Kombination Strålbehandling i en ortotop mus hjärntumör modell

Summary

Syftet med denna artikel är att beskriva användningen av en ortotopisk glioblastom modell för chemoradiation studier. Denna artikel kommer gå igenom cellbearbetningen, implantera och strålbehandling av musen med en intrakraniell modell.

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) är den vanligaste och aggressiva vuxna primära hjärntumörer ^1. Under senare år har det skett betydande framsteg i förståelsen av mekanik av tumör invasion, och direkt intracerebral inokulering av tumör ger möjlighet att observera invasiva processen i en fysiologiskt lämplig miljö ^2. När det gäller de mänskliga hjärntumörer gäller är ortotopisk modellerna för närvarande finns tillgängliga antingen genom stereotaxisk injektion av cellsuspensioner eller implantera en solid bit av tumören genom en komplicerad kraniotomi förfarande ^3. I vår teknik vi skörda cellerna från vävnadskultur för att skapa en cellsuspension användes för att implantera direkt in i hjärnan. Varaktigheten av kirurgi är ca 30 minuter, och som musen måste vara i ett konstant kirurgisk plan, är en injicerbar bedövningsmedel. Den mus placeras i en stereotaxisk jigg genom Stoetling (figur 1). AftER det kirurgiska området renas och beredas, görs ett snitt, och om bregma är belägen för att bestämma läget av kraniotomi. Placeringen av kraniotomi är 2 mm till höger och 1 mm rostralt om bregma. Djupet är 3 mm från ytan av skallen, och cellerna injiceras med en hastighet av 2 pl var 2 minuter. Huden sutureras med 5-0 PDS och musen är tillåten att vakna upp på en värmedyna. Enligt vår erfarenhet beroende på cellinjen, kan behandlingen ske från 7-10 dagar efter operation. Avgivning av läkemedel är beroende av läkemedelskompositionen. För strålbehandling mössen bedövas, och placerades i en skräddarsydd jigg. Bly täcker musens kropp och exponerar endast hjärna musen. Studiet av tumörbildning och utvärdering av nya terapier för GBM kräver noggranna och reproducerbara hjärnan modellerna tumör djur. Sålunda vi använder detta ortotopisk hjärnan modell för att studera interaktionen av mikroomgivningen av hjärnan och tumören, för att testa effectivenESS i olika terapeutiska medel med och utan strålning.

Protocol

I. Cell Preparation

1. Cellerna odlas till konfluens i DMEM med 10% FBS ca en 80% sammanflytande 225 cm ^3-kolv för varje 5 möss som skall implanteras.
2. Aspirera mediet bort från cellerna; tvätta med 10 ml PBS utan kalcium eller magnesium. Aspirera PBS utanför celler.
3. Trypsinisera celler med 3 ml trypsin, vänta 10-15 min, och neutralisera trypsin med 15 ml av media.
4. Pipettera alla celler och media i en 50 ml konisk. Två stora kolvar passa in i en 50 ml konisk.
5. Snurra celler vid 1600 rpm under 7 min vid 4 ° C. Helt aspirera supernatanten. Återsuspendera cellerna i 10 ml kall PBS, och skölj-celler genom att försiktigt pipettera upp och ned. Se till cellpelleten blandas likformigt med PBS. Suspensionen ska vara grumlig.
6. Vid denna tidpunkt en cellräkning görs genom att använda en Coulter-räknare. Cellerna centrifugerades igen vid 1600 rpm under 7 min vid 4 ° C.
7. Efter 2: ^a centrifugering av cellerna, sompirat alla PBS och resuspendera i 1 ml PBS.
8. Cellerna centrifugerades i 1 ml av PBS vid 3000 rpm under 10 min vid 4 ° C. PBS aspireras, och PBS tillsattes för att justera den slutliga koncentrationen till 1x10 ⁶ per 5 pl för U87-celler, kan andra cellinjer kräva olika antal och koncentration av celler för optimalt tumörtillväxt.
9. Efter den slutliga volymen och koncentrationen erhålles cellerna hölls på is i en Eppendorf-rör.

II. Xenotransplantat

1. Förbereda musen
   1. Mössen sövs med användning av en injektion blandning av ketamin / xylazin / saltlösning. Blandningen är 120 mg / kg av ketamin, 16 mg / kg av Rompun och saltlösning. Mössen vägdes individuellt och gavs 0,1 ml per 10 g baserat på vikt. Bedövningsmedlet ges med 26G nål fäst till 1 ml spruta IP. Det kommer att ta cirka 15 min för de möss att nå en sovande fas för ingen smärta svar. Du kan kontrollera smärtan svarmöss genom att nypa dem fotsulan.
   2. När musen är helt bedövad, är ögonsalva ges till deras ögon att hindra dem från uttorkning.
   3. Musen placeras på botten av stereotaktisk med de främre övre tänderna i skåran på munnen bar. Bädden placeras sedan i den stereotaktiska.
   4. Nosskyddet placeras över musens nos för att förhindra rörelse av huvudet, och örat stängerna placera försiktigt i hörselgången på mössen. Var noga med att inte göra något placering av den främre staven eller barer örat för hårt, eftersom skallen kan brytas och / eller förhindra musen från att andas.
   5. Se till att chefen för musen är nivå med skalstrecken på stereotaxiska är användbart under denna process.
   6. För att prep musen, alkohol och providine jod appliceras frikostigt på huvudet av musen omväxlande för sammanlagt 3 Tillämpning av alkohol och 3 tillämpningar av jod. En sista tillämpning av en spritsudd med 70% tillämpas påhuvudet.
2. Kirurgisk förfarande
   1. Alla instrument i förfarandet bör steriliseras antingen genom autoklavering eller blötläggning instrument i 70% etanol innan proceduren påbörjas.
   2. Ett snitt görs på toppen av skallen bakom det högra ögat diagonalt bakåt till vänster bakre delen av kraniet. Snittet bör vara ca 10 mm till 15 mm lång.
   3. Med hjälp av en Q-tip, långsamt separera snittet att exponera skallen och torka bort det membran som är mellan skallen och huden. Använd en tops för att utplåna alla blod och titta på för kraftig blödning.
   4. Exponera den övre delen av skallen för att visualisera bregma. Använda Hamilton sprutan punkten, placera den över bregma. Rätt läge på hålet som ska borras i skallen är 2 mm höger och 1 mm främre delen av bregma (figur 2). En kirurg filtspets markör, som köps sterilt, används för att markera läget av hålet som skall borras. Observera att hålet är beläget i närheten av enplattformbåtens interiör sömlinje.
   5. Därefter borra ett litet hål i skallen vid den markerade positionen med hjälp av spetsen på en 22G nål i en PIN-kod vas eller matas genom en 18G nål.
   6. Ladda 10 pl glas Hamilton-spruta med 5 pl av cellerna. The Hamilton Sprutan är 10 pl med ett trubbigt 30G till 33G fast nål fäst vid den. Var noga med att blanda cellerna innan du lägger i dem, antingen genom att pipettera dem eller använda en 1 ml spruta med en kanyl 25G nål. Efter att Hamilton sprutan är laddad, sätt tillbaka den i armen att rada upp det med hålet i skallen.
   7. Sänk bunt slutet av nålen till ytan av skallen, när nålen är i nivå med skallen, sänka nålen tills den är på ett djup av 3 mm under ytan av skallen.
   8. Efter att nålen är nedsänkt, skall den förbli där under 2 minuter för att undvika betydande trauma från nålen som påverkar hjärnan. Implantation av cellerna är i en takt av 1 ^ il per minut under totalt 6-8 minuter, var försiktig med någon backflow. Efter den sista av de celler har implanterats, lämna nålen på plats i ytterligare 2 minuter, så att alla celler för att lösa in
   9. Ta bort nålen från hjärnan, och rengör hålet med en Q-tip. Fortsätt att rengöra nålen och sprutan med 50% aceton, 100% EtOH, och PBS, 3x i varje lösning och i den ordningen.
   10. Huden på skallen är färdigt att sutureras vid denna punkt. Med 5-0 PBS nära snittet med cirka 3 stygn.
   11. Låt musen för att vakna upp på en värme-pad, och återanvända ögonsalva om det behövs. Musen kan återföras till buren efter att den visar rörelse på egen hand (dvs. lyfta upp huvudet eller flytta axlarna).

III. Behandling av IC implantatet genom strålning och läkemedel

1. Strålbehandling
   1. Beroende på cellinjen, kan behandling av mössen ske 5 till 7 dagar efter implantation. Vår avdelning använder en orthovoltage strålbehandling enhet för strålning behandlingning.
   2. Avbildning såsom BLI (Bioluminescens Imaging), MRI eller datortomografi kan användas för att visualisera tumören före randomisering (figur 3A).
   3. Bedövas mössen med ketamin / xylazin / saltlösning cocktail som tidigare, och ögonsalva appliceras till ögonen.
   4. Mössen är placerade i en specialtillverkad strålning jigg som är konfigurerad som en paj hjul, där cheferna för de möss som pekar mot centrum. Kropparna av mössen avskärmade från strålningen med bly.
   5. Läkemedelsbehandling kan ges antingen före eller strålning genom olika leverans vägar, dvs SQ, IP och IV.

IV. Resultaten

Musen ska vakna upp från förfarandet inom 45-60 minuter efter anestesi injektion. Om musen har svårighet att vakna upp efter ingreppet och tiden har överstigit 1 ½ timme efter ingreppet, kan musen återhämta inte och eutanasi kan vara ett effektivt alternativ. Om teere är överdriven blödning eller skallen blir knäckt när som helst under förfarandet dödshjälp rekommenderas. Om allt går bra och beroende på cell-linjen, bör en tumör börja bilda inom 2-4 veckor efter ingreppet har ske. Vid användning av intrakraniella xenograft modeller är terapeutisk effekt brukar mätas som överlevnad efter implantation ^5. Men eftersom detta är en IC-modell tecken och symtom kommer att ske före döden. Några av de fysiska tecken musen kan uppvisa är ett krökt kroppshållning, förlust av kroppsvikt och inaktivitet. Några av de neurologiska tecken kan vara kramper, chef tilt och förlust av balans. Figur 3B visar en HE-färgning av en tumör i mortalitet. En Kaplan-Meier plotten används för att utvärdera data (figur 4). Antalet dagar av överlevnad vid 50% beräknas och jämförs med kontrollen. Om kombinationen gruppen levde längre än tillägg av individens strålning och armarna läkemedel kombinationen lyckades.

Figur 1. Stoelting Stereotaktisk utrustning.

Figur 2. Ett diagram över placeringen av borrhålet i mus skallen.

Figur 3A. BLI imaging efter GBM implantation.

Figur 3B. H och E i GBM tumör vid dödlighet.

Figur 4. Resultat från U87 IC implantat injiceras med PARP-hämmare 7 dagar efter operation.

Discussion

Maligna gliom, såsom glioblastoma multiforme, representerar de vanligaste primära hjärntumörer och har en dyster prognos ^4. Överlevnaden hos patienter som drabbats av GBM har förblivit i stort sett oförändrad under det senaste decenniet (dvs, 9-12 månader efter diagnos) Trots framsteg inom kirurgi, strålning och kemoterapi ^5. Funktionerna i en lämplig modell för studier av gliom behandlingen ska innehålla en reproducerbar tumörplacering och tillväxt av cellerna som en relativt diskret tumör, de celler som ska likna så nära som möjligt de histologiska drag av mänskliga gliom, det bör finnas en förutsägbar tillväxt hastighet av tumören, bör förmågan att växa i tumören i vävnadskultur och modellen är i ett litet djur för att minska kostnaden ^6. Effektiva behandlingar beror på experimentella modeller som nära liknar mänskliga GBM egenskaper för att testa nya terapi och som ger en korrekt förståelse av den molekylära grunden för widesprEAD gliom invasion ^7. Utredningar biologi hjärntumörer har också rutinmässigt används cellinjer som odlats eller upprätthållas in vitro för att få information ^8. Inhibering av tumörinvasion och angiogenes är ett viktigt mål för utvecklingen av nya terapeutiska strategier mot malignt gliom ^9. De begränsade behandlingar alternativen för glioblastom har drivit en intensiv sökning i de genetiska skadorna som ligger bakom denna dödliga cancer, i syfte att utveckla mer rationella och effektiva terapier ^10.