Summary
والغرض من هذه المقالة لوصف استخدام نموذج ورم أرومي دبقي orthotopic للدراسات chemoradiation. هذه المادة سوف تذهب على الرغم من تجهيز الخلية، وزرع، والعلاج الإشعاعي من الفأرة باستخدام نموذج داخل الجمجمة.
Abstract
ورم أرومي دبقي الأشكال (GBM) هي الأكثر شيوعا وعدوانية الكبار أورام الدماغ الأولية 1. في السنوات الأخيرة قد شهدت تقدما كبيرا في فهم آليات غزو الورم، والتلقيح داخل المخ مباشرة من ورم يتيح الفرصة لمراقبة عملية الغازية في بيئة ملائمة من الناحية الفسيولوجية 2. بقدر ما نشعر بالقلق أورام الدماغ البشري، وضعت نماذج orthotopic المتاحة حاليا إما عن طريق الحقن التجسيمي من الايقاف الخلية أو زرع قطعة صلبة من الورم من خلال إجراء حج القحف معقدة 3. في تقنية حصاد الخلايا لدينا نحن من زراعة الأنسجة لإنشاء تعليق خلية تستخدم لزرع مباشرة في الدماغ. مدة الجراحة ما يقرب من 30 دقيقة، وكذلك فأرة يجب أن يكون في الطائرة جراحية ثابت، يتم استخدام مخدر عن طريق الحقن. يتم وضع الماوس في رقصة التجسيمي الذي أدلى به Stoetling (الشكل 1). الخلفإيه يتم تنظيف منطقة الجراحية وأعدت، يتم إجراء شق، ويقع bregma لتحديد موقع حج القحف. مكان حج القحف هو 2 ملم إلى اليمين و1 ملم منقاري إلى bregma. وعمق 3 مم من سطح الجمجمة، ويتم حقن الخلايا بمعدل 2 ميكرولتر كل دقيقة 2. يتم خياطة الجلد مع PDS 5-0، ويسمح الماوس لتستيقظ على وسادة التدفئة. من تجربتنا، اعتمادا على خط الخليوي، ويمكن علاج في الفترة من 7-10 أيام بعد الجراحة. تسليم المخدرات يعتمد على تركيبة الدواء. لتلقي العلاج الإشعاعي للفئران هي تخدير، ووضع في العرف تهزهز. الرصاص يغطي الجسم الماوس، ويعرض فقط في الدماغ من الفأرة. دراسة تكون الأورام وتقييم علاجات جديدة للالخليج للحاسبات الآلية تتطلب دقة وقابلة للتكرار النماذج الحيوانية ورم دماغي. وبالتالي نحن نستخدم هذا النموذج الدماغ orthotopic لدراسة التفاعل بين المكروية في الدماغ وورم في، لاختبار effectivenوفاق سطيف من العوامل العلاجية مختلفة مع وبدون إشعاع.
Protocol
أولا خلية التحضير
- وتزرع الخلايا لالتقاء في DMEM مع FBS 10٪ حوالي 80٪ متكدسة 225 قارورة 3 سم في كل الفئران من 5 إلى أن مزروع.
- نضح وسائل الاعلام الخروج من الخلايا؛ غسل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم. نضح PBS الخلايا قبالة.
- يعرض للتريبسين الخلايا مع 3 مل من التربسين، انتظر 10-15 دقيقة، وتحييد التربسين مع 15 مل من وسائل الإعلام.
- الماصة جميع الخلايا وسائل الاعلام الى مخروطي 50 مل. اثنين من قوارير كبيرة تنسجم مع واحدة مخروطية 50 مل.
- تدور الخلايا في 1600 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح تماما طاف. Resuspend الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة، وشطف الخلايا pipetting بلطف صعودا ونزولا. تأكد من أن الخلية يتم خلط بيليه بشكل موحد مع برنامج تلفزيوني. يجب أن يكون التعليق غائم.
- في هذا الوقت ويتم تعداد الخلايا باستخدام عداد كولتر. وطرد الخلايا مرة أخرى في 1600 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية.
- بعد الطرد المركزي الثانية 2 من الخلايا، كماقرصان كل برنامج تلفزيوني وresuspend في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- ونسج الخلايا في 1ml من برنامج تلفزيوني في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. ويستنشق في برنامج تلفزيوني، ويضاف برنامج تلفزيوني لضبط تركيز النهائي ل1x10 6 في 5 ميكرولتر لU87 الخلايا، قد خطوط الخلايا الأخرى تتطلب عددا المختلفة، وتركيز الخلايا السرطانية للنمو الأمثل.
- بعد الحصول على الحجم النهائي والتركيز وتحفظ الخلايا على الجليد في أنبوب إيبندورف.
II. طعم أجنبي
- إعداد الماوس
- الفئران هي تخدير باستخدام مزيج من الحقن الكيتامين / زيلازين / المؤسسة العامة لتحلية. هذا الخليط هو 120 ملغم / كغم من الكيتامين، و 16 ملغم / كغم من Rompun والمالحة. يتم وزن الفئران بشكل فردي وإعطاء 0.1 مل لكل 10 جرام بناء على وزنهم. يعطى مخدر مع إبرة 26G المرفقة 1 مل حقنة IP. سوف يستغرق حوالي 15 دقيقة للفئران من أجل التوصل إلى مرحلة النوم لأية استجابة الألم. يمكنك التحقق من استجابة الألم للالفئران عن طريق معسر قاطع الطريق الخاصة بهم.
- بعد الفأر هو تخدير كامل، ويدير مرهم العين لعيونهم لمنعهم من الجفاف.
- يتم وضع الماوس على السرير من التجسيمي مع الأسنان العلوية الأمامية في الدرجة الأولى على شريط الفم. ثم يتم وضع السرير في التجسيمي.
- يتم وضع حارس أنف فوق الأنف الماوس، لمنع الحركة من الرأس، وأشرطة الأذن يتم وضع برفق في قنوات الأذن لدى الفئران. يجب الحرص على عدم القيام بأي وضع شريط الأنف أو الأذن أشرطة ضيقة جدا، كما قد كسر في الجمجمة و / أو منع الفأر من التنفس.
- تأكد من أن رأس الفأر هو مستوى استخدام علامات التجزئة على التجسيمي مفيد خلال هذه العملية.
- إلى الإعدادية يتم تطبيق اليود الماوس والكحول وprovidine بتحرر على رأس الماوس بالتناوب على ما مجموعه 3 تطبيق من التطبيقات الكحول و 3 من اليود. يتم تطبيق طلب واحد نهائي لوحة الكحول بنسبة 70٪ لتصل إلىالرأس.
- إجراء العمليات الجراحية
- ويجب تعقيم جميع الأدوات في الإجراء إما عن طريق جهاز الأوتوكليف أو تمرغ الصكوك في الايثانول 70٪ قبل البدء في هذا الإجراء.
- يتم إجراء شق على الجزء العلوي من الجمجمة وراء العين حق العودة بشكل مائل إلى اليسار الخلفي من الجمجمة. يجب أن يكون شق حوالي 10 ملم الى 15 ملم طويلة.
- استخدام Q-طرف، فصل ببطء شق لفضح الجمجمة ويمحو الغشاء الذي هو بين الجمجمة والجلد. استخدام Q-تلميح لطخة دم أي ومشاهدة لنزيف حاد.
- كشف الجزء العلوي من الجمجمة لتصور bregma. باستخدام محقنة نقطة هاملتون، وضعه على مدى bregma. الموضع الصحيح من الحفرة التي حفرها في الجمجمة هو 2 ملم وحق 1 ملم الأمامي من bregma (الشكل 2). ويستخدم الجراح شعر ذات الرؤوس علامة، التي يتم شراؤها عقيمة، للاحتفال موقع الحفرة التي حفرها. يرجى ملاحظة أن يقع حفرة على مقربة من 1terior خياطة خط.
- المقبل، حفر ثقب صغير في الجمجمة في موقف واضح باستخدام نقطة من إبرة 22G في إناء دبوس أو بنك الاحتياطي الفيدرالي من خلال إبرة 18G.
- تحميل 10 ميكرولتر زجاج هاميلتون المحاقن مع 5 ميكرولتر من الخلايا. الحقنة هاملتون هو 10 ميكرولتر مع 30G حادة إلى إبرة ثابت 33G المرتبطة به. تأكد من خلط الخلايا قبل تحميلها، إما عن طريق pipetting لهم أو باستخدام محقنة 1ml بإبرة 25G المرفقة. بعد تحميل حقنة هاملتون، وضعه مرة أخرى في الذراع على خط هذا الامر مع ثقب في الجمجمة.
- خفض نهاية نطحة من الإبرة على سطح الجمجمة، مرة واحدة في الإبرة مستوى مع الجمجمة والوجه والإبر فيه حتى على عمق 3 مم تحت سطح الجمجمة.
- بعد أن يتم خفض إبرة ويظل هناك لمدة 2 دقيقة لتجنب أي صدمة كبرى من الإبرة التي تؤثر على الدماغ. زرع الخلايا بمعدل من 1 ميكروليتر في الدقيقة الواحدة أي ما مجموعه 6-8 دقائق، وتوخي الحذر من أي backfloدبليو. بعد أن تم زرعها وكان آخر من الخلايا، وترك الإبرة في مكانها لمدة 2 دقيقة، للسماح لجميع الخلايا ليستقر فيها.
- إزالة الإبرة من الدماغ، وتنظيف حفرة مع Q-تلميح. والمضي قدما لتنظيف الإبر والمحاقن مع Actone 50٪، EtOH 100٪، وبرنامج تلفزيوني، 3X في كل حل وفقا لهذا الترتيب.
- الجلد على جمجمة جاهزة للخياطة في هذه المرحلة. استخدام 5-0 PBS إغلاق شق مع غرز حوالي 3.
- السماح الماوس لتستيقظ على وسادة الحرارة، وتطبيق مرهم العين إذا لزم الأمر. يمكن إرجاع الماوس إلى القفص بعد أن تبين الحركة من تلقاء نفسها (أي يرفع الرأس أو تحريك الكتفين).
ثالثا. علاج للزرع IC عن الإشعاع والدواء
- الإشعاع علاج
- اعتمادا على خط الخليوي، ويمكن علاج من الفئران تجرى 5 إلى 7 أيام بعد عملية الزرع. لدينا قسم وحدة العلاج الإشعاعي يستخدم لعلاج الإشعاع orthovoltageمنة.
- ويمكن استخدام التصوير مثل BLI (التصوير ضوء بارد)، التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي لتصور الورم قبل التوزيع العشوائي (الشكل 3A).
- الفئران هي تخدير مع كوكتيل الكيتامين / زيلازين / المالحة كما كانت من قبل، ويطبق مرهم العين لعيونهم.
- يتم وضع الفئران في رقصة مخصص الإشعاع التي تم تكوينه مثل عجلة فطيرة، والتي رؤساء الفئران تشير نحو الوسط. محمية الهيئات من الفئران من الإشعاع مع الرصاص.
- يمكن إعطاء العلاج من تعاطي المخدرات سواء قبل أو إشعاع من خلال طرق مختلفة للإنجاز، أي SQ، والملكية الفكرية والرابع.
رابعا. النتائج
وينبغي أن الماوس استيقظ من هذا الإجراء في غضون 45-60 دقيقة بعد حقن التخدير. إذا الماوس والاستيقاظ صعوبة حتى بعد إجراء العملية والوقت قد تجاوز 1 ونصف ساعة بعد العملية، قد لا يتعافى الماوس والقتل الرحيم قد يكون بديلا فعالا. إذا اليحرث هو النزيف أو ينصح الجمجمة يصبح تصدع في أي لحظة خلال القتل الرحيم الداخلي. إذا سارت الامور بشكل جيد، واعتمادا على خط الخليوي، وينبغي أن يبدأ تشكيل ورم في غضون 2-4 أسابيع بعد إجراء العملية لها أن تحدث. عند استخدام النماذج طعم أجنبي داخل الجمجمة، وعادة ما تقاس الكفاءة العلاجية والبقاء على قيد الحياة بعد زرع 5. ومع ذلك، وهذا هو و1 علامات نموذج IC والأعراض تحدث قبل وفاته. بعض من علامات جسدية الماوس قد يحمل هي التقوس في الجلوس، وفقدان وزن الجسم، وقلة النشاط. قد يكون بعض من علامات العصبية تكون المضبوطات، وإمالة الرأس، وفقدان التوازن. الشكل 3B يظهر معالي وصمة من وجود ورم في معدل الوفيات. ويتم استخدام مؤامرة كابلان ماير لتقييم البيانات (الشكل 4). يتم حساب عدد الأيام اللازمة للبقاء على قيد الحياة بنسبة 50٪ ومقارنة بالكنترول. إذا كان الجمع بين مجموعة عاش أطول من إضافة للإشعاع الفردية والأسلحة والمخدرات كانت مجموعة ناجحة.
الشكل 1. ومعدات Stoelting التجسيمي.
الشكل 2. رسم تخطيطي للموقع من حفر حفرة في جمجمة الفأر.
الرقم 3A. BLI التصوير بعد غرس الخليج للحاسبات الآلية.
3B شخصية. H و E من ورم الخليج للحاسبات الآلية في معدل الوفيات.
الشكل 4. النتائج من يزرع IC U87 حقنوا المانع PARP 7 أيام بعد الجراحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الاورام الدبقية الخبيثة، مثل ورم أرومي دبقي الأشكال، تمثل الأكثر شيوعا أورام الدماغ الأولية والحصول على التشخيص الكئيب 4. وقد ظل بقاء المرضى المتضررين من الخليج للحاسبات الآلية دون تغيير تقريبا خلال العقد الماضي (أي 9-12 شهرا في مرحلة ما بعد التشخيص) على الرغم من التقدم في مجال جراحة، والاشعاع، والعلاج الكيميائي 5. وينبغي أن ملامح نموذج مناسب لدراسة علاج دبقي تشمل موقع الورم استنساخه ونمو الخلايا السرطانية باعتبارها منفصلة نسبيا، ويجب أن يشبه خلايا بأكبر قدر ممكن من ملامح النسيجي للالاورام الدبقية الإنسان؛ يجب أن يكون هناك نمو قابل للتنبؤ معدل من الورم، وينبغي أن القدرة على النمو للورم في زراعة الأنسجة والنموذج يكون في الحيوانات الصغيرة للحد من النفقات 6. علاجات فعالة تعتمد على النماذج التجريبية التي تشبه صفات الإنسان الخليج للحاسبات الآلية لاختبار العلاج الجديد، وتوفير فهم دقيق من الأساس الجزيئي للwidesprEAD دبقي غزو 7. تحقيقات في علم الاحياء من أورام الدماغ كما تستخدم بشكل روتيني خطوط الخلايا نمت أو الاحتفاظ بها في المختبر للحصول على المعلومات 8. تثبيط غزو الورم والأوعية الدموية هو هدف رئيسي في وضع استراتيجيات علاجية جديدة لمكافحة الاورام الدبقية الخبيثة 9. تسببت في محدودية الخيارات المتاحة لعلاج ورم أرومي دبقي عملية بحث مكثفة في الآفات الوراثية الكامنة وراء هذا السرطان القاتل، وذلك بهدف تطوير علاجات أكثر عقلانية وأكثر فعالية 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
ويدعم هذا البحث من خلال تمويل من البرنامج ضمن الجدران من المعاهد الوطنية للصحة.
References
- Bleau, A. M., Holland, E. Trapping the mouse genome to hunt human alternations. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7737-7738 (2007).
- McGrady, B. J., McCormick, D. A murine model of intracranial invasion: morphological observations on central nervous system invasion by melanoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 10, 387-393 (1992).
- Fei, X., Zhang, Q., Dong, J., Diao, y, Wang, Z., Li, R., Wu, Z., Wang, A., Lan, Q., Zhang, S., Huang, Q. Development of clinically relevant orthotopic xenograft mouse model of metastatic lung cancer and glioblastoma through surgical tumor tissues injection with trocar. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 29, 84-84 (2010).
- Fujita, M., Zhu, X., Sasaki, K., Ueda, R., Low, K., Pollack, I., Okada, H. Inhibition of STAT3 Promotes the Efficacy of Adoptive Transfer Therapy Using Type-1 CTLs by Modulation of the Immunological Microenvironment in a Murine Intracranial Glioma. J. Immunol. 180, 2089-2098 (2008).
- Candolfi, M., Curtin, J. F., Nichols, W. S., Muhammad, A. K. M. . G., King, G., Pluhar, G. D., McNiel, G. E., Ohlfest, E. A., Freese, J. R., Moore, P. F. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathlogical characterization and tumor progression. J. Neurooncol. 85, 133-148 (2007).
- Kaye, A., Morstyn, G., Gardner, I., Pyke, K. Development of a xenograft glioma model in mouse brain. Cancer Research. 46, 1367-1373 (1986).
- Zhao, Y., Xiao, A., diPierro, C., Carpenter, J., Abdel-Fattah, R., Redpath, G., Lopez, M., Hussaini, I. An Extensive Invasive Intracranial Human Glioblastoma Xenograft Model. American Journal of Pathology. 176, 3032-3049 (2010).
- Learn, C., Grossi, P., Schmittling, R., Xie, W., Mitchell, D., Karikari, I., Wei, Z., Dressman, H., Sampson, J. Genetic Analysis of Intracranial Tumors in a Murine Model of Glioma Demonstrate a Shift in Gene Expression in Response to Host Immunity. J. Neuroimmunol. 182, 63-72 (2007).
- Martens, T., Laabs, Y., Günther, H., Kemming, D., Zhu, Z., Witte, L., Hagel, C., Westphal, M., Lamszus, K. Inhibition of Glioblastoma Growth in a Highly Invasive Nude Mouse Model Can Be Achieved by Targeting Epidermal Growth Factor Receptor but not Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2. Clin. Cancer Res. 14, 5447-5458 (2008).
- Purow, B., Schiff, D. Advances in the genetics of glioblastoma: are we reaching critical mass. Nat. Rev. Neurol. 5, 419-426 (2009).
