Anvendelse av en Mouse Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay å evaluere Bakteriell Opptak av M celler

Summary

M celler i et spesialisert follicle-assosiert epitel dekker Peyer er patcher spiller en viktig rolle for mucosal immunosurveillance i gut-assosiert lymfoid vev. Her har vi beskrev evalueringsmetode for bakteriell transcytosis av M celler

Abstract

Innsiden av tarmen vår er bebodd med enorme antall commensal bakterier. Mucosal overflaten av gastrointestinaltraktus er kontinuerlig utsatt for dem og noen ganger til patogener. Tarmen-assosiert lymfoid vev (Galt) spiller en nøkkelrolle for induksjon av mucosal immunresponsen på disse mikrobene ^{1, 2.} For å starte mucosal immunrespons, må mucosal antigener skal transporteres fra tarmen lumen over epiteliale barriere i organiserte lymfoide follikler som Peyer er patcher. Dette antigen transcytosis er mediert av spesialiserte epitelceller M celler ^{3, 4.} M celler er atypiske epiteliale celler som aktivt phagocytose makromolekyler og mikrober. I motsetning til dendrittiske celler (DCS) og makrofager som mål antigener til lysosomer for nedbrytning, M celler hovedsakelig transcytose den internaliserte antigener. Dette livskraftige macromolecular transcytosis gjennom M celler leverer antigen til den underliggende organiserte lymfoide follikler end antas å være avgjørende for å initiere antigen-spesifikke slimhinnene immunrespons. Men de molekylære mekanismene som fremmer dette antigen opptak av M celler er i stor grad ukjent. Vi har tidligere rapportert at glykoprotein 2 (GP2), spesifikt uttrykt på den apikale plasma membran av M celler blant enterocytter, fungerer som et transcytotic reseptor for en undergruppe av commensal og patogene enterobacteria, inkludert Escherichia coli og Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium ), ved å anerkjenne FimH, en komponent av type I pili på bakteriens ytre membran ^5. Her presenterer vi en metode for anvendelse av en mus Peyer er patch intestinal sløyfe analysen å vurdere bakteriell opptak av M celler. Denne metoden er en forbedret versjon av musa intestinal sløyfe analysen tidligere beskrevet ^{6, 7.} Den forbedrede punktene er som følger: 1. Isofluran ble brukt som anestesimiddel. 2. Ca 1 cm ligated intestinal sløyfe inkluing Peyer sin patch ble satt opp. 3. Bakterier tatt opp av M celler ble fluorescensmerkede av fluorescens merking reagens eller ved overekspresjon fluorescerende protein som grønn fluorescerende protein (GFP). Fire. M cellene i hårsekken-assosiert epitel dekker Peyer sin lapp ble oppdaget av hel-mount immunostainig med anti GP2 antistoff. 5. Fluorescent bakteriell transcytosis av M celler ble observert av confocal mikroskopisk analyse. Musen Peyer er patch intestinal sløyfe analysen kunne levere svaret hva slags commensal eller sykdomsfremkallende bakterier transcytosed av M celler, og kan lede oss til å forstå den molekylære mekanismen for hvordan å stimulere slimhinnene immunforsvaret gjennom M celler.

Protocol

1. Utarbeidelse av bakterieceller

1. Streak glyserol lager selvlysende bakterier (som GFP uttrykke S. Typhimurium) på LB en agar plate som inneholder 100 mikrogram / ​​ml ampicillin.
2. Kultur én koloni fra LB agar natten i 2 ml av nye LB medium.
3. Tilsett 0,5 ml av bakteriell kultur til 4,5 ml av nye LB medium og inkuber til optisk tetthet på 1,0 på 600 nm er nådd.
4. Høste bakterieceller ved sentrifugering (3000 xg, 5 min, 4 ° C).
5. Kast supernatanten og vask to ganger med 5,0 ml steril fosfatbuffer saltløsning (PBS).
6. Resuspender bakteriell pellet med 5 ml PBS, og bruke 50 mL av suspensjonen inneholder cirka 10 ⁷ kolonidannende enhet (CFU) som podestoff.
7. I tilfelle du bruker fluorescensmerkede bakterier ble bakterieceller merket med fluorescens merking reagens i henhold til standard protokoll.

2. Anesthesia

1. Fyll en liten plastboks (10 x 10 x 5 cm) med 5% (v / v) fordampede isofluran blandet med luft (flow rate: 200 ml / min).
2. Anesthetize åtte til seksten-svake gammel mannlig eller kvinnelig mus i boksen.
3. Flytt mus til en obduksjon bordet etter anestesi.
4. Kontinuerlig anesthetize musene med 2% (v / v) fordampede isofluran blandet med luft (flow rate: 200 ml / min) (figur 1). Dette er en terminal prosedyre.

3. Ligated Peyer er patch sløyfe analysen

1. Incise 1 cm av abdominal hud og deretter kutte abdominal peritoneum av en bedøvet mus og ta ut tynntarmen inneholder Peyer sin patch.
2. Ligate tarmen med sy garn, ta vare å unngå blodkar. Merk: bare binde en side av tarmen, og la den andre siden løs.
3. Injiser 50 mL av bakteriell suspensjon eller PBS (kontroll) med en sprøyte inn ligated Peyer sin lapp sløyfe på frifot eide av tarmen (Figur 2).
4. Bind løs side, og lukke musens magen med et klipp.
5. Etter 1 t, fjerne ligated Peyer sin patch loop, og avlive musen ved cervikal forvridning.
6. Avgiftsdirektoratet Peyer er patch fra ligated Peyer sin patch loop.
7. Blinkende den apikale siden av Peyer sin lapp med 1 ml PBS med å bruke sprøyte festet til en nål til å fjerne overflødig slimhinnene væske og bakterier. Flashing av Peyer er patch ytterligere to ganger.

Fire. Hele montere flekker og confocal mikroskopisk analyse av Peyer sin patch

1. Fix Peyer sin lapp i BD Cytofix / Cytoperm løsning på is for 1 hr.
2. Vask Peyer er patch tre ganger med 1 ml BD Perm / Wash buffer for 5 min, og deretter blokk med 1 ml av blokkerende buffer som inneholder 0,1% (w / v) saponin, 0,2% (w / v) BSA i PBS for 30 min på is.
3. Tilsett 200-fold utvannet anti-mus GP2 monoklonalt antistoff (5 mikrogram / ml) til prøven for å oppdageM celler.
4. Inkuber for 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
5. Vask tre ganger med 1 ml kald PBS, deretter legge 200-fold utvannet anti-rotte IgG antistoff konjugert med DyLight549 (20 mikrogram / ml) til prøven.
6. Inkuber sample på is for 2 timer.
7. Vask tre ganger med 1 ml kald PBS, deretter legge til 50-fold utvannet Alexa 633 konjugert Phalloidin til prøven for å oppdage F-aktin.
8. Inkuber på is for 2 timer.
9. Vask forsiktig med 1 ml kald PBS. Deretter plasserer 03:57 stykker av sirkulær dekke glass på et lysbilde, og bygge inn prøver i en 30% løsning av glyserol i PBS på lysbildet (figur 3).
10. Observere prøver med en DM-IRE2 confocal laser scanning mikroskop eller en DeltaVision Restaurering deconvolution mikroskop.

5. Representant Resultater:

Prøven eksempel på en mus ligated Peyer er patch sløyfe analysen med GFP-S. typhimurium ble observert med en DeltaVision Restaurering deconvolution mikroskop (figur 4). GFP-S. Typhimurium er transcytosed av GP2 ⁺ M celler. En mus Peyer er patch intestinal sløyfe analysen kan identifisere hva slags commensal eller sykdomsfremkallende bakterier som kan transcytosed av M celler.

Figur 1. Anesthesia av mus i henhold fordampet isofluran tilstand. Forgasset isofluran ble levert av en anestesi-dedikerte apparater (venstre side).

Figur 2. Sammendrag av ligated Peyer sin patch intestinal sløyfe analysen. Den fluorescerende bakteriell suspensjon ble injisert med sprøyte inn ligated Peyer sin lapp sløyfe på frifot siden av tarmen.

Figur 4. Eksempel på en mus ligated Peyer er patch sløyfe analysen med GFP-S. Typhimurium. GP2, som er rapportert som M celle spesifikk markør ^5, ble farget med anti-mus GP2 antistoff (Red). Prøven ble observert med en DeltaVision Restaurering deconvolution mikroskop. GFP-uttrykke S. Typhimurium ble samlokalisert med GP2 på den apikale plasma membran av M celle og i subapical cytoplasmatiske vesikler (pilspisser). Top, apikal utsikt. Bunn og side, lateral utsikt. Scale bar: 10 mikrometer.

Discussion

Inkubasjonstiden for ligated Peyer sin lapp med bakteriell suspensjon er vanligvis for 1 time å observere den bakterielle innlemmelse i M celler. Ved 4 timer inkubering, er bakteriene ofte påvist i T-celle sonen Peyer sin patcher. Som fordampede isofluran inhalant anestesi kunne holde mus stabil, er det inkubasjonstid på ligated Peyer sin lapp med bakteriell suspensjon utvides til å observere bakterier som flytter inn i T-celle-sonen i Peyer sin patch. Det viktige poenget med dette eksperimentet er å ta forsiktig så du ikke riper i blodåre når ligating tarmen. Når det gjelder å ikke bruke GFP-uttrykt bakterier, kunne vi alternativt bruke fluorescensmerkede bakterier av kommersielle fluorescens merking reagens. Hvis reagenset muligens hemmer bakterier, som du vil bruke, vedlegg til molekylet uttrykkes på M celle, bør du bruke den spesifikke primære antistoff, hvis tilgjengelig, for å oppdage innlemmet bakterier.

ontent "> The ligated sløyfe analysen Metoden ble tidligere beskrevet ^{6, 7} Vi forbedrer noen punkter av denne metoden som følger:.. 1 isofluran brukes som anestesimiddel for å holde musene jevn 2 Ca 1 cm ligated intestinal sløyfe inkludert Peyer tallet.. patch er satt opp. 3. Bakterier tatt opp av M cellene er fluorescensmerkede av fluorescens merking reagens eller ved overekspresjon fluorescerende protein som GFP. 4. M cellene i hårsekken-assosiert epitel dekker Peyer er patch oppdages av hel-mount immunostainig med anti GP2 antistoff. 5. Fluorescent bakteriell transcytosis av M celler blir overholdt av confocal mikroskopisk analyse.

Vi og andre har vist at ulike heterogene antigener aktivt få innpass i M celler. Betydelig antall patogener inkludert Salmonella spp.., Shigella spp.., Yersinia spp.. utnytte M celler for host invasjonen ^8-10. Videre coccoid form av Helicobacter pylori kan potensielt translocate inn Peyer er patch via M celler, og dette translokasjon er avgjørende for induksjon av kronisk betennelse i magen ^11. På den annen side, de mekanismer som disse patogener invadere M celler fortsatt å være fullstendig klarlagt. Vi foreslår at det ligated Peyer er patch sløyfe analysen er et passende eksperimentell metode for å dissekere samspillet mellom M celler og sykdomsfremkallende agens in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Agar Ampicillin- 100	SIGMA	L5667
Cy3 mono-Reactive Dye Pack	GE Healthcare	PA23001
Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A10168
Inhalation anesthesia apparatus	Shinano Seisakusho	SN-487
Fixation and Permeabilization Solution	BD	554722
Anti mouse Glycoprotein 2 antibody	MBL	D278-3	200-fold dilution (5μg/ml)
Goat Anti-Rat IgG, F(ab')2 fragment specific	Jackson ImmunoResearch	112-505-006	200-fold dilution (20μg/ml)
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	50-fold dilution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	DMIRE2
DeltaVision Restoration deconvolution microscope	Applied Precision	DeltaVision Core