Summary
M Peyer Kullanıcı yamaları içeren özel bir folikül ilişkili epitel hücreleri mukozal immunosurveillance bağırsak ile ilişkili lenfoid doku için önemli bir rol oynamaktadır. Burada bakteriyel transcytosis M hücreleri tarafından açıklanan değerlendirme yöntemi
Abstract
Bizim bağırsak iç commensal bakterilerin büyük sayı ile yaşadığı. Gastrointestinal sistemin mukozal yüzeyinde, sürekli olarak onlara ve bazen patojenlere maruz kalmaktadır. Bağırsak ile ilişkili lenfoid doku (GALT), bu mikropların 1, 2 mukozal bağışıklık yanıtının indüksiyonu için önemli bir rol oynamaktadır . Mukozal immün yanıtı başlatmak için, mukozal antijenleri Peyer Kullanıcı yamaları gibi organize lenfoid folikül içine epitel bariyer boyunca bağırsak lümeni taşınması gerekir. Bu antijen transcytosis, uzmanlaşmış epitel M hücreleri 3, 4 aracılık eder . M hücreleri, makromoleküllerin ve mikropların aktif fagosite atipik epitel hücreleri vardır. Dendritik hücreler (DC) ve makrofajlar, bozulması için lizozomlar hedef antijenleri aksine, M hücreleri esas olarak içselleştirilmiş antijenleri transcytose. M hücreleri ile bu dinamik makromoleküler transcytosis altta yatan organize lenfoid folikül bir antijen sunard antijen-spesifik mukozal bağışıklık yanıtlarını başlatmak için gerekli olduğuna inanılmaktadır. Ancak, M hücreleri tarafından bu antijeni alımını teşvik eden moleküler mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir. Daha önce özellikle enterositler arasında M hücrelerinin apikal plazma membran glikoprotein ifade 2 (GP2), Escherichia coli ve Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium dahil olmak üzere, ortakçı ve enterobakteriler patojenik bir alt kümesi için bir transcytotic reseptörü olarak hizmet ettiği bildirdin ) FimH, bakteri dış zar 5 pili türü bir bileşeni tanıyarak. Burada, M hücreleri tarafından bakteriyel alımını değerlendirmek için bir fare Peyer yama bağırsak döngü testinin uygulanması için bir yöntem sunar. Bu yöntem, daha önceden açıklanan 6, 7 farenin bağırsak döngü testinin geliştirilmiş bir versiyonu. Geliştirilmiş noktalar şunlardır: 1. İsofluranın bir anestezik ajan olarak kullanılmıştır. 2. Bağlandı bağırsak döngü dahil olmak üzere yaklaşık 1 cming Peyer yama kurulmuştur. 3. M hücreleri tarafından alınan bakteriler, floresan, floresan etiketleme reaktif veya yeşil floresan proteininin (GFP) gibi eksprese floresan protein tarafından işaretlenmiştir. 4. M Peyer yama kapsayan folikül ilişkili epitel hücreleri, anti GP2 antikor ile tüm montaj immunostainig tarafından tespit edildi. 5. M hücreleri tarafından Floresan bakteriyel transcytosis konfokal mikroskobik analizi ile gözlenmiştir. Fare Peyer yama bağırsak döngü testinin cevap kaynağı olabilir ne tür ortakçı veya M hücreleri tarafından transcytosed patojen bakteriler, ve M hücreleri yoluyla mukozal bağışıklık sistemini uyarmak için nasıl moleküler mekanizmayı anlamak için bize yol açabilir.
Protocol
1. Bakteri hücrelerinin hazırlanması
- Streak gliserol ve LB (GFP ifade S. Typhimurium) floresan bakteri süreyle 100 mcg / ml ampisilin içeren agar plaka.
- Kültür geceleme yeni LB orta 2 ml LB agar tek bir koloni.
- 1.0 600 nm dalga boyunda optik yoğunluk ulaşana kadar yeni LB orta ve inkübe 4.5 ml 0.5 ml bakteri kültürü ekleyin.
- Santrifüj yoluyla Hasat bakteri hücrelerinin (3.000 xg, 5 dk, 4 ° C).
- Süpernatantı atın ve 5.0 ml steril fosfat tamponu salin (PBS) ile iki kez yıkayın.
- 5 ml PBS ile bakteriyel pelletini tekrar ve inokulum olarak yaklaşık 10 7 koloni oluşturan birim (CFU) içeren süspansiyon 50 ul kullanabilirsiniz.
- Floresan etiketli bakterileri kullanarak durumda, bakteri hücrelerinin standart protokole göre floresan etiketleme reaktif etiketli.
2. Anesthesia
- % 5 (v / v) ile küçük bir plastik kutu (10 x 10 x 5 cm) doldurun buharlaşmış izofluran hava (akış hızı: 200 ml / dak) ile karıştırılır.
- Anestezisi sekiz kutusunda, on altı zayıf yaşında erkek veya dişi fareler.
- Fareler anestezi sonrası otopsi tabloya taşıyın.
- Sürekli% 2 (v / v) tarafından fareler uyutmak buharlaşmış izofluran hava ile karışık (akış hızı: 200 ml / dak) (Şekil 1). Bu terminal bir işlemdir.
3. Bağlandı Peyer yama döngü tahlil
- İnsizyon 1cm karın cilt ve sonra anestezi bir fare karın periton kesilmiş ve ince bağırsakta Peyer yama içeren çıkarmak.
- Kan damarlarının özen, dikiş ipliği ile bağırsak Arter. Not: bağırsak sadece bind bir tarafı, diğer tarafı gevşek bırakın.
- Gevşek s bağlanan Peyer yama döngü içine bakteriyel süspansiyon veya PBS (kontrol) bir şırınga ile enjekte 50 ulide bağırsak (Şekil 2).
- Gevşek yan bağlama ve bir klip ile farenin karın yakın.
- 1 saat sonra bağlandı Peyer yama döngü kaldırmak ve servikal dislokasyon fare euthanize.
- Vergi Peyer yama bağlanan Peyer yama döngü.
- Aşırı mukoza sıvısı ve bakteri kaldırmak için bir iğne takılı şırınga ile 1 ml PBS tarafından Peyer yama apikal tarafında yanıp söner. Peyer yama ek bir iki kez yanıp söner.
4. Tüm montaj boyama ve Peyer yama konfokal mikroskobik inceleme
- 1 saat buz BD Cytofix / Cytoperm çözüm Peyer yama sabitleyin.
- Sonra 1 ml üzerinde 30 dakika için 0.1% (w / v) saponin,% 0.2 (w / v) PBS içinde BSA içeren engelleme tampon bloğu BD Perm / 5 dakika boyunca tampon yıkayın 1ml Peyer Kullanıcı yama üç kez yıkayın, ve buz.
- 200 kat seyreltilmiş numune GP2 monoklonal antikor (5 mg / ml) tespit etmek için anti-fareM hücreleri.
- Oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca inkübe 4 ° C
- 1 ml soğuk PBS ile üç kez yıkayın, daha sonra, numune için DyLight549 (20 mg / ml) ile konjuge 200 kat sulandırılmış anti-fare IgG antikor ekleyin.
- 2 saat buz örnek inkübe edin.
- 1 ml soğuk PBS ile üç kez yıkayın, daha sonra F-aktin tespit etmek için numune 50 kat sulandırılmış Alexa 633 konjuge Phalloidin ekleyin.
- 2 saat buz üzerinde inkübe edin.
- 1 ml soğuk PBS ile hafifçe yıkayın. Sonra bir slayt 3-4 adet yuvarlak cam kapak yerleştirin ve slayt (Şekil 3) PBS içinde% 30 gliserol çözüm örneklerinin gömmek.
- DM-IRE2 konfokal lazer tarama mikroskobu veya DeltaVision Restorasyon deconvolution mikroskop sahip örnekler dikkate alınmalıdır.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Bir fare örnek örnek GFP-typhimurium Peyer yama döngü tahlil bağlandımurium DeltaVision Restorasyon deconvolution mikroskobu (Şekil 4) gözlenmiştir. GFP-S. Typhimurium GP2 + M hücreleri tarafından transcytosed. Fare Peyer yama bağırsak döngü tahlil M hücreleri tarafından transcytosed ortakçı ya da patojenik bakterilerin türünü belirlemek.
Şekil 1 buharlaşmış izofluran koşul altında farelerin Anestezi. Buharlaştı izofluran adanmış bir anestezi cihazları (sol taraf) tarafından sağlanmıştır.
Şekil 2 bağlanan Peyer yama bağırsak döngü testinin özeti. Floresan bakteriyel süspansiyon bağırsak gevşek tarafında bağlanan Peyer yama döngünün içine şırınga ile enjekte edildi.
Şekil 4 bir fare bağlandı GFP-S. Typhimurium ile Peyer yama döngü tahlil örneği. M hücre spesifik bir işaretleyici 5 olarak rapor GP2, anti-fare GP2 antikor (Kırmızı) ile boyandı. Numune DeltaVision Restorasyon deconvolution mikroskop ile gözlendi. GFP ifade S. Typhimurium M hücrenin apikal plazma membranı ve GP2 subapical sitoplazmik veziküller (ok başları) ile birlikte lokalize idi. Top, apikal görünümü. Alt ve yan, yanal manzarası. Ölçek çubuğu: 10 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriyel süspansiyon ile bağlanan Peyer yama inkübasyon süresi genellikle M hücrelerine bakteriyel birleştirmek gözlemlemek için 1 saat. 4 saat inkübasyon durumda, bakterilerin genellikle Peyer Kullanıcı yamalar T hücre bölgesi tespit edilir. Buharlaşmış izofluran uçucu anestezi fareler istikrarlı tutmak gibi, bakteriyel süspansiyon ile bağlanan Peyer yama inkübasyon süresi Peyer yama T-hücre bölgeye hareket eden bakteriler gözlemlemek için uzatılabilir. Bu deneyde önemli bir nokta, bağırsak ligating, kan damarı çizmemeye dikkat çekmek için. GFP-ifade bakteri kullanmak durumunda, alternatif ticari floresan etiketleme reaktifi ile floresan etiketli bakteri kullanabilirsiniz. Muhtemelen reaktif, kullanmak istediğiniz, bakteriyel M hücre ifade molekül bağlılık engeller varsa, anonim bakterileri tespit etmek, varsa özel primer antikor kullanmanız gerekir.
ontent "> bağlanan döngü assay yöntemi daha önce 6, 7 açıklanan idi Biz aşağıdaki gibi bu yöntemin bazı noktaları geliştirmek:... 1 İsofluranın farelerin kararlı 2 tutmak için bir anestezik ajan olarak kullanılır. Yaklaşık 1 cm Peyer Kullanıcı bağırsak döngü bağlandı. yama kadar 3. M hücreleri tarafından ele alınan bakterilerin floresan floresan etiketleme reaktif tarafından veya böyle GFP olarak eksprese floresan protein etiketli.. 4. M hücre Peyer Kullanıcı yama kapsayan follikül-ilişkili epitel ile bütün-montaj immunostainig tarafından algılanır. anti-GP2 antikor 5. M hücreleri tarafından Floresan bakteriyel transcytosis konfokal mikroskopik analiz ile gözlenmektedir.Biz ve diğerleri çeşitli heterojen antijenleri aktif M hücre içine giriş kazanmak göstermiştir. Salmonella spp de dahil olmak üzere önemli sayıda patojenlerin, Shigella, Yersinia spp. host işgali 8-10 M hücreleri yararlanabilir. Ayrıca, Helic coccoid formuobacter pylori Peyer M hücreler yoluyla yama içine potansiyel yerini değiştirmek ve bu translokasyon 11 mide kronik inflamasyon indüksiyonu için önemlidir. Öte yandan, bu patojenlerin M hücreleri istila hangi mekanizmalar tam olarak aydınlatılamamıştır kalır. Biz bağlanan Peyer yama döngü testi, M hücreleri ve in vivo patojen ajanları arasındaki etkileşimi diseksiyon için uygun bir deneysel yöntem olduğunu düşündürmektedir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar bu tekniği geliştirmek için tüm AYB üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma Öncelik Alanları Membran Trafik "(HO), ve" Bulaşıcı Olayları Matrix "(KH), Genç Bilim Adamları (SF ve KH), Bilimsel Araştırma (HO Bilimsel Araştırma için Grant-in-Aid tarafından kısmen desteklenmiştir. Yenilikçi Alanları Milli Eğitim Bakanlığı, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Japonya "Hücre içi Lojistik" (HO),), Bilimsel Araştırma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Agar Ampicillin- 100 | SIGMA | L5667 | |
| Cy3 mono-Reactive Dye Pack | GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A10168 | |
| Inhalation anesthesia apparatus | Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| Fixation and Permeabilization Solution | BD | 554722 | |
| Anti mouse Glycoprotein 2 antibody | MBL | D278-3 | 200-fold dilution (5μg/ml) |
| Goat Anti-Rat IgG, F(ab')2 fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 112-505-006 | 200-fold dilution (20μg/ml) |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | 50-fold dilution |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration deconvolution microscope | Applied Precision | DeltaVision Core |
References
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
- Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
- Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer's patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
- Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).
- Hase, K. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462, 226-230 (2009).
- Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops. Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).
- Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. Jr M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration. J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).
- Owen, R. L. M cells--entryways of opportunity for enteropathogens. J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).
- Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells. Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).
- Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches. Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).
- Nagai, S. Role of Peyer's patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).
