Orthotopic 마우스 뇌종양 모델의 조합 방사선 치료

Summary

이 문서의 목적은 chemoradiation 연구를위한 orthotopic glioblastoma 모델의 사용을 설명하는 것입니다. 이 문서에서는 이온 주입, 세포 가공 불구하고 이동하고 intracranial 모델을 사용하여 마우스의 방사선 치료합니다.

Abstract

Glioblastoma multiforme의 (GBM) ¹ 가장 일반적이고 공격적인 성인 뇌종양입니다. 최근에는 거기에 종양이 침략의 역학에 대한 이해에 상당한 진전되어, 그리고 종양의 직접 했습니다만 접종은 생리학적으로 적절한 환경 ^2의 침략 과정을 관찰의 기회를 제공하고있다. 마찬가지로 지금까지 인간의 뇌종양에 대해서라면 현재 사용 가능한 orthotopic 모델은 복잡한 craniotomy 절차 ^3을 통해 종양의 고체 부분의 세포 현탁액 또는 주입의 stereotaxic 주입에 의한 중 설립된다. 우리의 기술 우리는 두뇌에 직접 이식하는 데 사용되는 세포 현탁액을 만들 조직 배양에서 세포를 수확. 수술 시간은 약 30 분 정도이며, 마우스가 지속 외과 비행기에있을 필요로 주사용 마취제가 사용됩니다. 마우스 Stoetling (그림 1)에 의해 만들어진 stereotaxic 지그에 위치합니다. 고물에응급실은 외과 영역이 청소와 준비가되어 있습니다, 절개가 만들어졌다, 그리고 bregma는 craniotomy의 위치를​​ 결정하기 위해 위치하고 있습니다. craniotomy의 위치는 오른쪽으로 2mm와 bregma에 주동이의 1mm입니다. 깊이는 두개골의 표면에서 3mm이며, 세포, 2 μl 매 2 분 속도로 주입하고 있습니다. 피부는 5-0 PDS로 봉합하고, 마우스는 가열 패드에 깨워 허용됩니다. 우리의 경험에서 세포주에 따라 치료는 수술 후 7~10일에서 자리를 차지할 수 있습니다. 마약 배달은 약물 성분에 따라 좌우됩니다. 방사선 치료를 마우스 anesthetized 있으며, 지그 만든 사용자 정의에 투입. 리드는 마우스의 시체를 커버하고 마우스만을 두뇌를 제공합니다. tumorigenesis와 GBM에 대한 새로운 요법의 평가 연구는 정확하고 재현성 뇌종양 동물 모델을 필요로합니다. 따라서 우리는 effectiven을 테스트, 두뇌의 microenvironment과 종양의 상호 작용을 연구하기 위해이 orthotopic 뇌 모델을 사용방사선와의없이 다양한 치료 요원의 ESS.

Protocol

I. 셀 준비

1. 세포 이식되는 매 5 생쥐 한 80% 합류 225cm ³ 플라스크에 대해 10% FBS으로 DMEM의 합류로 성장하고 있습니다.
2. 세포의 미디어 벗어 대기음, 칼슘이나 마그네슘없이 PBS의 10 ML로 씻는다. 대기음 PBS 해제 세포.
3. 트립신 3 ML과 세포를 Trypsinize, 10-15 분 기다려야하고, 미디어의 15 ML에 트립신을 중화.
4. Pipet 50 ML 원추형으로 모든 세포와 미디어. 두 개의 커다란 flasks 한 50 ML 원추형으로 맞습니다.
5. 4 ° C.에서 7 분을위한 1,600 rpm으로 세포를 던가 완전히 뜨는 기음. 차가운 PBS의 10 ML에 세포를 Resuspend, 가볍게 아래로 pipetting 및하여 세포를 헹굴. 셀을 펠렛은 PBS로 균일하게 혼합되어 있는지 확인하십시오. 서스펜션은 구름이어야합니다.
6. 현재 셀 카운트는 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운터를 사용하여 수행됩니다. 세포는 4 ° C.에서 7 분을위한 1,600 rpm으로 다시 centrifuged있다
7. 세포의 2 ^차 원심 분리 등 후PBS 1 ML의 해적 모든 PBS와 resuspend.
8. 세포는 4 ° C. 10 분 3,000 rpm으로 PBS의 1ml에 소용되는 PBS는 aspirated하고, PBS는 U87 세포를 5 μl 당 1x10 ^6으로 최종 농도를 조정하기 위해 추가됩니다, 다른 세포 라인은 최적의 종양 성장을위한 세포의 서로 다른 숫자와 집중을 필요로 할 수 있습니다.
9. 최종 볼륨과 집중을 얻은 후 전지 eppendorf 튜브의 얼음에 보관됩니다.

II. 이종 이식

1. 마우스를 준비
   1. 마우스 케타민을 / Xylazine / 식염수의 주입 믹스를 사용하여 anesthetized 있습니다. 혼합물 120 케타민을, 16 밀리그램 / Rompun과 식염수와 Perl의 MG / kg이다. 생쥐는 개별적으로 무게와 자신의 체중을 기준으로 10g 당 0.1 ML 주어집니다. 마취는 1 ML의 주사기의 IP에 연결된 26G 바늘로 제공됩니다. 그것은 고통 응답을위한자는 단계에 도달하기 위해 생쥐에 대한 약 15 분 소요됩니다. 당신의 고통 응답을 확인하실 수 있습니다그들의 노상 강도를 곤란에 의한 생쥐.
   2. 마우스가 완전히 anesthetized되면​​ 눈 연고가 말리는에서 그들을 방지하기 위해 그들의 눈에 관리합니다.
   3. 마우스를 입 표시줄에서 노치의 앞에 윗니와 stereotaxic의 침대에 배치됩니다. 침대 후 stereotaxic에 배치됩니다.
   4. 코 가드는 머리의 움직임을 방지하기 위해, 그리고 귀 바가 가볍게 생쥐의 귀 운하에 배치하고 마우스의 코 위에 배치됩니다. 두개골 골절 및 / 또는 호흡에서 마우스를 방지할 수 있으므로 코 표시줄이나 너무 꽉 귀 막대 중 하나 배치를하지 않도록주의하십시오.
   5. 마우스의 머리가 stereotaxic에 진드기 부호를 사용하는 수준이 과정에서 도움이 있는지 확인합니다.
   6. 준비하려면 마우스, 알코올 및 providine 요오드는 요오드의 알코올 및 3 애플 리케이션 3 응용 프로그램의 총 번갈아 마우스 머리에 후한 적용됩니다. 70%있는 알코올 패드 중 하나는 최종 응용 프로그램에 적용됩니다머리.
2. 수술
   1. 프로 시저에서 모든 악기 절차를 시작하기 전에 70 %의 에탄올에서 악기를 autoclaving 또는 소킹에 의해 어느 소독해야합니다.
   2. 절개는 대각선으로 다시 두개골의 왼쪽 뒷부분에 오른쪽 눈 뒤에서 머리 위에 이루어집니다. 절개는 10mm ~ 15 mm 길이에 대해 여야합니다.
   3. Q-팁을 사용하여 천천히 두개골을 노출하고 두개골과 피부 사이에 멤브레인 닦아 절개를 구분합니다. 과도한 출혈을 핏자국이 얼룩하고 시청 Q-팁을 사용하십시오.
   4. bregma을 시각화하기 위해 두개골의 맨을 쉽게받을 수 있습니다. 해밀턴 주사기 포인트 사용 bregma 통해 위치를. 두개골을 뚫고되는 구멍의 정확한 위치는 2 밀리미터 권리와 bregma (그림 2)의 앞쪽에 1mm입니다. 멸균 구입 외과의 느낌 - 스쳐 마커는, 뚫고되는 구멍의 위치를​​ 표시하는 데 사용됩니다. 구멍이 가까이 위치하고있다는 점에 유의하십시오terior 봉합 라인.
   5. 다음으로, 18G 바늘을 통해 핀 꽃병이나 수사관에 22G 바늘의 포인트를 사용하여 표시된 위치에서 두개골에 작은 구멍을 드릴 다운합니다.
   6. 세포의 5 μl와 10 μl 유리 해밀턴 주사기를로드합니다. 해밀턴 주사기 그것에 부착된 고정 33G 바늘로 무딘 30G 갖춘 10 μl입니다. 그들을 pipetting 또는 부착된 25G 바늘로 1ml 주사기를 사용하여 중, 그들을로드하기 전에 세포를 섞어주십시오. 해밀턴 주사기가로드되면, 두개골에 구멍을 주선해 줄 수있는 팔을에 다시 넣습니다.
   7. 바늘은 두개골과 수준되면 두개골의 표면에 바늘의 번트 엔드를 내려라, 그것이 두개골의 표면 아래 3 mm의 깊이에까지 바늘을 낮춥니다.
   8. 바늘이 저하되면 그것은 두뇌에 영향을 미치는 바늘에서 어떤 큰 충격을 피하기 위해 2 분 동안 거기 남아있을 것이다. 세포를 이온 주입하면 6~8분의 총 분당 1 μl의 속도이며, 어떤 backflo주의w 세포의 마지막이 이식되고 나면, 모든 세포가 적응할 수 있도록 또 다른 2 분을 위치에 바늘을 떠나
   9. 두뇌에서 바늘을 제거하고, Q-팁을로 입구를 청소하십시오. 각 솔루션과 그 순서 배 50% Actone, 100 % EtOH, 그리고 PBS로 바늘과 주사기를 청소 진행합니다.
   10. 두개골의 피부는이 시점에서 봉합받을 준비가되어 있습니다. 5-0를 사용하면 PBS는 약 3 바늘로 절개를 닫습니다.
   11. 마우스가 열 패드에 깨어 있도록 허용하고, 필요한 경우 안과 연고를 다시 적용합니다. 자체의 움직임을 보여주는 이후 마우스는 새장에 반환됩니다 (즉 머리를 리프팅하거나 어깨를 이동).

III. 방사선 및 약물에 의한 IC 임플란트의 치료

1. 방사선 치료
   1. 세포주에 따라 생쥐의 치료 7 일 후 임플란트에 자리 5 소요될 수 있습니다. 우리 부서는 방사선 대접을 위해 orthovoltage 방사선 치료 장치를 사용하여, 표준.
   2. 이러한 BLI (Bioluminescence 이미징), MRI 또는​​ 중부 표준시와 같은 이미징 전에 임의화 (그림 3A)에 종양을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.
   3. 마우스는 이전과 케타민을 / Xylazine / 식염수 칵테일과 anesthetized이며, 눈 연고가 눈을에 적용됩니다.
   4. 생쥐는 생쥐의 헤드 중심을 향해 가리 키도록하는 원형 바퀴처럼 구성된 맞춤 제작한 방사선 지그에 위치하고 있습니다. 생쥐의 신체는 리드와 방사선을 차단할 수 있습니다.
   5. 약물 치료는 다른 배달 노선 즉, SQ, IP 및 IV를 통해 전이나 방사선 중 하나를 부여하실 수 있습니다.

IV. 결과

마우스가 마취 주사 후 45-60분 이내에 절차에서 깨어나한다. 마우스 difficultly 수술 후 깨어난했으며 시간이 1을 초과했습니다 ½ 시간을 수술 후 경우, 마우스는 복구할 수 없으며 안락사는 효과적인 대안이있을 수 있습니다. 만약 일오히려 과도한 출혈하거나 프로 시저 안락사 동안 시점에서 갈라진 두개골되어도 좋습니다. 모두 잘하고 세포주에 따라되면 절차가 이루어지는 후 종양 2-4 주 이내에 형성 시작합니다. intracranial 이종 이식 모델을 사용하면 치료 효능은 보통 생존 사후 주입 ^5로 측정됩니다. 그러나, 이것은 그대로 IC 모델 징후와 증상은 죽기 전에 발생합니다. 마우스가 발생할 수 있습니다 신체적 증상 중 일부는 hunched 자세, 체중 손실, 그리고 비활성입니다. 신경학적인 증상 중 일부는 압류 헤드 기울기와 균형의 손실있을 수 있습니다. 그림 3B는자가 사망률에서 종양의 얼룩 보여줍니다. 카플란 - 마이어의 줄거리는 데이터를 (그림 4) 평가하는 데 사용됩니다. 50 % 생존의 일 수를 계산 및 제어에 비해됩니다. 조합 그룹이 각각의 방사선 및 약물 무기의 추가보다 더 오래 살았다면 조합이 성공합니다.

그림 1. Stoelting Stereotaxic 장비.

그림 2. 마우스 두개골에 드릴 구멍의 위치의 도표.

GBM 주입 후 그림 3A. BLI 이미징.

그림 3B. 사망률에서 H와 GBM 종양의 E.

그림 4. PARP 억제제 7 일 게시물 수술과 주사 U87의 IC 이식의 결과.

Discussion

이러한 glioblastoma multiforme와 같은 악성 프로그램 gliomas은 가장 일반적인 기본 뇌종양을 대표하고 음침한 예후에게 ⁴ 있습니다. GBM에 의해 영향을 환자의 생존은 수술, 방사선 및 화학 요법 ^5의 진보에도 불구하고 (9-12 즉, 몇 달 후 진단) 지난 10 년 동안 거의 변함없이 남아있다. 세포가 인간의 gliomas의 histological 기능에 최대한 가깝게 유사합니다; 예측 가능한 성장이 있어야 glioma 치료 연구를위한 적절한 모델의 특징은 재현할 종양의 위치와 성장 세포가 상대적으로 이산 종양 등이 포함되어야 종양의 비율은, 조직 문화 모델에서 종양 성장 능력 경비 ⁶ 줄이기 위해 작은 동물에 있어야합니다. 효과적인 치료가 밀접하게 새로운 치료를 테스트하고 widespr의 분자 기준의 정확한 이해를 제공하기 위해 인간 GBM의 특성과 유사한 실험 모델에 의존EAD glioma의 침략 ^7. 뇌 종양의 생물학에 대한 조사도 정기적으로 정보를 ^8을 얻기 위해 체외에서 성장이나 유지 셀 라인을 사용 해왔다. 종양 침략과 angiogenesis의 억제가 악성 gliomas ^9에 대한 새로운 치료 전략의 개발에 주요 목표입니다. glioblastoma를위한 제한된 치료 옵션이보다 합리적이고보다 효과적인 치료법 ^{10 달러를} 개발 목표로,이 치명적인 암의 기본 유전적 병변에 집중적인 검색을 주도했습니다.