Summary
Células M em um epitélio folículo-associados especializados que cobrem as placas de Peyer desempenhar um papel importante para a vigilância imunológica da mucosa intestinal em tecido linfóide associado. Aqui descrevemos o método de avaliação para transcitose bacteriana por células M
Abstract
O interior do nosso intestino é habitado, com grande número de bactérias comensais. A superfície da mucosa do trato gastrointestinal é constantemente exposta a eles e, ocasionalmente, a patógenos. O tecido linfóide associado ao intestino (GALT) desempenham um papel fundamental para a indução da resposta imune da mucosa a estes micróbios 1, 2. Para iniciar a resposta imune da mucosa, os antígenos da mucosa devem ser transportados a partir da luz intestinal através da barreira epitelial em folículos linfóides organizados, tais como placas de Peyer. Este transcitose antígeno é mediada por células especializadas M epiteliais 3, 4. As células M são atípicos células epiteliais que fagocitam ativamente macromoléculas e micróbios. Ao contrário das células dendríticas (DCs) e macrófagos, antígenos que têm como alvo a lisossomos para degradação, as células M transcytose principalmente os antígenos internalizado. Este transcitose macromolecular vigorosa através de células M oferece antígeno ao subjacente organizado folículos linfóides umd acredita-se ser essencial para dar início antígeno específico da mucosa respostas imunes. No entanto, os mecanismos moleculares promover esta absorção de antígenos por células M são em grande parte desconhecido. Temos relatado anteriormente que glicoproteína 2 (GP2), especificamente expressos na membrana plasmática apical das células M entre os enterócitos, serve como um receptor transcytotic para um subconjunto de comensais e patogênicos enterobactérias, incluindo Escherichia coli e Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium ), ao reconhecer FimH, um componente do tipo I pili na membrana externa bacteriana 5. Aqui, apresentamos um método para a aplicação de um ensaio de Peyer rato ciclo de patch para avaliar a absorção intestinal de bactérias pelas células M. Este método é uma versão melhorada do ensaio de loop do mouse intestinal descrito anteriormente 6, 7. Os pontos de melhoria são as seguintes: 1. Isoflurano foi usado como um agente anestésico. 2. Aproximadamente 1 cm incluindo alça ligada intestinalremendo ing Peyer foi criada. 3. Bactérias absorvidas pelas células M foram marcados por fluorescente reagente rotulagem de fluorescência ou por superexpressão da proteína fluorescente como a proteína verde fluorescente (GFP). 4. Células M no epitélio folicular associada cobrindo mancha de Peyer foram detectadas por todo o monte immunostainig com o anticorpo anti Gp2. 5. Fluorescentes transcitose bacteriana por células M foram observados por análise microscópica confocal. Corrigir o Peyer rato ensaio de alça intestinal poderia fornecer a resposta que tipo de bactérias patogênicas ou comensais transcytosed pelas células M, e pode nos levar a entender o mecanismo molecular de como estimular o sistema imunológico da mucosa através de células M.
Protocol
1. Preparação de células bacterianas
- Glicerol Streak abastecido bactérias fluorescentes (GFP como expressar S. Typhimurium) em uma placa de ágar LB contendo 100 mg / ml de ampicilina.
- Cultura colônia a partir de um único agar LB durante a noite em 2 ml de meio LB novo.
- Adicionar 0,5 ml de cultura bacteriana e 4,5 ml de meio LB e incubar novos até densidade óptica de 1,0 a 600 nm é atingido.
- Células bacterianas colheita por centrifugação (3.000 xg, 5 min, 4 ° C).
- Desprezar o sobrenadante e lavar duas vezes com 5,0 ml de solução salina estéril tampão fosfato (PBS).
- Ressuspender pellet de bactérias com 5 ml de PBS, e usar 50 ul da suspensão contendo cerca de 10 7 unidades formadoras de colônia (UFC) como o inóculo.
- No caso de utilizar bactérias fluorescente etiquetado, as células bacterianas foram marcados por fluorescência reagente rotulagem de acordo com protocolo padrão.
2. Anesthesia
- Encha uma pequena caixa de plástico (10 x 10 x 5 cm) com 5% (v / v) isoflurano vaporizado misturado com o ar (vazão: 200 ml / min).
- Anestesiar oito a dezesseis fraco de idade, os ratos machos ou fêmeas na caixa.
- Mova o rato para uma mesa de autópsia após a anestesia.
- Continuamente anestesiar os ratos de 2% (v / v) isoflurano vaporizado misturado com o ar (vazão: 200 ml / min) (Figura 1). Este é um procedimento terminal.
3. Ensaio de Peyer ligada a alça de patch
- 1 centímetro inciso da pele abdominal e depois cortar o peritônio abdominal de um rato anestesiado e tirar o intestino delgado, contendo o patch de Peyer.
- Ligadura do intestino com fios de costura, tendo o cuidado de evitar vasos sanguíneos. Nota: apenas ligam um lado do intestino, e deixar o outro lado solto.
- Injetar 50 mL de suspensão bacteriana ou PBS (controle) com uma seringa em loop Peyer ligada a mancha na s soltaide do intestino (Figura 2).
- Bind lado solto, e perto do abdômen do rato com um clipe.
- Após 1 h, retire o loop de patch ligada Peyer, e euthanize o mouse por deslocamento cervical.
- Remendo Peyer consumo a partir de loop Peyer ligada a patch.
- Piscando do lado apical do patch de Peyer por 1 ml de PBS com o uso de seringa conectada a uma agulha para retirar líquido da mucosa em excesso e bactérias. Piscando o patch de Peyer um adicional de duas vezes.
4. Coloração montagem toda e análise microscópica confocal do patch de Peyer
- Fix patch de Peyer no BD solução Cytofix / Cytoperm em gelo por 1 hora.
- Lavar correção de Peyer três vezes com 1 ml de BD Perm / Tampão de lavagem por 5 min, e então bloco com 1 ml de tampão de bloqueio contendo 0,1% (w / v) saponina, 0,2% (w / v) BSA em PBS por 30 min em gelo.
- Adicionar 200 vezes diluído anti-rato GP2 anticorpo monoclonal (5 mg / ml) para a amostra para detectarCélulas M.
- Incubar por 2 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Lavar três vezes com 1 ml de frio PBS, em seguida, adicione 200 vezes diluído anti-rato IgG conjugado com DyLight549 (20 mcg / ml) com o modelo.
- Incubar amostra em gelo por 2 horas.
- Lavar três vezes com 1 ml de frio PBS, em seguida, adicione 50 vezes diluída Alexa 633 faloidina conjugado com o modelo para detectar F-actina.
- Incubar no gelo por 2 hrs.
- Lave suavemente com 1 ml de frio PBS. Em seguida, coloque 3-4 pedaços de vidro da tampa circular em um slide, e incorporar as amostras em uma solução de 30% de glicerol em PBS na lâmina (Figura 3).
- Observar espécimes com um microscópio de varredura confocal DM-IRE2 laser ou um microscópio DeltaVision deconvolução Restauração.
5. Resultados representativos:
O exemplo de amostra de um rato ligado ensaio de Peyer ciclo patch com GFP-S. Typhimurium foi observada com um microscópio deconvolução Restauração DeltaVision (Figura 4). GFP-S. Typhimurium é transcytosed pela GP2 células + M. Um patch Peyer rato ensaio de alça intestinal pode identificar o tipo de bactérias comensais ou patogênicos que podem ser transcytosed pelas células M.
Figura 1. Anestesia de ratos sob condição isoflurano vaporizado. Isoflurano vaporizado foi fornecido por um aparelho de anestesia dedicada (lado esquerdo).
Figura 2. Resumo do ensaio Peyer ligadura de alça intestinal de patch. A suspensão bacteriana foi fluorescentes injetado por seringa no circuito ligado Peyer do patch do lado solto do intestino.
Figura 4. Exemplo de um rato ligado ensaio de Peyer ciclo patch com GFP-S. Typhimurium. GP2, que é relatado como marcador de células específicas M 5, foi corado com anticorpos anti-rato GP2 (Red). O espécime foi observado com um microscópio deconvolução DeltaVision Restauração. GFP-expressando S. Typhimurium foi co-localizada com GP2 na membrana plasmática apical de células M e nas vesículas subapical citoplasmática (setas). Ponto de vista, superior apical. Fundo e laterais, vista lateral. Barra de escala: 10 mM.
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Discussion
O tempo de incubação do patch Peyer ligada com suspensão bacteriana é geralmente para 1 hora de observar a incorporação de bactérias nas células M. Em caso de 4 horas de incubação, as bactérias são muitas vezes detectados na zona de células T de placas de Peyer. Como a anestesia inalatória com isoflurano vaporizado poderia manter ratos estável, o tempo de incubação do patch Peyer ligada com suspensão bacteriana é extensível para observar as bactérias que se movem em T-cell zona no patch de Peyer. O ponto importante deste experimento é tomar cuidado para não arranhar o vaso sanguíneo quando ligadura do intestino. No caso de não usar GFP-expressa bactérias, podemos alternativamente usar bactérias fluorescente etiquetado pelo reagente de rotulagem comercial de fluorescência. Se o reagente possivelmente inibe a bacteriana, o que você quer usar, o apego à molécula expressa em células M, você deve usar o anticorpo específico primário, se disponível, para detectar as bactérias incorporadas.
ONTEÚDO "> O método de ensaio ligada loop foi descrito anteriormente 6, 7 Nós melhoramos alguns pontos deste método da seguinte forma:.. 1 isoflurano é usado como um agente anestésico para manter os ratos constante 2 Aproximadamente um centímetro ligada alça intestinal incluindo Peyer.. patch é criada. 3. bactérias absorvidas pelas células M são fluorescente etiquetado pelo reagente de rotulagem de fluorescência ou por superexpressão da proteína fluorescente como a GFP. 4. células M no epitélio folicular associada cobrindo mancha de Peyer são detectadas por todo o monte immunostainig com anticorpos anti Gp2. 5. transcitose bacteriana fluorescentes pelas células M são observadas através da análise microscópica confocal.Nós e os outros têm demonstrado que diversos antígenos heterogêneos ativamente entrar nas células M. Um número substancial de patógenos, incluindo Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp. explorar as células M por 8-10 invasão host. Além disso, a forma de cocóide Helicobacter pylori pode potencialmente translocar para correção de Peyer via células M, e esta translocação é essencial para a indução da inflamação crônica no estômago 11. Por outro lado, os mecanismos pelos quais estes patógenos invadem as células M ainda não foram totalmente elucidadas. Nós sugerimos que o ensaio de Peyer do circuito ligado patch é um método apropriado experimental para dissecar a interação entre as células M e agentes patogênicos in vivo.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do BEI para o desenvolvimento desta técnica. Esta pesquisa foi apoiada em parte por Grant-in-Aid para a Investigação Científica em Áreas Prioritárias "Traffic Membrane" (HO), e "Matriz de Fenômenos Infecciosas" (KH), Jovens Cientistas (SF e KH), e da Investigação Científica (HO ), Investigação Científica e em áreas inovadoras "Logística intracelular" (HO), do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Agar Ampicillin- 100 | SIGMA | L5667 | |
| Cy3 mono-Reactive Dye Pack | GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A10168 | |
| Inhalation anesthesia apparatus | Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| Fixation and Permeabilization Solution | BD | 554722 | |
| Anti mouse Glycoprotein 2 antibody | MBL | D278-3 | 200-fold dilution (5μg/ml) |
| Goat Anti-Rat IgG, F(ab')2 fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 112-505-006 | 200-fold dilution (20μg/ml) |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | 50-fold dilution |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration deconvolution microscope | Applied Precision | DeltaVision Core |
References
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