкретные первичного антитела, если таковые имеются, для обнаружения включены бактерии.
ontent "> лигируют метод анализа цикла было ранее описано 6, 7 Мы улучшить некоторые моменты этого метода следующим образом:.. 1 изофлюрана используется в качестве обезболивающего средства для поддержания мышей устойчивым 2 около 1 см лигируют кишечной петли в том числе Пейера.. Патч устанавливается. 3. Бактерии рассмотрен клетки М флуоресцентно помеченных флуоресценции реагента маркировки или гиперэкспрессией флуоресцентного белка, такие как GFP. 4. M клеток фолликула связанных эпителия покрытие патч Пейера обнаруживаются целые монтажа immunostainig с анти антитела GP2. 5. Флуоресцентные бактериальных трансцитоза клетками М наблюдаются с помощью конфокальной микроскопического анализа.Мы и другие показали, что различные гетерогенные антигены активно проникнуть в клетки M. Значительное число видов патогенов, включая бактерии рода сальмонелла., Shigella sрр., Yersinia SPP. эксплуатировать М клетки в течение 8-10 хост вторжения. Кроме того, кокковые форме Helicobacter пилори потенциально может перемещать в патч Пейера через клетки M, и это перемещение имеет важное значение для индукции хронического воспаления в желудке 11. С другой стороны, механизмы, посредством которых эти патогены вторгнуться М клетки остаются не полностью выяснены. Мы полагаем, что патч цикл лигируют Пейера анализа является соответствующий экспериментальный метод рассечения взаимодействие между клетками М и патогенных агентов в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить всех членов ЕИБ для развития этой техники. Работа выполнена при частичной поддержке гранта-в-помощь для научных исследований в приоритетных областях "Мембрана Трафик" (HO), и "Матрица инфекционных явлений" (KH), молодых ученых (С. Ф. и KH), а также научных исследований (HO ), а также научных исследований в инновационных областях "Внутриклеточное логистика" (HO), от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Agar Ampicillin- 100 | SIGMA | L5667 | |
| Cy3 mono-Reactive Dye Pack | GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A10168 | |
| Inhalation anesthesia apparatus | Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| Fixation and Permeabilization Solution | BD | 554722 | |
| Anti mouse Glycoprotein 2 antibody | MBL | D278-3 | 200-fold dilution (5μg/ml) |
| Goat Anti-Rat IgG, F(ab')2 fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 112-505-006 | 200-fold dilution (20μg/ml) |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | 50-fold dilution |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration deconvolution microscope | Applied Precision | DeltaVision Core |
References
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
- Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
- Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer's patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
- Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).
- Hase, K. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462, 226-230 (2009).
- Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops. Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).
- Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. Jr M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration. J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).
- Owen, R. L. M cells--entryways of opportunity for enteropathogens. J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).
- Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells. Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).
- Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches. Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).
- Nagai, S. Role of Peyer's patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).
