在原位小鼠脑肿瘤模型结合放疗

Summary

这篇文章的目的是描述使用原位神经母细胞瘤化疗研究模型。虽然本文将去细胞处理，植入，鼠标使用颅内模型放疗。

Abstract

胶质母细胞瘤（GBM），是最常见的和积极的成人原发性脑肿瘤^1。近年来已取得实质性进展，在了解肿瘤浸润力学，直接脑内接种肿瘤提供了机会，在生理上适当的环境观测入侵过程。至于人类脑肿瘤有关，目前可用的原位模型建立立体定向注射细胞悬液或植入一个坚实的一块肿瘤，通过一个复杂的开颅手术过程^3。在我们的技术，我们收获的细胞组织培养，创建一个用于直接植入到大脑细胞悬液。手术时间约30分钟，鼠标需要在一个恒定的手术平面，注射麻醉剂使用。鼠标被放置在了一个立体夹具Stoetling（图1）。前前后后ER被清除，并准备手术区，切口和前囟门位于确定开颅的位置。开颅手术的位置是2毫米的权利和延髓前囟门1毫米。深度为3毫米，从头骨的表面和细胞注入2μL，每2分钟的速度。皮肤缝合用5-0的PDS，允许唤醒了一个加热垫和鼠标。从我们的经验，根据细胞株，治疗可以采取手术后7-10天的地方。给药是依赖于药物组成。对于放射治疗的老鼠麻醉，并投入到一个做夹具定制。铅覆盖老鼠的身体和公开只老鼠的大脑。研究肿瘤发生和大紫荆勋章的新疗法的评价需要准确，重现性脑肿瘤动物模型。因此，我们使用这种原位脑模型研究的大脑和肿瘤微环境的相互作用，测试effectivenESS无辐射与不同的治疗药物。

Protocol

一，电池的制备

1. 含10％胎牛血清的DMEM汇合处约80％汇合225厘米³瓶每5被植入小鼠的细胞生长。
2. 吸细胞的媒体;无钙或镁与10毫升的PBS洗。吸出PBS关闭细胞。
3. Trypsinize细胞与胰蛋白酶的3毫升，等待10-15分钟，并消除胰蛋白酶，与15毫升的媒体。
4. 吸取到50毫升锥形细胞和媒体。两个大瓶放入一个50毫升锥形。
5. 在7分钟1600转的自旋细胞在4°C完全吸上清。在10毫升冷PBS悬浮细胞，并轻轻吹打上下冲洗细胞。确保细胞沉淀用PBS混合均匀。悬挂应该是阴天。
6. 在这个时候进行细胞计数，用库尔特计数器。在7分钟1600转离心细胞再次在4°C
7. ^第二细胞离心，后海盗所有PBS和1毫升的PBS重悬。
8. 细胞纺在3000转每分钟为10分钟，在4°C的PBS1毫升PBS是吸气，PBS是加入终浓度为每5μLU87细胞调整到1x10 ^6，其他细胞株可能需要不同的最佳肿瘤生长的细胞数量和浓度。
9. 最终体积和浓度后得到的细胞保持在一个Eppendorf管中的冰。

二。异种移植

1. 准备鼠标
   1. 小鼠麻醉注射氯胺酮/甲苯​​噻嗪/生理盐水混合使用。混合物为120毫克/公斤氯胺酮，16毫克/公斤的Rompun和盐碱地。小鼠体重和0.1毫升每10克，根据自己的体重。麻醉用1毫升注射器IP连接到26G针。这将需要约15分钟小鼠达到无疼痛反应的睡眠阶段。你可以检查的疼痛反应小鼠捏他们的脚垫。
   2. 鼠标是完全麻醉后，眼膏管理自己的眼睛，以防止干燥。
   3. 鼠标被放置在缺口前上齿口栏上的立体床。在床上，然后放置在立体。
   4. 鼻子警卫被放置在老鼠的鼻子，以防止头部运动，耳棒轻轻放置在老鼠的耳道。要小心，不要做任鼻子酒吧或耳酒吧太紧的位置，可能为颅骨骨折和/或防止呼吸鼠标。
   5. 确保头鼠标是在这个过程中是有帮助的水平上立体刻度。
   6. 要准备的鼠标，酒精和providine碘慷慨地应用于鼠标共3应用的碘的酒精和3应用交替的头部。其中有70％的酒精垫的最终应用适用于头。
2. 手术
   1. 通过高压灭菌或浸泡前开始的过程中70％的乙醇文书过程中的所有工具应消毒。
   2. 头骨顶部背后右眼斜回左后颅骨切口。应该是约10毫米至15毫米长的切口。
   3. 使用棉条，慢慢分开切口暴露的头骨和头骨和皮肤之间的膜擦去。使用一个Q尖端涂抹任何血和失血过多观看。
   4. 暴露颅骨顶部的可视化前囟门。使用Hamilton注射器点，定位前囟门。在颅骨钻孔的正确位置是2毫米的权利和1毫米前囟门（图2）。一名外科医生的毡尖标记，购买无菌用来标记钻孔的位置。请注意，该洞是靠近了ANterior缝合线。
   5. 接下来，使用在22G 18G针一针花瓶或通过美联储针点在显着位置，在头骨钻的小孔。
   6. 5μL细胞装入10μL玻璃汉密尔顿注射器。汉密尔顿注射器是10μl钝30G 33G固定针连接到它的。务必混合后装入他们的细胞，他们吸取1ml注射器或使用了25G附针1。 Hamilton注射器装入后，放置在手臂后面排队，它在洞的头骨。
   7. 降低短打结束，一旦头骨表面的针针是与颅骨水平，降低针，直到它在3毫米以下的头骨表面的深度。
   8. 降低针后，应保持2分钟，以避免任何重大创伤，影响大脑的针。植入的细胞是6-8分钟的速度在每分钟1μL，小心任何backflo的W。经过最后的细胞被植入，留针2分钟的地方，让所有的细胞，安顿下来。
   9. 从大脑中取出针，清理具有Q-尖的孔。丙酮50％，100％乙醇和PBS，在每个解决方案和3倍的顺序进行清洁针头和注射器。
   10. 皮肤上的头骨是准备在这一点上缝合。使用5-0 PBS关闭切口约3针。
   11. 允许鼠标唤醒热垫，如果需要重新申请眼膏。鼠标可以返回到笼子里后，它显示了自身的运动（即抬起头或移动的肩膀）。

第三。辐射和药物治疗的IC植入

1. 放射治疗
   1. 根据治疗的老鼠的细胞株，可以采取5至7天植入后。我们的部门使用放射治疗放射治疗单位orthovoltageMENT。
   2. 如劳保局（发光成像），MRI或CT成像可用于可视化的肿瘤之前随机（图3A）。
   3. 小鼠麻醉前氯胺酮/二甲苯胺噻嗪/盐水鸡尾酒，和眼膏适用于他们的眼睛。
   4. 小鼠被放置在一个自定义的跳汰机的配置就像是一个馅饼轮，在小鼠的头朝向中心点辐射。小鼠体内铅辐射屏蔽。
   5. 可给予药物治疗之前或辐射，通过不同的传递路线，即倚，IP和第四。

四。结果

鼠标唤醒的过程中，麻醉注射后45-60分钟内。如果鼠标已难起床后的程序和时间已超过1个半小时程序后，鼠标可能无法恢复和安乐死可能是一种有效的替代。如果日ERE是出血过多，或在任何时候，破获在手术过程中安乐死的头骨变得建议。如果一切顺利，取决于细胞系，肿瘤开始形成2-4个星期内，在手术后有发生。当使用颅内异种移植模型，疗效通常是衡量生存植入后^5。然而，由于这是一个IC模型的症状和体征会发生之前死亡。鼠标可能会出现的体征有些驼背的姿势，体重减轻，和闲置。一些神经系统体征，可能是癫痫发作，头部倾斜，失去平衡。图3B显示他的肿瘤染色的死亡率。一个采用Kaplan-Meier曲线用于评估数据（图4）。存活天数的50％计算，比对照。如果联合组的生活比个人辐射和毒品军火此外较长的组合是成功的。

图1。Stoelting立体定向设备。

图2：一个鼠标头骨钻洞的位置图。

图3A。劳保局成像植入后大紫荆勋章。

图3B。H和E在GBM的肿瘤死亡率。

图4。U87的IC与PARP抑制剂手术后7天内注射植入物的结果。

Discussion

胶质母细胞瘤，恶性胶质瘤，如代表最常见的原发性脑肿瘤和预后极差^4。大紫荆勋章的影响患者的生存期已大致维持不变（即诊断后9-12个月）在过去十年中，尽管在手术，放疗和化疗⁵垫款。应包括适当的治疗脑胶质瘤的研究模型的特点重现肿瘤的位置和生长的细胞作为一个相对独立的肿瘤细胞应类似于尽可能脑胶质瘤的组织学特征密切合作，应该有一个可预见的增长率，肿瘤的增长能力，在肿瘤组织培养和模型应该是在一个小动物，以减少开支^6。有效的治疗方法取决于酷似人类的大紫荆勋章的特点，为测试新的治疗方法，并提供一个准确地理解的分子widespr基础实验模型^7的 EAD胶质瘤侵袭。脑肿瘤的生物学调查也经常使用的细胞系在体外生长或维持获得信息^8。抑制肿瘤的侵袭和血管生成的主要目标是在开发新的治疗策略，对恶性胶质瘤^9。有限的治疗神经母细胞瘤的选项已陷入这种致命癌症的遗传病变，密集的搜索，制定更合理，更有效的治疗的目的^10。