Summary
एम में एक विशेष कूप जुड़े Peyer पैच कवर उपकला कोशिकाओं पेट जुड़े lymphoid ऊतक में mucosal immunosurveillance के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. यहाँ हम बैक्टीरियल transcytosis के लिए एम कोशिकाओं द्वारा मूल्यांकन पद्धति का वर्णन
Protocol
1. बैक्टीरियल कोशिकाओं की तैयारी
- स्ट्रीक ग्लिसरॉल फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया (जैसे GFP व्यक्त एस typhimurium) लेग पर रखता अगर 100 μg / एम्पीसिलीन मिली युक्त थाली.
- नए लेग माध्यम से 2 मिलीलीटर में लेग रातोंरात अगर संस्कृति से एक ही कॉलोनी.
- 600 एनएम पर 1.0 के ऑप्टिकल घनत्व तक पहुँच जाता है जब तक नए लेग मध्यम और सेते 4.5 मिलीलीटर जीवाणु संस्कृति की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें.
- Centrifugation द्वारा हार्वेस्ट बैक्टीरियल कोशिकाओं (३००० XG, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस).
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 5.0 मिलीलीटर के साथ दो बार धोने.
- पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ बैक्टीरिया गोली Resuspend, और inoculum के रूप में लगभग 10 7 कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) युक्त निलंबन का 50 μl का उपयोग करें.
- Fluorescently लेबल बैक्टीरिया का उपयोग करने के मामले में, बैक्टीरियल कोशिकाओं प्रतिदीप्ति लेबलिंग अभिकर्मक द्वारा मानक प्रोटोकॉल के अनुसार लेबल रहे थे.
2. एकnesthesia
- 5% (v / v) के साथ एक छोटे से प्लास्टिक बॉक्स (10 x 10 x 5 सेमी) भरें isoflurane हवा (: 200 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह दर) के साथ मिश्रित vaporized
- Anesthetize आठ बॉक्स में सोलह कमजोर पुराने नर या मादा चूहों.
- एक शव परीक्षा तालिका संज्ञाहरण के बाद चूहों ले जाएँ.
- (चित्रा 1): लगातार 2% (v / v) के द्वारा चूहों anesthetize isoflurane हवा (200 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह दर) के साथ मिश्रित vaporized यह एक टर्मिनल प्रक्रिया है.
3. Ligated है Peyer पैच पाश परख
- पेट की त्वचा और उसके बाद के पाछना 1cm एक anesthetized माउस के पेट पेरिटोनियम कटौती और छोटे Peyer पैच युक्त आंत बाहर ले.
- सिलाई के धागे के साथ आंत कटी घमनी को बांधना, देखभाल लेने के लिए रक्त वाहिकाओं से बचने. नोट: केवल आंत की बाँध एक तरफ, और दूसरे पक्ष को ढीला छोड़.
- Ligated Peyer पैच पाश में ढीला पर जीवाणु निलंबन या एक सिरिंज के साथ पीबीएस (नियंत्रण) के 50 μl इंजेक्षनआंत का आईडीई (चित्रा 2).
- ढीले ओर बाँध, और एक क्लिप के साथ माउस पेट बंद.
- 1 घंटे के बाद, ligated Peyer पैच पाश को हटाने, और गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था द्वारा माउस euthanize.
- Ligated Peyer पैच पाश से आबकारी Peyer पैच.
- पीबीएस के 1ml द्वारा एक सुई से जुड़ी अतिरिक्त mucosal तरल पदार्थ और बैक्टीरिया को दूर सिरिंज का उपयोग के साथ Peyer पैच के शिखर की ओर चमकती. Peyer पैच एक अतिरिक्त दो बार चमकती.
4. पूरे माउंट धुंधला हो जाना और Peyer पैच के confocal सूक्ष्म विश्लेषण
- BD / Cytofix Cytoperm 1 घंटे के लिए बर्फ पर समाधान में Peyer पैच को ठीक करें.
- है Peyer पैच 1ml / पेर्म 5 मिनट के लिए बफर धो बी.डी. के साथ तीन बार धो और तब अवरुद्ध 30 पर मिनट के लिए 0.1 (/ w ध्)% saponin, 0.2% (/ w ध्) पीबीएस में BSA युक्त बफर के 1 मिलीलीटर के साथ ब्लॉक बर्फ.
- 200 गुना पतला विरोधी माउस GP2 नमूना करने के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए (5 / μg मिलीलीटर) में जोड़ेंएम कोशिकाओं.
- 4 पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे या रात भर के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार धो, तो 200 गुना पतला विरोधी चूहा आईजीजी DyLight549 नमूना (20 μg / मिलीलीटर) के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ें.
- 2 बजे के लिए बर्फ पर नमूना सेते हैं.
- ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार धो, तो नमूना 50 गुना पतला Alexa 633 संयुग्मित Phalloidin जोड़ने के लिए एफ actin का पता लगाने.
- 2 बजे के लिए बर्फ पर सेते हैं.
- ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ हल्के से धो लें. तो किसी स्लाइड पर परिपत्र कवर कांच के तीन से चार टुकड़े जगह है, और स्लाइड (चित्रा 3) पर पीबीएस में एक ग्लिसरॉल के 30% समाधान में नमूनों को एम्बेड .
- डीएम IRE2 लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग या एक DeltaVision बहाली deconvolution खुर्दबीन के साथ नमूनों का निरीक्षण.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
एक माउस के नमूना उदाहरण typhi GFP-एस के साथ Peyer पैच पाश परख ligatedmurium DeltaVision बहाली deconvolution माइक्रोस्कोप (चित्रा 4) के साथ मनाया गया . GFP-एस typhimurium GP2 + एम कोशिकाओं द्वारा transcytosed है. एक माउस Peyer पैच आंतों पाश परख खानेवाला या रोगजनक बैक्टीरिया की तरह है कि एम कोशिकाओं द्वारा transcytosed किया जा सकता है है की पहचान कर सकते हैं.
चित्रा 1 vaporized isoflurane शर्त के तहत चूहों की संज्ञाहरण. Vaporized isoflurane एक संज्ञाहरण समर्पित तंत्र (बाईं ओर) के द्वारा आपूर्ति की गई थी.
चित्रा 2 ligated Peyer पैच आंतों पाश परख का सारांश. आंत की ढीली तरफ फ्लोरोसेंट जीवाणु निलंबन सिरिंज द्वारा ligated Peyer पैच पाश में इंजेक्ट किया गया था.
चित्रा 4 typhimurium GFP-एस के साथ Peyer पैच पाश परख ligated माउस का उदाहरण है. GP2, जो एम सेल विशिष्ट 5 मार्कर के रूप में रिपोर्ट है विरोधी माउस GP2 एंटीबॉडी (लाल) के साथ दाग नमूना था. DeltaVision बहाली deconvolution खुर्दबीन के साथ मनाया गया था . GFP-व्यक्त एस typhimurium एम सेल के शिखर प्लाज्मा झिल्ली पर और subapical cytoplasmic vesicles (arrowheads) में GP2 के साथ सह स्थानीयकृत . शीर्ष, शिखर दृश्य. नीचे और साइड, पार्श्व दृश्य. स्केल पट्टी: 10 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
जीवाणु निलंबन के साथ ligated है Peyer पैच के ऊष्मायन समय 1 घंटे के लिए आम तौर पर एम कोशिकाओं में बैक्टीरिया निगमन का पालन करने के लिए. 4 बजे ऊष्मायन के मामले में, जीवाणु अक्सर Peyer पैच की टी सेल के क्षेत्र में पाया जाता है. Vaporized isoflurane inhalant संज्ञाहरण के रूप में चूहों को स्थिर रख सकता है, जीवाणु निलंबन के साथ ligated Peyer पैच के ऊष्मायन समय जीवाणु जो Peyer पैच में टी सेल क्षेत्र में कदम का पालन करने के लिए बढ़ाई है. इस प्रयोग के महत्वपूर्ण बिंदु को ध्यान रखना रक्त वाहिका खरोंच नहीं है जब आंत ligating है. GFP-व्यक्त बैक्टीरिया का उपयोग नहीं के मामले में, हम वैकल्पिक रूप से वाणिज्यिक प्रतिदीप्ति लेबलिंग अभिकर्मक द्वारा fluorescently लेबल बैक्टीरिया इस्तेमाल कर सकते हैं. यदि अभिकर्मक संभवतः जीवाणु, जो आप उपयोग करना चाहते एम सेल पर व्यक्त अणु को अनुलग्नक को रोकता है, तो आप विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें यदि उपलब्ध है, शामिल बैक्टीरिया का पता लगाने चाहिए.
ontent "> ligated पाश परख विधि पहले 6, 7 में वर्णित किया गया है हम के रूप में इस विधि के कुछ बिंदुओं में सुधार:.. 1 Isoflurane चूहों स्थिर 2 रखने के लिए एक चतनाशून्य करनेवाली औषधि एजेंट के रूप में प्रयोग किया जाता है लगभग 1 सेमी Peyer है सहित आंतों पाश ligated. पैच अप सेट कर दिया जाता है 3. एम कोशिकाओं द्वारा लिया जीवाणु fluorescently प्रतिदीप्ति लेबलिंग अभिकर्मक द्वारा या जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन overexpressing GFP द्वारा चिह्नित कर रहे हैं. 4. कूप जुड़े Peyer पैच कवर उपकला में एम कोशिकाओं के साथ पूरे माउंट immunostainig द्वारा पता चला रहे हैं विरोधी GP2 एंटीबॉडी 5. एम कोशिकाओं द्वारा प्रतिदीप्त बैक्टीरियल transcytosis confocal सूक्ष्म विश्लेषण के द्वारा मनाया जाता है.हम और दूसरों को दिखा दिया है कि विविध heterogenous प्रतिजनों सक्रिय एम कोशिकाओं में प्रवेश पाने के. साल्मोनेला एसपीपी सहित रोगजनकों के पर्याप्त संख्या है. शिगेला एसपीपी, Yersinia एसपीपी. मेजबान आक्रमण 8-10 के लिए एम कोशिकाओं शोषण. इसके अलावा, Helic के गोलाणुवत् फार्मobacter पाइलोरी एम कोशिकाओं के माध्यम से Peyer पैच में संभावित टसकाना कर सकते हैं और इस स्थानान्तरण 11 पेट में जीर्ण सूजन के शामिल होने के लिए आवश्यक है. दूसरी ओर, तंत्र है जिसके द्वारा इन रोगज़नक़ों एम कोशिकाओं पर आक्रमण के लिए पूरी तरह से elucidated रहते हैं. हमारा सुझाव है कि ligated Peyer पैच पाश परख एम और vivo में कोशिकाओं रोगजनक एजेंटों के बीच परस्पर क्रिया विदारक के लिए एक उपयुक्त प्रयोगात्मक विधि है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए इस तकनीक के विकास के लिए सभी EIB सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस शोध में भाग प्राथमिकता क्षेत्रों "झिल्ली आवागमन (हो), और संक्रामक घटना की मैट्रिक्स '(के.एच.), युवा वैज्ञानिकों (एस एफ और के.एच.), और वैज्ञानिक अनुसंधान (हो पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान सहायता के द्वारा समर्थित किया गया था ), और अभिनव (हो) से शिक्षा मंत्रालय, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी जापान के "Intracellular रसद" क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Agar Ampicillin- 100 | SIGMA | L5667 | |
| Cy3 mono-Reactive Dye Pack | GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A10168 | |
| Inhalation anesthesia apparatus | Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| Fixation and Permeabilization Solution | BD | 554722 | |
| Anti mouse Glycoprotein 2 antibody | MBL | D278-3 | 200-fold dilution (5μg/ml) |
| Goat Anti-Rat IgG, F(ab')2 fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 112-505-006 | 200-fold dilution (20μg/ml) |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | 50-fold dilution |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration deconvolution microscope | Applied Precision | DeltaVision Core |
References
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
- Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
- Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer's patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
- Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).
- Hase, K. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462, 226-230 (2009).
- Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops. Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).
- Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. Jr M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration. J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).
- Owen, R. L. M cells--entryways of opportunity for enteropathogens. J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).
- Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells. Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).
- Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches. Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).
- Nagai, S. Role of Peyer's patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).
