Summary
M-cellen in een gespecialiseerde follikel geassocieerd epitheel die plaques van Peyer spelen een belangrijke rol voor de mucosale immunosurveillance in de darm-geassocieerd lymfoïd weefsel. Hier hebben we beschreven evaluatiemethode voor bacteriële transcytose door M-cellen
Abstract
De binnenkant van onze darmen wordt bewoond met een enorm aantal van de commensale bacteriën. De mucosale oppervlak van het maag-darmkanaal is continu blootgesteld aan hen en af en toe aan pathogenen. De darm-geassocieerd lymfeweefsel (GALT) spelen een belangrijke rol voor de inductie van de mucosale immuunrespons op deze microben 1, 2. Tot inleiding van de mucosale immuunrespons, moet de mucosale antigenen worden vervoerd van de darm lumen over de epitheliale barrière in georganiseerde lymfoïde follikels zoals de plaques van Peyer. Dit antigeen transcytose wordt gemedieerd door gespecialiseerde epitheliale cellen M 3, 4. M-cellen zijn atypische epitheelcellen die actief fagocyteren macromoleculen en microben. In tegenstelling tot dendritische cellen (DC's) en macrofagen, die zich richten op antigenen te lysosomen voor degradatie, M cellen voornamelijk transcytose de geïnternaliseerde antigenen. Deze krachtige macromoleculaire transcytose door M cellen levert antigeen naar de onderliggende organisatie lymfoïde follikels eend wordt verondersteld essentieel te zijn voor het initiëren antigeen-specifieke mucosale immuunrespons. Echter, de moleculaire mechanismen ter bevordering van dit antigeen opname door M-cellen zijn grotendeels onbekend. We hebben eerder gemeld dat glycoproteïne 2 (GP2), in het bijzonder uitgedrukt op de apicale plasmamembraan van de M-cellen onder de enterocyten, dient als een transcytotic receptor voor een subset van commensale en pathogene enterobacteriën, waaronder Escherichia coli en Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium ), door het herkennen FimH, een component van type I pili op het bacteriële buitenste membraan 5. Hier presenteren we een methode voor de toepassing van de pleister een muis Peyer's intestinale loop-test voor bacteriële opname te evalueren door M-cellen. Deze methode is een verbeterde versie van de muis intestinale loop test eerder beschreven 6, 7. De verbeterde punten zijn als volgt: 1. Isofluraan werd gebruikt als een anestheticum. 2. Ongeveer 1 cm geligeerde darm-lus inclusiefING Peyer's patch werd opgericht. 3. Bacteriën door M cellen genomen werden fluorescent gelabeld door fluorescentie etikettering reagens of door overexpressie fluorescerend eiwit zoals groen fluorescerend eiwit (GFP). 4. M-cellen in de follikel-geassocieerde epitheel die Peyer's patch werden gedetecteerd door middel van volledige mount immunostainig met anti GP2 antilichaam. 5. Fluorescerende bacteriën transcytose door M-cellen werden waargenomen door confocale microscopische analyse. De muis Peyer's patch intestinale loop-test zou kunnen leveren is het antwoord wat voor soort commensale of pathogene bacteriën transcytosed door M-cellen, en kan ons naar het moleculaire mechanisme van hoe mucosale immuunsysteem te stimuleren door middel van M cellen te begrijpen leiden.
Protocol
1. Voorbereiding van de bacteriële cellen
- Streak glycerol gevulde fluorescerende bacteriën (zoals GFP uiten van S. Typhimurium) op LB-agar een plaat met 100 ug / ml ampicilline.
- Cultuur een enkele kolonie van LB agar 's nachts in 2 ml van de nieuwe LB-medium.
- Voeg 0,5 ml van de bacteriecultuur tot 4,5 ml van de nieuwe LB medium en incubeer tot de optische dichtheid van 1.0 bij 600 nm is bereikt.
- Oogst bacteriële cellen door centrifugeren (3000 xg, 5 min, 4 ° C).
- Verwijder het supernatant en was tweemaal met 5,0 ml van de steriele fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
- Resuspendeer bacteriële pellet met 5 ml PBS en 50 ui het gebruik van de suspensie die ongeveer 10 7 kolonie vormende eenheid (CFU) als het inoculum.
- In het geval van het gebruik van fluorescent gelabelde bacteriën werden de bacteriële cellen gelabeld met behulp van fluorescentie labeling reagens volgens standaard protocol.
2. Eennesthesia
- Vul een klein plastic doosje (10 x 10 x 5 cm) met 5% (v / v) verdampt isofluraan gemengd met lucht (debiet: 200 ml / min).
- Verdoven acht-tot zestien-zwakke-oude mannelijke of vrouwelijke muizen in de doos.
- Verplaats de muizen om een autopsie tafel na de anesthesie.
- Continu de muizen verdoven met 2% (v / v) verdampt isofluraan gemengd met lucht (debiet: 200 ml / min) (figuur 1). Dit is een terminal procedure.
3. Geligeerde Peyer's patch loop-test
- Incise 1 cm van de buikhuid en snijd de buik buikvlies van een verdoofde muis en nemen de dunne darm met de Peyer's patch.
- Afbinden van de darm met naaigaren en zorg ervoor dat de bloedvaten te voorkomen. Let op: slechts binden de ene kant van de darm, en los laat de andere kant.
- Injecteer 50 ul van bacteriële schorsing of PBS (controle) met een spuit in patch geligeerde Peyer's loop op de losse side van de darm (figuur 2).
- Bind losse kant, en sluit de muis buik met een clip.
- Na 1 uur, verwijder de geligeerde Peyer's patch loop, en euthanaseren van de muis door cervicale dislocatie.
- Accijnzen Peyer's patch van patch geligeerde Peyer's loop.
- Knipperen de apicale kant van de pleister Peyer's door 1ml PBS met het gebruik van injectiespuit bevestigd aan een naald om het overtollige vocht mucosale en bacteriën te verwijderen. Knipperen van de Peyer's patch een extra twee keer.
4. Hele berg vlekken en confocale microscopische analyse van patch Peyer's
- Fix Peyer's vlek in BD Cytofix / Cytoperm oplossing op ijs gedurende 1 uur.
- Was Peyer's patch drie keer met 1 ml van de BD Perm / Wash buffer voor 5 min, en dan blok met 1 ml van het blokkeren van buffer die 0,1% (w / v) saponine, 0.2% (w / v) BSA in PBS gedurende 30 minuten op ijs.
- Voeg 200-voudig verdunde anti-muis GP2 monoklonaal antilichaam (5 pg / ml) met het model op te sporenM-cellen.
- Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Was driemaal uit met 1 ml koud PBS, voeg vervolgens 200-voudig verdunde anti-rat IgG antilichaam geconjugeerd met DyLight549 (20 pg / ml) met het model.
- Incubeer het monster op ijs gedurende 2 uur.
- Was driemaal uit met 1 ml koud PBS, voeg dan 50-voudig verdund Alexa 633 geconjugeerd Phalloidin met het model aan F-actine te detecteren.
- Incubeer op ijs gedurende 2 uur.
- Wassen lichtjes met 1 ml koud PBS. Dan plaats drie tot vier stukken van ronde deksel glas op een dia, en insluiten van de exemplaren in een 30% oplossing van glycerol in PBS op de dia (figuur 3).
- Let op exemplaren met een DM-IRE2 confocale laser scanning microscoop of een DeltaVision Restauratie deconvolutie microscoop.
5. Representatieve resultaten:
Het specimen voorbeeld van een muis geligateerd Peyer's patch loop test met GFP-S. typhimurium werd waargenomen met een DeltaVision Restoration deconvolutie microscoop (figuur 4). GFP-S. typhimurium is transcytosed door GP2 + M cellen. Een muis Peyer's patch intestinale loop test kan identificeren van de soort van commensale of pathogene bacteriën die kunnen worden transcytosed door M-cellen.
Figuur 1. Anesthesie van de muizen onder verdampt isofluraan voorwaarde. Verdampt isofluraan werd geleverd door een anesthesie-dedicated apparaat (linkerkant).
Figuur 2. Samenvatting van de patch afgebonden Peyer's intestinale loop test. De fluorescerende bacteriële suspensie werd geïnjecteerd door de spuit in patch geligeerde Peyer's lus op de losse zijde van de darm.
Figuur 4. Voorbeeld van een muis geligateerd Peyer's patch loop test met GFP-S. Typhimurium. GP2, dat wordt gerapporteerd als M cel-specifieke marker 5, werd gekleurd met anti-muis antilichaam GP2 (rood). Het monster werd waargenomen met een DeltaVision Restoration deconvolutie microscoop. GFP-expressie S. Typhimurium was co-gelokaliseerde met GP2 op het apicale plasmamembraan van M cel en in de subapical cytoplasmatische blaasjes (pijlpunten). Top, apicale bekijken. Onder-en zijkant, lateraal uitzicht. Schaal bar: 10 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De incubatietijd van de patch afgebonden Peyer met bacteriële suspensie wordt meestal gedurende 1 uur om de bacteriële opname te observeren in de M-cellen. In het geval van 4 uur incubatie worden de bacteriën vaak gedetecteerd in de T cel zone van de plaques van Peyer. Omdat de verdampte isofluraan inhalatie-anesthesie kon houden muizen stabiel, de incubatietijd van de patch afgebonden Peyer met bacteriesuspensie is uitbreidbaar naar de bacteriën die verhuizen naar T-cel-zone in patch Peyer te observeren. Het belangrijkste punt van dit experiment is om te zorgen dat u de bloedvat krassen wanneer ligeren van de darm. In het geval van niet te GFP tot expressie bacteriën gebruiken, kunnen we als alternatief gebruik van fluorescent gelabelde bacteriën door commerciële fluorescentie labeling reagens. Als het reagens mogelijk remt de bacteriële, die u wilt gebruiken, gehechtheid aan het molecuul tot expressie gebracht op M cel, moet u gebruik maken van de specifieke primaire antilichaam, indien beschikbaar, om de opgenomen bacteriën op te sporen.
NHOUD "> Het geligeerde loop assay methode werd eerder beschreven 6, 7 We hebben een aantal punten van deze methode te verbeteren als volgt:.. 1 Isofluraan wordt gebruikt als een anestheticum voor het houden van de muizen gestage 2 ongeveer 1 cm geligeerde darm-lus inclusief Peyer's.. Patch is ingesteld. 3. Bacteriën door M-cellen genomen zijn, fluorescent gelabeld door fluorescentie etikettering reagens of door overexpressie fluorescerend eiwit, zoals GFP. 4. M cellen in de follikel-geassocieerde epitheel die Peyer's patch worden gedetecteerd door middel van volledige mount immunostainig met anti GP2 antilichaam. 5. Fluorescent bacteriële transcytose door M-cellen worden waargenomen door confocale microscopische analyse.Wij en anderen hebben aangetoond dat diverse heterogene antigenen actief binnenkomst in M cellen te krijgen. Een aanzienlijk aantal van pathogenen zoals Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp. exploiteren M cellen voor host invasie 8-10. Bovendien is de coccoid vorm van Helicobacter pylori kunnen mogelijk verplaatsen in de patch Peyer's via M-cellen, en deze translocatie is essentieel voor de inductie van chronische ontsteking in de maag 11. Aan de andere kant, de mechanismen waarmee deze ziekteverwekkers binnendringen M cellen nog volledig opgehelderd. Wij stellen voor dat het geligeerde Peyer's patch loop-test is een geschikte experimentele methode voor het ontleden van de wisselwerking tussen M-cellen en ziekteverwekkers in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag alle EIB-leden bedanken voor het ontwikkelen van deze techniek. Dit onderzoek werd mede ondersteund door Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek op prioritaire gebieden "Membrane Traffic" (HO), en de "Matrix van infectieuze Phenomena" (KH), Young Scientists (SF en KH), en Wetenschappelijk Onderzoek (HO ), en Wetenschappelijk Onderzoek over innovatieve Areas "Intracellulaire Logistics" (HO), van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Agar Ampicillin- 100 | SIGMA | L5667 | |
| Cy3 mono-Reactive Dye Pack | GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A10168 | |
| Inhalation anesthesia apparatus | Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| Fixation and Permeabilization Solution | BD | 554722 | |
| Anti mouse Glycoprotein 2 antibody | MBL | D278-3 | 200-fold dilution (5μg/ml) |
| Goat Anti-Rat IgG, F(ab')2 fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 112-505-006 | 200-fold dilution (20μg/ml) |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | 50-fold dilution |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration deconvolution microscope | Applied Precision | DeltaVision Core |
References
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
- Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
- Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer's patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
- Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).
- Hase, K. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462, 226-230 (2009).
- Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops. Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).
- Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. Jr M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration. J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).
- Owen, R. L. M cells--entryways of opportunity for enteropathogens. J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).
- Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells. Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).
- Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches. Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).
- Nagai, S. Role of Peyer's patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).
