Kombinationen Radioterapi i en orthotopisk musehjerne tumormodel

Summary

Formålet med denne artikel er at beskrive brugen af ​​en orthotopisk glioblastom model for chemoradiation undersøgelser. Denne artikel vil gå gennem celle behandling, implantering, samt strålebehandling af musen ved hjælp af en intrakraniel model.

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) er den mest almindelige og aggressive voksne primære hjernetumorer ^1. I de senere år har der været betydelige fremskridt i forståelsen af mekanikken af tumor invasion, og direkte intracerebral podning af tumor giver mulighed for at observere den invasive proces i et fysiologisk egnet miljø ^2. For så vidt angår humane hjernetumorer vedkommende er orthotopisk model i øjeblikket er tilgængelige enten ved stereotaktisk injektion af cellesuspensioner eller implantering af et massivt stykke tumor via en kompliceret kraniotomi procedure ^3. I vores teknik vi høstes celler fra vævskultur for at skabe en cellesuspension, der anvendes til at implantere direkte ind i hjernen. Varigheden af ​​operationen er cirka 30 minutter, og da musen skal være i en konstant kirurgisk plan, er en injicerbar anæstetikum. Musen anbringes i en stereotaktisk jig ved Stoetling (figur 1). Aftis det kirurgiske område renses og fremstilles, er et snit, og bregma er placeret til at bestemme placeringen af ​​kraniotomi. Placeringen af ​​kraniotomi er 2 mm til højre og 1 mm rostralt for bregma. Dybden er 3 mm fra overfladen af ​​skallen, og cellerne injiceres ved en hastighed på 2 pi hvert 2. minut. Huden sutureres med 5-0 PDS, og musen bliver lov til at vågne op på en varmepude. Fra vores erfaring, afhængigt af den cellelinie kan behandlingen foregå fra 7-10 dage efter kirurgi. Afgivelsesenheden er afhængig af lægemiddelsammensætningen. For strålebehandling musene er bedøvet, og sat ind i en skræddersyet jig. Bly omfatter musens krop og udsætter kun hjernen på musen. Studiet af tumorigenese og evaluering af nye terapier for GBM kræver nøjagtige og reproducerbare hjernesvulst dyremodeller. Således har vi anvende denne orthotopisk hjerne model til at studere interaktionen af ​​mikromiljøet af hjernen og tumoren, til at teste effectivenESS af forskellige terapeutiske midler med og uden stråling.

Protocol

I. Cellepræparation

1. Cellerne dyrkes til sammenflydning i DMEM med 10% FBS omkring en 80% konfluente 225 ^cm3 kolbe for hver 5 mus, der implanteres.
2. Aspireres mediet ud af cellerne, vaskes med 10 ml PBS uden calcium eller magnesium. Aspirer PBS off-celler.
3. Trypsinisér cellerne med 3 ml trypsin, vente 10-15 minutter, og neutralisere trypsin med 15 ml medium.
4. Pipette alle celler og medier i en 50 ml konisk. To store kolber passer ind i en 50 ml konisk.
5. Spinde cellerne ved 1600 rpm i 7 min ved 4 ° C. Fuldstændigt aspirere supernatant. Resuspender cellerne i 10 ml kold PBS, og skyl-celler ved forsigtigt at pipettere op og ned. Sørge cellepelleten blandes ensartet med PBS. Suspensionen skal være overskyet.
6. På dette tidspunkt en celletælling udføres under anvendelse af en Coulter-tæller. Cellerne centrifugeres igen ved 1600 rpm i 7 min ved 4 ° C.
7. Efter ^2. centrifugering af cellerne, sompirat al PBS og resuspender i 1 ml PBS.
8. Cellerne centrifugeres i 1 ml PBS ved 3000 rpm i 10 min ved 4 ° C. PBS aspireres, og PBS tilsættes for at justere den endelige koncentration til 1x10 ⁶ pr 5 pi af U87-celler, kan andre cellelinier kræver et forskelligt antal og koncentration af celler til optimal tumorvækst.
9. Efter den afsluttende volumen og koncentration opnås cellerne holdes på is i en Eppendorf-rør.

II. Xenograft

1. Forberedelse af musen
   1. Musene bedøvet med en injektion blanding af ketamin / xylazin / saltvand. Blandingen er 120 mg / kg af ketamin, 16 mg / kg Rompun og saltvand. Musene vejes enkeltvis og gives 0,1 ml pr 10 g baseret på deres vægt. Den bedøvelse gives med 26G nål fastgjort til 1 ml sprøjte IP. Det tager ca 15 min til mus for at opnå en sovende fase ingen smerte respons. Du kan kontrollere smerten responsmus ved at klemme de trædepude.
   2. Efter at musen er fuldt bedøvet er øjensalve administreres til øjnene for at forhindre dem i at tørre ud.
   3. Musen anbringes på bunden af ​​det stereotaksiske med den forreste, øverste tænderne i indhakket på munden bar. Lejet anbringes derefter i stereotaktisk.
   4. Næsen vagt er placeret over musens næse for at forhindre bevægelse af hovedet, og ørets stængerne anbring forsigtigt i øregangene af musene. Vær omhyggelig med ikke at gøre hverken placeringen af ​​næsen bar eller øre barer for stramme, som skallen kan brud og / eller forhindre musen fra vejrtrækning.
   5. Sørg for, at lederen af ​​musen er niveauet ved hjælp af skalastreger på stereotaksiske er nyttigt under denne proces.
   6. For at prep musen, alkohol og providine jod påføres rigeligt på hovedet af musen vekslende for i alt 3 anvendelse af alkohol og 3 anvendelser af jod. En sidste anvendelse af en alkoholserviet med 70% anvendes tilhovedet.
2. Kirurgisk procedure
   1. Alle instrumenter i proceduren skal steriliseres enten ved autoklavering eller iblødsætning instrumenter i 70% ethanol, før du begynder proceduren.
   2. En incision foretages på toppen af ​​kraniet bag det højre øje diagonalt tilbage til venstre bageste af skallen. Indsnittet være omkring 10 mm til 15 mm lang.
   3. Ved hjælp af en Q-tip, skal du adskille langsomt snittet til at eksponere kraniet og tørre væk membran, der er mellem kraniet og huden. Brug en Q-tip at udviske enhver blod og se for voldsom blødning.
   4. Blotlægge toppen af ​​kraniet at visualisere bregma. Ved hjælp af Hamilton-sprøjte punkt, placeres over bregma. Den korrekte placering af hullet, der skal bores i kraniet er 2 mm til højre og 1 mm anterior af bregma (figur 2). En kirurg filtspids markør, som er købt sterile, anvendes til at markere placeringen af ​​hullet, der skal bores. Bemærk, at hullet er placeret tæt ved enterior suturlinien.
   5. Dernæst bores et lille hul i kraniet ved den markerede position med spidsen af ​​en 22G nål i en stift vase eller fødes gennem en 18G nål.
   6. Indlæse 10 ul glasset Hamilton-sprøjte med 5 ul celler. Den Hamilton-sprøjte er 10 gl med en stump 30G til 33G stationære nål fastgjort dertil. Sørg for at blande cellerne inden du lægger dem, enten ved pipettering dem eller ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en 25G nål påsat. Efter Hamilton-sprøjte er fyldt, anbringes igen i armen at line op med hul i kraniet.
   7. Sænke stinkbrand ende af kanylen til overfladen af ​​skallen, når nålen er i niveau med skallen, sænke nålen, indtil den er i en dybde på 3 mm under overfladen af ​​skallen.
   8. Efter at nålen er sænket, vil det stadig er i 2 minutter for at undgå større trauma fra nålen påvirker hjernen. Implantere celler med en hastighed på 1 pi per minut i i alt 6-8 minutter passe enhver backflow. Efter den sidste af cellerne har været implanteret, skal du lade nålen på plads i yderligere 2 minutter, så alle cellerne at bosætte sig i.
   9. Fjern kanylen fra hjernen, og rengør hullet med en Q-tip. Fortsæt at rengøre kanylen og sprøjten med 50% acetone, 100% EtOH, og PBS, 3x i hver løsning, og i nævnte rækkefølge.
   10. Huden på kraniet er klar til at blive sutureres på dette tidspunkt. Brug 5-0 PBS lukke snittet med omkring 3 sting.
   11. Tillade musen til at vågne op på en varmepude, og genanvende øjensalve, hvis nødvendigt. Musen kan returneres til buret efter viser bevægelse i sig selv (dvs. at løfte hovedet eller bevæge skuldre).

III. Behandling af IC implantatet ved stråling and Drug

1. Strålebehandling
   1. Afhængigt af den cellelinie, kan behandling af musene sted 5 til 7 dage efter implantation. Afdelingen anvender en orthovoltage radioterapi enhed for stråling behandlingling.
   2. Billeddannelse såsom BLI (Bioluminescence Imaging), MRI eller CT kan anvendes til at visualisere tumoren før randomisering (figur 3A).
   3. Musene bedøves med ketamin / xylazin / saltvand cocktail som før, og øjensalve anvendes til øjnene.
   4. Musene anbringes i en skræddersyet stråling emneholderen, der er konfigureret som et cirkeludsnit hjul, hvori lederne af musene peger mod centrum. Ligene af musene er afskærmet fra strålingen med bly.
   5. Medicinsk behandling kan gives enten før eller stråling gennem forskellige administrationsveje, dvs SQ, IP-og IV.

IV. Resultater

Musen skal vågne op fra proceduren inden for 45-60 minutter efter anæstesi injektion. Hvis musen difficultly er at vågne op efter indgrebet, og tiden er overskredet 1 ½ time efter den procedure, kan musen ikke komme og eutanasi kan være et effektivt alternativ. Hvis there er overdreven blødning eller kraniet bliver revnede på ethvert tidspunkt i løbet af proceduren eutanasi anbefales. Hvis alt går godt, og afhængigt af cellelinjen, bør en tumor begynder at danne inden for 2-4 uger efter den procedure finder sted. Ved anvendelse af intrakranielle xenograft modeller, er terapeutiske virkning normalt målt som overlevelse efter implantation ^5. Da dette er en IC model symptomer vil forekomme før døden. Nogle af de fysiske symptomer på musen kan udvise er en krum stilling, tab af kropsvægt, og inaktivitet. Nogle af de neurologiske symptomer kan være anfald, hoved tilt og tab af balance. Figur 3B viser en HE-farvning af en tumor på mortalitet. En Kaplan-Meier plot anvendes til at evaluere data (figur 4). Antallet af dage for overlevelse på 50% er beregnet og sammenlignet med kontrollen. Hvis kombinationen gruppen levede længere end tilsætningen af ​​individuelle stråling og lægemiddel arme kombinationen var vellykket.

Figur 1. Den Stoelting stereotaktisk udstyr.

Figur 2. Et diagram af placeringen af hullet i mus kraniet.

Figur 3A. BLI billeddannelse efter GBM implantation.

Figur 3B. H og E GBM tumor på dødelighed.

Figur 4. Resultater af U87 IC implantater injiceret med PARP inhibitor 7 dage efter kirurgi.

Discussion

Maligne gliomer, såsom glioblastoma multiforme, repræsenterer de mest almindelige primære hjernetumorer og har en trist prognose ^4. Overlevelse af patienter, der lider af GBM er forblevet stort set uændret i løbet af de sidste ti år (dvs. 9-12 måneder efter diagnose) på trods af fremskridt inden for kirurgi, strålebehandling og kemoterapi ^5. Trækkene ved en passende model til undersøgelse af glioma behandling bør indeholde en reproducerbar placering af tumor og vækst af celler som et relativt diskret tumor; cellerne bør ligne så tæt som muligt histologiske træk humane gliomer, bør der være en forudsigelig vækst hastigheden af tumoren skal evne til at vokse tumor i vævskultur, og modellen er i et lille dyr for at reducere omkostning ^6. Effektive behandlinger afhænger af eksperimentelle modeller, der nøje ligner menneskelige GBM egenskaber til afprøvning af nye terapi og giver en præcis forståelse af det molekylære grundlag for widesprEAD gliom invasion ^7. Undersøgelser af biologien af hjernetumorer er også anvendes rutinemæssigt cellelinjer dyrket eller opretholdt in vitro for at opnå information ^8. Inhibering af tumorinvasion og angiogenese er et vigtigt mål for udvikling af nye terapeutiske strategier mod maligne gliomer ^9. De begrænsede behandlinger muligheder for glioblastom har kørt en intensiv eftersøgning i de genetiske læsioner ligger til grund for denne dødelige kræft, med det formål at udvikle mere rationelle og mere effektive behandlinger ^10.