Tillämpning av en mus knyts ihop Peyer s Patch Intestinal Loop-analys för att utvärdera Bakteriell Upptag av M celler

Summary

M celler i en specialiserad follikel-associerat epitel täcker Peyers plack spela en viktig roll för slemhinnorna immunosurveillance i tarm-associerad lymfvävnad. Här har vi beskrev utvärderingsmetod för bakteriell transcytos av M celler

Abstract

Insidan av våra tarmar är bebodda med enorma antal bakteriefloran. Den slemhinna i mag-tarmkanalen är ständigt utsatt för dem och ibland för patogener. Tarmen-associerad lymfvävnad (GALT) spelar en viktig roll för induktion av slemhinnor immunsvaret mot dessa mikrober ^{1, 2.} Att inleda slemhinnor immunsvar, måste slemhinnor antigener transporteras från tarmen lumen över epiteliala barriären till organiserad lymfoida folliklar som Peyers plack. Detta antigen transcytos medieras av specialiserade epitelceller M celler ^{3, 4.} M-celler är atypiska epitelceller som aktivt phagocytose makromolekyler och mikrober. Till skillnad från dendritiska celler (DC) och makrofager, som riktar antigener till lysosomer för nedbrytning, M celler transcytose främst internaliseras antigener. Denna kraftfulla makromolekulära transcytos genom M celler levererar antigen till den underliggande organiserade lymfoida folliklar end tros vara nödvändigt för att initiera antigenspecifika slemhinnor immunsvar. Men de molekylära mekanismer som främjar detta antigen upptag av M celler är i stort sett okända. Vi har tidigare rapporterat att glykoprotein 2 (GP2), särskilt uttryckt på den apikala plasmamembranet av M celler bland enterocyterna, fungerar som en transcytotic receptor för en delmängd av kommensala och patogena enterobakterier, inklusive Escherichia coli och Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium ), genom att erkänna FimH, en komponent av typ I Pili på bakteriens yttre membran ^5. Här presenterar vi en metod för tillämpning av en mus Peyer är plåster intestinal loop-analys för att utvärdera bakteriell upptag av M celler. Denna metod är en förbättrad version av musen tarmen slingan test tidigare beskrivits ^{6, 7.} Den förbättrade punkter är följande: 1. Isofluran användes som ett bedövningsmedel. 2. Ca 1 cm knyts ihop intestinal slinga inklusivening Peyer är patch bildades. 3. Bakterier tas upp av M cellerna fluorescerande av fluorescens märkning reagens eller genom att överuttryck av fluorescerande proteinet som grönt fluorescerande protein (GFP). 4. M celler i hårsäcken-associerade epitel täcker Peyer är plåster upptäcktes av hel-mount immunostainig med anti GP2 antikropp. 5. Fluorescerande bakterier transcytos av M celler observerades av konfokala mikroskopisk analys. Musen Peyer är plåster tarm loop-analysen kunde leverera svaret vilken typ av kommensala eller sjukdomsframkallande bakterier transcytosed av M celler, och kan leda oss att förstå den molekylära mekanismen för hur man kan stimulera slemhinnorna immunförsvaret genom M celler.

Protocol

1. Beredning av bakterieceller

1. Streak glycerol lager fluorescerande bakterier (såsom GFP uttrycka S. Typhimurium) på LB en agarplatta som innehåller 100 mikrogram / ​​ml ampicillin.
2. Kultur en enda koloni från LB agar övernattning i 2 ml nytt LB medium.
3. Tillsätt 0,5 ml bakteriekultur till 4,5 ml av nya LB medium och inkubera tills optisk densitet på 1,0 vid 600 nm är nådd.
4. Harvest bakterieceller genom centrifugering (3000 xgi, 5 min, 4 ° C).
5. Kassera supernatanten och tvätta två gånger med 5,0 ml sterilt fosfatbuffert saltlösning (PBS).
6. Resuspendera bakteriell pellets med 5 ml PBS, och använd 50 ìl av suspension som innehåller ca 10 ⁷ kolonibildande enheter (CFU) som inokulat.
7. I händelse av att använda fluorescerande bakterier var bakterieceller märkt med fluorescens märkning reagensen enligt standardprotokoll.

2. Ennesthesia

1. Fyll en liten plastlåda (10 x 10 x 5 cm) med 5% (v / v) förångas isofluran blandas med luft (flöde: 200 ml / min).
2. Bedöva åtta till sexton-svaga gamla manliga eller kvinnliga möss i rutan.
3. Flytta möss att en obduktion tabellen efter anestesi.
4. Kontinuerligt Bedöva möss med 2% (v / v) förångas isofluran blandas med luft (flöde: 200 ml / min) (Figur 1). Detta är en terminal förfarande.

3. Knyts ihop Peyer är plåster loop-analys

1. Incise 1cm av buken huden och sedan klippa i buken bukhinnan av en sövda mus och ta ut tunntarmen innehåller Peyer är plåstret.
2. Ligate tarmen med sytråd, var noga med att undvika blodkärl. OBS: endast binder ena sidan av tarmen, och lämna den andra sidan lös.
3. Injicera 50 ìl bakteriesuspensionen eller PBS (kontroll) med en spruta i knyts ihop Peyer s patch slinga på rymmen side i tarmen (Figur 2).
4. Bind lösa sidan och stäng musens buk med en klämma.
5. Efter 1 timme, ta bort den knyts ihop Peyer s patch slinga, och avliva musen med halsdislokation.
6. Excise Peyer är patch från knyts ihop Peyer s patch loop.
7. Blinkar den apikala sidan av Peyer s plåster med 1 ml PBS med hjälp av spruta fäst vid en nål för att avlägsna överskott slemhinnor vätska och bakterier. Flasha Peyer är patch ytterligare två gånger.

4. Hela montera färgning och konfokala mikroskopisk analys av Peyer s patch

1. Fix Peyer är plåstret på BD Cytofix / Cytoperm lösningen på is i 1 tim.
2. Tvätta Peyer är plåster tre gånger med 1 ml BD Perm / Tvättbuffert i 5 minuter och sedan blockera med 1 ml blockerande buffert innehållande 0,1% (w / v) saponin, 0,2% (w / v) BSA i PBS i 30 min på is.
3. Lägg till 200-faldig utspädning anti-mus GP2 monoklonal antikropp (5 mikrogram / ml) med den förlaga för att upptäckaM celler.
4. Inkubera i 2 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
5. Tvätta tre gånger med 1 ml kall PBS, tillsätt sedan 200-faldig utspädning anti-råtta IgG-antikropp konjugerad med DyLight549 (20 mikrogram / ml) till provet.
6. Inkubera prov på is i 2 timmar.
7. Tvätta tre gånger med 1 ml kall PBS, lägg sedan till 50-faldig utspädning Alexa 633 konjugerat Phalloidin med den förlaga för att upptäcka F-aktin.
8. Inkubera på is i 2 timmar.
9. Tvätta lätt med 1 ml kallt PBS. Lägg sedan 3-4 stycken cirkulära skyddsglas på en bild, och bädda in prover i en 30% lösning av glycerol i PBS på bilden (Figur 3).
10. Observera prover med en DM-IRE2 konfokala laserskanning mikroskop eller en DeltaVision Restaurering deconvolution mikroskop.

5. Representativa resultat:

Provet exempel en mus knyts ihop Peyer s analys patch slinga med GFP-S. Typhimurium sågs med en DeltaVision Restoration deconvolution mikroskop (Figur 4). GFP-S. Typhimurium är transcytosed av GP2 ⁺ M celler. En mus Peyer är plåster tarm loop-analys kan identifiera vilken typ av kommensala eller patogena bakterier som kan transcytosed av M celler.

Figur 1. Anestesi av möss under förgasas isofluran skick. Förångas isofluran levererades av en anestesi-dedikerade apparater (vänster sida).

Figur 2. Sammanfattning av knyts ihop Peyer s patch intestinal loop-analysen. Den fluorescerande bakteriesuspension injicerades med sprutan i knyts ihop Peyer s patch slinga på den lösa sidan av tarmen.

Figur 4. Exempel på en mus knyts ihop Peyer s analys patch slinga med GFP-S. typhimurium. GP2, vilket redovisas som M cellspecifik markör ^5, var fläckad med anti-mus GP2 antikropp (Röd). Sågs med en DeltaVision restaurering deconvolution mikroskop provet. GFP-uttryckande S. Typhimurium var co-lokaliserade med GP2 på apikala plasmamembranet av M cell och i subapical cytoplasmiska blåsor (pilspetsar). Top, apikala utsikt. Botten och sida, lateral åsikter. Skala bar: 10 mikrometer.

Discussion

Inkubationstiden för knyts ihop Peyer s plåster med bakteriesuspension är oftast under 1 timme för att observera den bakteriella införlivas i M-celler. Vid 4 timmar inkubation är de bakterier som ofta upptäcks i T-cell zon Peyers plack. Som den förångade isofluran inhalant anestesi kunde hålla möss stabil, är inkubationstiden för knyts ihop Peyer s plåster med bakteriesuspension utdragbar att observera de bakterier som flyttar in i T-cells zonen i Peyer s patch. Det viktiga i detta experiment är att se till att inte repa blodkärl när underbindning tarmen. När det gäller att inte använda GFP-uttryck bakterier, kan vi använda alternativt fluorescerande bakterier genom kommersiella fluorescens märkning reagens. Om reagenset eventuellt hämmar bakteriell, som du vill använda, infästning i molekylen uttrycks på M-cell, bör du använda de specifika primära antikroppen, om sådana finns, för att upptäcka de ingående bakterier.

INNEHÅLL "> Den knyts ihop slingan assay metoden var tidigare beskrivits ^{6, 7} vi förbättra vissa punkter i denna metod som följer:.. 1 Isofluran används som ett bedövningsmedel för att hålla mössen stadiga 2 ca 1 cm knyts ihop intestinal slinga inklusive Peyer-talet.. patch är inställd.. 3 Bakterier tas upp av M-cellerna fluorescerande är märkta med fluorescerande märkning reagens eller genom att överuttryck av fluorescerande proteinet som GFP. 4. M celler i hårsäcken-associerade epitel täcker Peyer s patch upptäcks av hel-mount immunostainig med anti GP2 antikropp. 5. Lysrör bakteriell transcytos av M celler observerades av konfokala mikroskopisk analys.

Vi och andra har visat att olika heterogena antigener aktivt vinna inträde i M-celler. Ett stort antal patogener, inklusive Salmonella spp.., Shigella spp.., Yersinia SPP. utnyttja M celler för ^8-10 värd invasion. Dessutom kockoida form av Helicobacter pylori kan potentiellt translocate in Peyer s patch via M celler, och denna flyttning är nödvändig för induktion av kronisk inflammation i magen ^11. Å andra sidan, de mekanismer genom vilka dessa patogener invaderar M celler ännu inte helt klarlagd. Vi föreslår att den knyts ihop Peyer är plåster loop-analysen är en lämplig experimentell metod för att dissekera samspelet mellan M-celler och agenter patogena in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Agar Ampicillin- 100	SIGMA	L5667
Cy3 mono-Reactive Dye Pack	GE Healthcare	PA23001
Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A10168
Inhalation anesthesia apparatus	Shinano Seisakusho	SN-487
Fixation and Permeabilization Solution	BD	554722
Anti mouse Glycoprotein 2 antibody	MBL	D278-3	200-fold dilution (5μg/ml)
Goat Anti-Rat IgG, F(ab')2 fragment specific	Jackson ImmunoResearch	112-505-006	200-fold dilution (20μg/ml)
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	50-fold dilution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	DMIRE2
DeltaVision Restoration deconvolution microscope	Applied Precision	DeltaVision Core