Kombination Strahlentherapie in einem orthotopen Maus Brain Tumor-Modell

Summary

Der Zweck dieses Artikels ist es, die Verwendung einer orthotopen Glioblastom-Modell für die Radiochemotherapie Studien beschreiben. Dieser Artikel wird jedoch Zellprozessierung gehen, Implantieren, Strahlentherapie und der Maus mit Hilfe eines intrakraniellen Modell.

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) ist die häufigste und aggressivste erwachsenen primären Hirntumoren ^ein. In den letzten Jahren hat es erhebliche Fortschritte im Verständnis von den Mechanismen der Tumorinvasion und direkter intrazerebraler Inokulation des Tumors bietet die Möglichkeit der Beobachtung der invasiven Verfahren in einem physiologisch geeigneten Umgebung ^2. Soweit menschlichen Hirntumoren betrifft, so sind die derzeit verfügbaren Modelle orthotopen entweder durch stereotaktische Injektion von Zellsuspensionen oder Implantation eines festen Tumors Stück durch ein kompliziertes Verfahren Kraniotomie ³ hergestellt. In unserer Technik ernten Zellen aus Gewebekulturen, um eine Zellsuspension verwendet, um direkt in das Gehirn implantiert zu schaffen. Die Dauer der Operation beträgt etwa 30 Minuten, und die Maus muss in einem konstanten chirurgischen Ebene liegen, eine injizierbare Anästhetika. Die Maus wird in einen stereotaktischen Bohrlehre von Stoetling (Abbildung 1) aus angeordnet. Achterner das Operationsgebiet wird gereinigt und vorbereitet, wird ein Einschnitt vorgenommen, und die Bregma befindet, um die Position der Kraniotomie bestimmen. Die Lage der Kraniotomie ist 2 mm nach rechts und 1 mm rostral zu Bregma. Die Tiefe von 3 mm von der Oberfläche des Schädels und die Zellen werden mit einer Rate von 2 ul alle 2 Minuten injiziert. Die Haut wird mit 5-0 PDS genäht, und die Maus darf aufwachen auf einem Heizkissen. Aus unserer Erfahrung, abhängig von der Zell-Linie, kann die Behandlung Platz 7 bis 10 Tagen nach der Operation. Drug Delivery ist abhängig von der Arzneimittel-Zusammensetzung. Für Bestrahlung die Mäuse sind anästhesiert, und in einem speziell angefertigten Vorrichtungsbau. Blei deckt der Maus Körpers und setzt nur das Gehirn der Maus. Das Studium der Tumorentstehung und die Evaluierung neuer Therapien für GBM erfordern genaue und reproduzierbare Hirntumor Tiermodellen. So verwenden wir diese orthotopen Gehirn Modell, um die Interaktion der Mikroumgebung des Gehirns und des Tumors zu studieren, um das zu testen aftlichess von verschiedenen therapeutischen Wirkstoffen mit und ohne Bestrahlung.

Protocol

I. Zellpräparation

1. Die Zellen werden bis zur Konfluenz in DMEM mit 10% FBS etwa ein 80% konfluenten 225 cm ^3-Kolben für jeweils 5 Mäusen implantiert werden gezüchtet.
2. Saugen Sie Medien aus der Zellen, waschen mit 10 ml PBS ohne Calcium oder Magnesium. PBS absaugen off-Zellen.
3. Trypsinieren Zellen mit 3 ml Trypsin, 10-15 Min. warten, und neutralisieren das Trypsin mit 15 ml Medium.
4. Pipettieren Sie alle Zellen und Medien in einem 50 ml konischen. Zwei große Flaschen passen in ein 50 ml-Erlenmeyerkolben.
5. Spin-Zellen bei 1600 rpm für 7 min bei 4 ° C Überstand vollständig absaugen. Die Zellen in 10 ml kaltem PBS, und spülen Zellen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Stellen Sie sicher, das Zellpellet einheitlich mit der PBS gemischt. Die Suspension soll es wolkig.
6. Zu dieser Zeit eine Zellzahl erfolgt mit Hilfe eines Coulter-Zähler. Die Zellen werden erneut bei 1600 rpm für 7 min bei 4 ° C zentrifugiert
7. Nach dem ^2. Zentrifugation der Zellen, wiePirat aller PBS resuspendieren und in 1 ml PBS.
8. Die Zellen werden in der 1 ml PBS bei 3000 UpM für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert Die PBS abgesaugt wird, und PBS zugegeben, um die Endkonzentration bis 1x10 ⁶ einzustellen pro 5 ul für U87-Zellen, können andere Zelllinien erfordern eine unterschiedliche Anzahl und Konzentration der Zellen für eine optimale Tumorwachstum.
9. Nachdem die letzte Volumen und Konzentration erhalten die Zellen werden auf Eis in einem Eppendorf-Röhrchen aufbewahrt.

II. Xenograft

1. Vorbereiten der Maus
   1. Die Mäuse werden betäubt mit einer Injektion Mischung aus Ketamin / Xylazin / Saline. Die Mischung ist 120 mg / kg Ketamin, 16 mg / kg Rompun und Saline. Die Mäuse werden einzeln gegeben und gewogen 0,1 ml pro 10 g bezogen auf ihr Gewicht. Die Narkose wird mit 26G Nadel befestigt, um 1 ml Spritze IP gegeben. Es dauert ca. 15 min für die Mäuse auf eine schlafende Phase für keine Schmerzreaktion zu erreichen. Sie können die Schmerzreaktion derMäuse durch Kneifen ihre Fußsohle.
   2. Nachdem die Maus ist voll narkotisiert, wird Augensalbe verabreicht, um ihre Augen, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern.
   3. Die Maus wird auf dem Bett des stereotaktischen mit den vorderen oberen Zähne in die Kerbe auf der Mund-Bar platziert. Das Bett wird dann in der stereotaktischen angeordnet.
   4. Der Nasenschutz wird über die Maus die Nase gesetzt, um die Bewegung des Kopfes zu verhindern, und das Ohr Bars werden sanft in die Gehörgänge der Mäuse zu platzieren. Achten Sie darauf, entweder die Platzierung der Nase oder Ohr-Bar Bars zu stramm zu tun, wie der Schädel kann brechen und / oder verhindern, dass die Maus von der Atmung.
   5. Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Maus auf gleicher Höhe mit den Markierungen auf der stereotaktischen ist hilfreich, während dieses Prozesses.
   6. Zur Vorbereitung der Maus, Alkohol und Jod providine wird großzügig auf dem Kopf der Maus abwechselnd für insgesamt 3 Anwendung von Alkohol und 3 Anwendungen von Jod angewendet. Eine letzte Anwendung eines Alkohol-Pad mit 70% wird angewendetder Kopf.
2. Chirurgische Verfahren
   1. Alle Geräte der Verfahren sollte entweder durch Autoklavieren oder Einweichen Instrumente in 70% Ethanol vor Beginn des Verfahrens sterilisiert werden.
   2. Ein Schnitt ist oben auf dem Schädel hinter dem rechten Auge diagonal zurück auf die linke hintere des Schädels gemacht. Der Schnitt sollte etwa 10 mm bis 15 mm lang sein.
   3. Mit einem Q-Tip, langsam trennen den Einschnitt, den Schädel freizulegen, und wischen Sie die Membran, die zwischen dem Schädel und der Haut ist. Verwenden Sie ein Q-Tip, um das Blut beflecken und für starke Blutungen zu beobachten.
   4. Setzen Sie die Oberseite des Schädels, um die Bregma visualisieren. Mit dem Hamilton-Spritze Punkt, positionieren Sie es über das Bregma. Die richtige Position des Lochs im Schädel gebohrt werden soll 2 mm rechts und 1 mm anterior von Bregma (Abbildung 2). Ein Chirurg Filzspitze Marker, die gekauft sterilen wird, wird verwendet, um die Position des zu bohrenden Lochs markieren. Bitte beachten Sie, dass das Loch in der Nähe ist mit der ein sichterior Nahtlinie.
   5. Anschließend bohren Sie ein kleines Loch in den Schädel an der markierten Stelle mit der Spitze einer 22G-Nadel in einem Stift Vase oder Fed durch eine 18G Nadel.
   6. Laden Sie die 10 pl Glas Hamilton-Spritze mit 5 ul der Zellen. Der Hamilton-Spritze ist 10 ul mit einem stumpfen 30G bis 33G fester Nadel attached to it. Achten Sie darauf, um die Zellen vor dem Laden zu mischen, entweder durch Pipettieren ihnen oder mit einer 1 ml Spritze mit einer 25G Kanüle. Nach dem Hamilton-Spritze geladen wird, setzen Sie ihn wieder in den Arm, um es zu einer Linie mit dem Loch in den Schädel.
   7. Senken der bunt Ende der Nadel auf die Oberfläche des Schädels, sobald die Nadel Höhe der Schädeldecke; Senken der Nadel, bis sie in einer Tiefe von 3 mm unterhalb der Oberfläche des Schädels.
   8. Nachdem die Nadel abgesenkt wird, so ist dort für 2 Minuten keine schweres Trauma von der Nadel, die das Gehirn zu vermeiden. Implantation der Zellen ist mit einer Rate von 1 ul pro Minute für insgesamt 6-8 Minuten, achten Sie auf jeden backflow. Nachdem die letzte der Zellen implantiert worden sind, lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle für weitere 2 Minuten, damit alle Zellen, sich einzugewöhnen
   9. Entfernen Sie die Nadel aus dem Gehirn, und reinigen Sie das Loch mit einem Q-Tip. Fahren Sie mit der Nadel und Spritze mit 50% Actone, 100% EtOH und PBS, 3x in jeder Lösung und in dieser Reihenfolge zu reinigen.
   10. Die Haut auf dem Schädel bereit ist, an dieser Stelle vernäht werden. Mit 5-0 PBS schließen Sie den Schnitt mit etwa 3 Stiche.
   11. Lassen Sie die Maus zum Aufwachen auf einem Heizkissen, und erneut anwenden, Augensalbe, wenn nötig. Die Maus kann an den Käfig zurückgebracht werden, nachdem es auf Bewegungen auf seiner eigenen Shows (z. B. durch Anheben des Kopfes oder Bewegen der Schultern).

III. Die Behandlung der IC-Implantat durch Strahlung und Drug

1. Bestrahlung
   1. Abhängig von der Zell-Linie, kann die Behandlung der Mäuse Platz 5 bis 7 Tagen nach der Implantation zu nehmen. Unsere Abteilung nutzt einen Orthovolt Strahlentherapie-Einheit für die Strahlung behandelnment.
   2. Imaging wie BLI (Biolumineszenz-Bildgebung), MRT oder CT kann verwendet werden, um den Tumor vor der Randomisierung (Abbildung 3A) zu visualisieren.
   3. Die Mäuse werden betäubt mit der Ketamin / Xylazin / Kochsalzlösung Cocktail wie zuvor, und Augensalbe, um ihre Augen aufgetragen.
   4. Die Mäuse werden in einem speziell angefertigten Schablone Strahlung, die wie eine Torte Rad, in der die Köpfe der Mäuse zeigen in Richtung der Mitte konfiguriert positioniert ist. Die Körper der Mäuse werden von der Strahlung mit Blei abgeschirmt.
   5. Die medikamentöse Behandlung kann entweder vor oder Strahlung durch verschiedene Lieferwege, dh SQ, IP-und IV angegeben.

IV. Ergebnisse

Die Maus sollte aufwachen aus dem Verfahren innerhalb von 45-60 Minuten nach der Narkose Injektion. Wenn die Maus schwer Aufwachen hat sich nach dem Eingriff und die Zeit ist 1 überschritten ½ Stunde nach dem Eingriff kann die Maus nicht erholen und Euthanasie kann eine wirksame Alternative sein. Wenn there ist starke Blutungen oder der Schädel wird an jedem Punkt während des Verfahrens Euthanasie geknackt wird empfohlen. Wenn alles gut geht und je nach Zelllinie, sollte ein Tumor bilden, beginnen innerhalb von 2-4 Wochen nach dem Eingriff erfolgen hat. Bei der Verwendung von intrakraniellen Xenograft-Modellen, wird die therapeutische Wirksamkeit in der Regel als das Überleben nach der Implantation ⁵ gemessen. Da dies jedoch eine IC-Modell Anzeichen und Symptome wird vor Tod eintreten. Einige der körperlichen Zeichen der Maus zeigen können sind eine gekrümmte Haltung, Verlust von Körpergewicht, und Nichterwerbstätigkeit. Einige der neurologischen Symptome können Krampfanfälle, Kopfschiefhaltung und Verlust des Gleichgewichts sein. 3B zeigt eine HE-Färbung eines Tumors bei Mortalität. Eine Kaplan-Meier-Plot wird verwendet, um die Daten (Bild 4) zu bewerten. Die Anzahl der Tage des Überlebens bei 50% berechnet und verglichen mit der Kontrollgruppe. Wenn die Kombination Gruppe lebte länger als die Addition der einzelnen Strahlung und Drogen Arme die Kombination erfolgreich war.

Abbildung 1. Die Stölting stereotaktischen Geräten.

2. Eine schematische Darstellung der Position der Bohrung in der Maus Schädel.

3A. BLI Bildgebung nach Implantation GBM.

3B. H und E der GBM Tumor auf die Sterblichkeit.

Abbildung 4. Ergebnisse der U87 IC Implantate mit PARP-Inhibitor 7 Tage nach der Operation injiziert.

Discussion

Maligne Gliome, wie zB Glioblastoma multiforme, stellen die häufigsten primären Hirntumoren und haben eine schlechte Prognose ^4. Die Überlebenschancen von Patienten durch GBM betroffen praktisch unverändert geblieben ist während des letzten Jahrzehnts (dh 9-12 Monate nach der Diagnose) trotz der Fortschritte in der Chirurgie, Bestrahlung und Chemotherapie ^5. Die Merkmale eines geeigneten Modells für das Studium der Gliom-Behandlung sollte eine reproduzierbare Tumorlokalisation und Wachstum der Zellen als eine relativ diskrete Tumor; die Zellen sollten so nah wie möglich ähneln die histologischen Merkmale der menschlichen Gliomen; es sollte ein vorhersehbares Wachstum sein der Tumore, sollte die Fähigkeit des Tumors in Gewebekultur und dem Modell wachsen in einem kleinen Tier, um Kosten ^{6 zu} verringern. Effektive Behandlungen sind abhängig von experimentellen Modellen, die sehr ähnlich menschlichen GBM Merkmale für die Erprobung neuer Therapien und bieten ein genaues Verständnis der molekularen Grundlagen von widesprEAD Gliom Invasion ^7. Untersuchungen zur Biologie von Hirntumoren haben auch routinemäßig Zelllinien in vitro gezüchtet oder gehalten, um Informationen zu gewinnen ⁸ verwendet. Die Hemmung der Tumorinvasion und Angiogenese ist ein wichtiges Ziel bei der Entwicklung neuer therapeutischer Strategien gegen maligne Gliome ^9. Die begrenzten Behandlungen für Glioblastom haben eine intensive Suche nach genetischen Veränderungen zugrunde liegen, diese tödliche Krebs angetrieben, mit dem Ziel, die Entwicklung rationeller und effektiver Therapien ^10.