La radiothérapie combinée à un modèle de tumeur de cerveau de souris orthotopique

Summary

Le but de cet article est de décrire l'utilisation d'un modèle de glioblastome orthotopique pour les études de chimioradiothérapie. Cet article va passer si le traitement des cellules, l'implantation, et de la radiothérapie de la souris en utilisant un modèle intracrânienne.

Abstract

Le glioblastome multiforme (GBM) sont les plus communs et agressifs adultes tumeurs cérébrales primaires ^1. Ces dernières années il ya eu des progrès substantiels dans la compréhension des mécanismes de l'invasion tumorale, et l'inoculation intracérébrale directe de la tumeur fournit l'occasion d'observer le processus invasif dans un environnement physiologique appropriée ^2. En ce qui concerne les tumeurs cérébrales de l'homme sont concernés, les modèles actuellement disponibles orthotopiques sont établies soit par injection stéréotaxique de suspensions cellulaires ou d'implantation d'un morceau de la tumeur par le biais d'une procédure compliquée craniotomie ^3. Dans notre technique, nous prélever des cellules de culture de tissus pour créer une suspension de cellules utilisée pour implanter directement dans le cerveau. La durée de la chirurgie est d'environ 30 minutes, et que la souris doit être dans un plan constant chirurgicale, un anesthésique injectable est utilisé. La souris est placée dans un gabarit stéréotaxique par Stoetling (figure 1). À l'arrièreer la zone chirurgicale est nettoyé et préparé, une incision est faite, et la bregma est situé pour déterminer l'emplacement de la craniotomie. L'emplacement de la craniotomie est de 2 mm vers la droite et 1 mm rostrale au bregma. La profondeur est de 3 mm de la surface du crâne, et les cellules sont injectés à un débit de 2 pi toutes les 2 minutes. La peau est suturée avec 5-0 PDS, et la souris est autorisée à se réveiller sur un coussin chauffant. D'après notre expérience, en fonction de la lignée cellulaire, le traitement peut avoir lieu à partir de 7-10 jours après la chirurgie. De délivrance de médicament est dépendante de la composition de médicament. Pour des traitements de radiothérapie les souris sont anesthésiées, et mis dans un gabarit fait sur mesure. Le plomb couvre le corps de la souris et expose que le cerveau de la souris. L'étude de la tumorigenèse et l'évaluation de nouvelles thérapies pour GBM besoin précis et reproductibles modèles de tumeur de cerveau des animaux. Ainsi, nous utilisons ce modèle orthotopique du cerveau pour étudier l'interaction du microenvironnement du cerveau et de la tumeur, afin de tester l'EFFICACITÉcessus de différents agents thérapeutiques avec et sans rayonnement.

Protocol

Préparation des cellules I.

1. Les cellules sont cultivées jusqu'à confluence dans du DMEM avec 10% FBS environ un 80% de confluence 225 cm ³ ballon pendant toutes les 5 souris pour être implantés.
2. Aspirer les médias hors des cellules, laver avec 10 ml de PBS sans calcium ni magnésium. Aspirer PBS cellules off.
3. Trypsiniser cellules avec 3 ml de trypsine, attendez 10-15 minutes, et de neutraliser la trypsine avec 15 ml de milieu.
4. Pipeter toutes les cellules et les médias dans une forme conique de 50 ml. Deux grands flacons entrer dans une forme conique de 50 ml.
5. Spin cellules à 1600 rpm pendant 7 min à 4 ° C. Aspirer complètement le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS froid, et rincez délicatement les cellules par aspiration et refoulement. Assurez-vous que le culot cellulaire est mélangé uniformément avec le PBS. La suspension doit être couvert.
6. A cette époque une numération cellulaire est effectuée à l'aide d'un compteur Coulter. Les cellules sont centrifugées à nouveau à 1600 rpm pendant 7 min à 4 ° C.
7. Après la centrifugation 2 ^ème des cellules, en tantpirate tout PBS et remettre en suspension dans 1 ml de PBS.
8. Les cellules sont filées dans la 1ml de PBS à 3000 rpm pendant 10 min à 4 ° C. Le PBS est aspiré, et le PBS est ajouté pour ajuster la concentration finale à 1x10 ⁶ pour 5 microlitres U87 cellules, d'autres lignées cellulaires peuvent nécessiter un nombre différent de cellules et la concentration de la croissance tumorale optimale.
9. Après le volume final et la concentration est obtenue, les cellules sont conservés dans la glace dans un tube Eppendorf.

II. Xénogreffes

1. Préparation de la souris
   1. Les souris sont anesthésiées en utilisant un mélange d'injection de kétamine / xylazine / Saline. Le mélange est de 120 mg / kg de kétamine, 16 mg / kg de Rompun et Saline. Les souris sont pesées individuellement et donné 0,1 ml par 10 g en fonction de leur poids. L'anesthésie est donnée avec une aiguille 26G attaché à 1 ml seringue IP. Il faudra environ 15 minutes pour les souris à atteindre une phase de sommeil sans réponse à la douleur. Vous pouvez vérifier la réponse à la douleur de l'souris en pinçant leur coussinet plantaire.
   2. Après la souris est entièrement anesthésié, pommade ophtalmique est administré à leurs yeux pour les empêcher de se dessécher.
   3. La souris est placée sur le lit de la stéréotaxique avec les dents supérieures de l'encoche sur la barre bouche. Le lit est ensuite placé dans l'stéréotaxique.
   4. Le garde nez est placé sur le nez de la souris pour empêcher un mouvement de la tête, et les barres d'oreilles sont doucement placer dans les conduits auditifs de la souris. Soyez prudent de ne pas faire de placement, soit de la barre de nez ou barres d'oreilles trop serrés, que le crâne peut se fissurer et / ou empêcher la souris de la respiration.
   5. Assurez-vous que la tête de la souris est de niveau en utilisant les graduations sur le stéréotaxique est utile au cours de ce processus.
   6. Pour de préparation de l'iode de la souris, l'alcool et providine est appliqué généreusement sur la tête de la souris en alternance, pour un total de 3 demandes, les demandes d'alcool et 3 de l'iode. Une application finale d'un tampon imbibé d'alcool à 70% est appliqué àla tête.
2. La procédure chirurgicale
   1. Tous les instruments de la procédure doivent être stérilisés soit par autoclavage ou tremper les instruments dans l'éthanol à 70% avant de commencer la procédure.
   2. Une incision est faite sur le dessus du crâne derrière l'œil droit en diagonale sur la partie postérieure gauche du crâne. L'incision doit être d'environ 10 mm à 15 mm de long.
   3. L'utilisation d'un Q-tip, lentement séparer l'incision pour exposer le crâne et essuyer la membrane qui est entre le crâne et la peau. Utilisez un coton-tige pour effacer toute trace de sang et de regarder pour un saignement excessif.
   4. Exposer le sommet du crâne pour visualiser le bregma. En utilisant le point de seringue Hamilton, positionnez-la sur le bregma. La position correcte du trou à percer dans le crâne est de 2 mm à droite et 1 mm antérieure de bregma (figure 2). Mèche feutre de chirurgien marqueur, qui est achetée stérile, est utilisé pour marquer l'emplacement du trou à percer. S'il vous plaît noter que le trou est situé à proximité de l'uneligne de suture Intérieur.
   5. Ensuite, percez un petit trou dans le crâne à la position marquée en utilisant la pointe d'une aiguille 22G dans un vase broches ou alimenté par une aiguille 18G.
   6. Chargez le 10 ul de verre Hamilton seringue avec 5 pi de cellules. La seringue Hamilton est de 10 pi avec un bout arrondi pour 30G 33G aiguille fixe qui s'y rattachent. Assurez-vous de mélanger les cellules avant de les charger, soit en les pipette ou en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 25G attaché. Après la seringue Hamilton est chargé, le replacer dans le bras pour l'aligner avec le trou dans le crâne.
   7. Abaisser l'extrémité de l'aiguille carie à la surface du crâne, une fois l'aiguille est à niveau avec le crâne; abaisser l'aiguille jusqu'à ce qu'il soit à la profondeur de 3 mm au-dessous de la surface du crâne.
   8. Après l'aiguille est abaissée, elle doit y rester pendant 2 minutes pour éviter tout traumatisme majeur de l'aiguille qui touche le cerveau. L'implantation des cellules est à un taux de 1 pl par minute pour un total de 6-8 minutes, faire attention à toute backflow. Après la dernière des cellules ont été implantées, laisser l'aiguille en place pendant encore 2 minutes, pour permettre à toutes les cellules de régler po
   9. Retirez l'aiguille du cerveau, et nettoyer le trou avec un Q-tip. Procéder au nettoyage de l'aiguille et une seringue à 50% Actone, EtOH 100%, et le PBS, 3x dans chaque solution et dans cet ordre.
   10. La peau sur le crâne est prêt à être suturée à ce point. Utilisation de 5-0 PBS refermer l'incision avec environ 3 points de suture.
   11. Laissez la souris de se réveiller sur un coussin chauffant, et réappliquer la pommade oculaire en cas de besoin. La souris peut être retourné à la cage après montre le mouvement de sa propre initiative (c.-à-levage jusqu'à la tête ou déplacer les épaules).

III. Traitement de l'implant IC par rayonnement et des drogues

1. La radiothérapie
   1. Selon la lignée cellulaire, le traitement des souris peut avoir lieu 5 à 7 jours post-implantation. Notre département utilise une unité de radiothérapie pour traiter orthovoltage rayonnementment.
   2. D'imagerie comme BLI (imagerie par bioluminescence), l'IRM ou la TDM peuvent être utilisés pour visualiser la tumeur avant la randomisation (figure 3A).
   3. Les souris sont anesthésiées avec le cocktail kétamine / xylazine / solution saline comme avant, et une pommade ophtalmique est appliqué à leurs yeux.
   4. Les souris sont placées dans un gabarit de rayonnement fait sur mesure qui est configuré comme une roue à tarte, dans laquelle les chefs des souris pointer vers le centre. Les corps des souris sont protégées contre le rayonnement par le plomb.
   5. Le traitement médicamenteux ne peut être donnée soit avant, soit un rayonnement à travers les itinéraires de livraison différents, à savoir la SQ, IP et IV.

IV. Résultats

La souris doit se réveiller de la procédure au sein de 45-60 minutes après l'injection d'anesthésie. Si la souris a difficilement se réveiller après la procédure et le temps a dépassé 1 ½ h après l'intervention, la souris peut ne pas récupérer et l'euthanasie peut être une alternative efficace. Si eoici un saignement excessif ou le crâne devient fissurée à n'importe quel moment au cours de la procédure de l'euthanasie est conseillé. Si tout va bien et en fonction de la lignée cellulaire, une tumeur doit commencer à se former dans les 2-4 semaines après l'intervention a lieu. Lors de l'utilisation des modèles de xénogreffes intracrâniennes, l'efficacité thérapeutique est habituellement mesurée par la survie post-implantation ^5. Toutefois, puisqu'il s'agit d'un des signes et symptômes de modèle IC aura lieu avant le décès. Certains des signes physiques de la souris peuvent présenter sont une posture voûtée, la perte de poids corporel, et l'inactivité. Certains des signes neurologiques peuvent être saisies, tête inclinée, et la perte d'équilibre. La figure 3B montre une tache de SE d'une tumeur sur la mortalité. Une courbe de Kaplan-Meier est utilisé pour évaluer les données (figure 4). Le nombre de jours de survie à 50% sont calculés et comparés à la commande. Si le groupe combinaison vécu plus longtemps que l'addition du rayonnement individuel et les bras de médicaments, la combinaison est était réussie.

Figure 1. L'équipement Stoelting stéréotaxique.

Figure 2. Un diagramme de l'emplacement du trou de forage dans le crâne de la souris.

La figure 3A. BLI imagerie après l'implantation GBM.

La figure 3B. H et E de la tumeur GBM à la mortalité.

Figure 4. Résultats des implants IC U87 injectés avec l'inhibiteur PARP 7 après la chirurgie jours.

Discussion

Les gliomes malins, tels que le glioblastome multiforme, représentent les tumeurs les plus fréquentes du cerveau primaire et ont un pronostic sombre ^4. La survie des patients touchés par GBM est resté pratiquement inchangé au cours de la dernière décennie (c.-à-9-12 mois après le diagnostic), malgré les progrès de la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie ^5. Les caractéristiques d'un modèle approprié pour l'étude du traitement gliome devrait inclure une localisation de la tumeur reproductible et la croissance des cellules d'une tumeur relativement discret, les cellules doivent se rapprocher autant que possible les caractéristiques histologiques de gliomes humains; il devrait y avoir une croissance prévisible taux de la tumeur, la capacité de croître la tumeur en culture de tissu et le modèle devrait être dans un petit animal pour réduire la charge ^6. Des traitements efficaces dépendent des modèles expérimentaux qui ressemblent étroitement à des caractéristiques de l'homme GBM pour tester un nouveau traitement et de fournir une compréhension exacte de la base moléculaire de widespread gliome invasion ^7. Les enquêtes sur la biologie des tumeurs du cerveau ont systématiquement utilisé des lignées de cellules cultivées ou maintenues in vitro pour obtenir des informations ^8. L'inhibition de l'invasion tumorale et l'angiogénèse est un objectif majeur dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les gliomes malins ^9. Les options sont limitées pour le glioblastome traitements ont entraîné une recherche intensive dans les lésions génétiques qui sous-tendent ce cancer mortel, dans le but le développement de thérapies plus rationnelles et plus efficaces ^10.