Summary
توضح هذه المقالة أسلوب nanoprecipitation لتجميع جزيئات البوليمر المستندة إلى استخدام diblock شارك في البوليمرات. وسوف نناقش توليف diblock شارك في البوليمرات ، وتقنية nanoprecipitation والتطبيقات المحتملة.
Abstract
تكنولوجيا النانو هي فرع جديد نسبيا من العلم الذي ينطوي على تسخير الخصائص الفريدة من الجزيئات التي هي مقياس نانومتر في (النانوية). ويمكن هندستها النانوية بطريقة دقيقة حيث يمكن حجمها وتكوينها والكيمياء سطح مراقبتها بعناية. وهذا يتيح حرية غير مسبوقة لتعديل بعض الخصائص الأساسية لبضائعهم ، مثل الذوبان الانتشارية biodistribution الخصائص ، والإفراج ، والمناعية. منذ نشأتها ، وقد استخدمت النانوية في العديد من مجالات العلم والطب ، بما في ذلك تسليم المخدرات ، والتصوير ، وبيولوجيا الخلية 1-4. ومع ذلك ، فإنه لم يتم الاستفادة منها بالكامل خارج "مختبرات تكنولوجيا النانو" بسبب الحاجز التقني المتصورة. في هذه المقالة ، نحن تصف طريقة بسيطة لتجميع جزيئات النانو بوليمر منصة تستند إلى مجموعة واسعة من التطبيقات المحتملة.
الخطوة الأولى هي توليف diblock شارك البوليمر الذي على حد سواء مجال مسعور وماء المجال. وباستخدام PLGA PEG كما البوليمرات النموذج ، وصفت لنا رد فعل الاقتران به EDC / NHS الكيمياء 5 (الشكل رقم 1). نناقش أيضا عملية تنقية البوليمر. يمكن توليفها diblock المشارك في البوليمر النانوية الذاتي التجمع في العملية من خلال nanoprecipitation مسعور ، ماء التفاعلات.
جسيمات متناهية الصغر البوليمر وصف متعددة جدا. ويمكن الاستفادة من مسعور الأساسية للجسيمات متناهية الصغر لنقل المخدرات ضعيفة الذوبان لتسليم المخدرات experiments6. وعلاوة على ذلك ، يمكن للجزيئات التغلب على المشكلة من المذيبات السامة للذوبان سيئة الكواشف البيولوجيا الجزيئية ، مثل wortmannin ، الأمر الذي يتطلب من المذيبات مثل DMSO. ومع ذلك ، يمكن DMSO تكون سامة لخلايا وتتداخل مع التجربة. يمكن أن تكون هذه الأدوية والكواشف ضعيفة الذوبان تسليمها على نحو فعال باستخدام جزيئات البوليمر مع الحد الأدنى من السمية. ويمكن أيضا أن تكون جزيئات البوليمر محملة صبغة الفلورسنت وتستخدم للدراسات الاتجار داخل الخلايا. أخيرا ، يمكن لهذه الجسيمات النانوية البوليمر يكون مترافق لاستهداف يغاندس من خلال الربط السطح. ويمكن استخدام هذه الجسيمات النانوية المستهدفة لتسمية الحواتم محددة أو في الخلايا 70-10.
Protocol
1. توليف PLGA - B - PEG البوليمر
- بولي (D ، L - lactide - CO - glycolide) (PLGA) مع مجموعات الكاربوكسيلات الطرفي (PLGA - الكاربوكسيلات) يذوب في أي مذيب للPLGA (كما هو مذكور في القسم المواد) في تركيز 5mM. ويمكن حل PLGA في هذا التركيز مع التحريك لطيف.
- وحلت كل من NHS (الوزن الجزيئي 115.09) وEDC (الوزن الجزيئي 191.7) في حل PLGA بتركيز 25mM. (تضاف كل EDC وNHS في الزائدة متكافئة من 5 مرات مقابل PLGA). يتم تحويل PLGA - الكاربوكسيلات في PLGA - NHS بإضافة EDC وNHS لPLGA - الكاربوكسيلات حل لطيف مع التحريك لمدة 1 ساعة.
- وعجلت في ناتج التفاعل PLGA - NHS بها مضيفا ان الحل الميثانول الغسيل. يتم إضافة ما يقرب من 10 أضعاف حجم الفائض من الميثانول إلى الحل. الحل هو طرد في 2000 XG لتترسب في PLGA - NHS وتجاهل طاف (يزيل آثار EDC وNHS. ويتكرر هذا الإجراء من الميثانول مع الغسيل ثلاث مرات على الأقل.
- يجفف بيليه PLGA - NHS في ظل فراغ لمدة 30 دقيقة لإزالة أي أثر للحل الغسيل.
- هو الآن بيليه PLGA - NHS إعادة المذاب في المذيب نفسه في نفس التركيز الذي كان يستخدم في البداية بحل PLGA. ثم يضاف إلى PEG heterobifunctional (أمين - PEG - الكاربوكسيلات) إلى حل PLGA بتركيز 5mM (نسبة متكافئة من 1:1). وحضنت الحل الخليط لمدة 24 ساعة مع التحريك المستمر.
- بعد 24 ساعة ، وعجلت في ناتج التفاعل PLGA - B - PEG كتلة كوبوليمر بها مضيفا ان الحل الميثانول الغسيل في الزائدة. تكرار عملية الغسل والطرد المركزي على النحو المذكور أعلاه ثلاث مرات. سيؤدي هذا إلى إزالة كافة PEG الزائدة غير المتفاعل.
- يجفف كوبوليمر كتلة PLGA - B - PEG تحت فراغ.
2. PLGA - B - PEG إعداد جسيمات متناهية الصغر
يمكن إعداد النانوية مع جوهر PLGA مغطاة PEG على السطح مع هذه الاسهامية diblock. ويمكن تغليف مجموعة متنوعة من الأدوية المختلفة في مسعور النانوية من هذا القبيل. يمكن أن تكون مغلفة في المركبات الفلورية النانوية أو يمكن أن مترافق PLGA ، وبالتالي يمكن استخدام هذه الجسيمات النانوية للتصوير مضان.
ويستخدم أسلوب Nanoprecipitation لجعل النانوية وخصوصا عندما البضائع المراد مغلفة هو مسعور جدا في الطبيعة.
- وحلت PLGA - B - PEG كتلة كوبوليمر والمخدرات / شحن (لتكون مغلفة) في أي مذيب الذي يذوب PLGA. يمكن حلها بواسطة المذيبات PLGA مشتركة كثيرة ، بما في ذلك أسيتونتريل ، DCM ، رباعي هيدرو الفوران ، والأسيتون أو خلات الإيثيل. اختيار المذيب أمر بالغ الأهمية ، لأنها تؤثر على خصائص جسيمات متناهية الصغر. وبالتالي ، يجب استخدام المذيبات المناسبة في هذه الخطوة.
- ثم يضاف الخليط البوليمر / المخدرات قطرة قطرة إلى كميات من الماء 3-5 التحريك إعطاء تركيز البوليمر النهائي من حوالي 3 ملغ / مل. (الشكل 2)
- واصل التحريك لمدة 2 ساعة تحت ضغط منخفض للسماح للجزيئات لتشكيل الجمعية التي المصير وإزالة آثار مذيب عضوي.
- وتتركز ثم بواسطة الطرد المركزي في النانوية ز س 2700 لمدة 10 دقيقة باستخدام عامل تصفية Amicon (MWCO 20KDa) ، وغسلها ، وأعيد تشكيلها في برنامج تلفزيوني : الحصاد والتنقية. هذا يزيل جميع البضائع من الامم المتحدة وشرك المخدرات /. لا يمكن أن يؤديها الأوصاف البيوفيزيائية الأساسية ، مثل الحجم ، وتهمة السطحية ، والمخدرات كفاءة التحميل لفهم أفضل للخصائص النانوية.
3. تخزين
تجميد التجفيف هو طريقة تستخدم عادة لتخزين 11 النانوية. سوف تجفيد الحفاظ على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للجزيئات للاستقرار على المدى الطويل 12. تجميد عملية التجفيف يمكن أن يسبب الضغط على الجزيئات وزعزعة الاستقرار في صياغتها ، بحيث تستخدم عادة وقاية من البرد (الوقاية من الإجهاد التجميد) وليو - وقاية (الوقاية من الإجهاد التجفيف). يتم تحديد اختيار هذه وقاية من طول الوقت المطلوب لتخزين 13.
- في تجفيف للتجمد ، هناك تصلب مجموع العينة التجمد تيراغرام والخمسين.
- في خطوة والتجفيف ، وإزالة الجليد عن طريق التسامي. وينبغي أن يكون الأمثل في درجة الحرارة والضغط لتحقيق كفاءة تجميد عملية التجفيف.
4. ممثل النتائج :
توصيف دي كوبوليمر كتلة PLGA - B - PEG
ويمكن استخدام تقنيات مختلفة لتأكيد نجاح الاقتران من البوليمرات. ويمكن وصف تشكيل PLGA - B - PEG باستخدام 400 ميغاهيرتز 1H الرنين المغناطيسي النووي (NMR). يمكن التحقق من الوزن الجزيئي للمنتج شكلت (PLGA - B - PEG) من هلام اللوني تخلل (المؤتمر الشعبي العام). وPLGA - B -- PEG الوزن الجزيئي distributioيجب ن منحنى والوقت شطف يكون مختلفا عن PLGA وحده PEG. في الجمع ، وينبغي أن تميز هذه التقنيات في شكل المنتج وتحديد ما إذا كان رد فعل اقتران كان ناجحا.
توصيف PLGA - B - PEG النانوية
ويمكن قياس حجم الجسيمات وحجم التوزيع التي تشتت الضوء الحيوي. معلمات مختلفة في عملية nanoprecipitation تؤثر على حجم الجسيمات. الأوزان الجزيئية للبوليمرات المستخدمة في البداية (على حد سواء وPLGA PEG) تأثير أيضا على توزيع حجم الجسيمات. ويمكن أيضا انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) يمكن استخدامها لتأكيد توزيع حجم وهيكل النانوية كما رأينا في الشكل 3. مجموعة حجم الجسيمات عموما في نطاق نانومتر. يمكن أن أحجام الجسيمات الكبيرة مع حجم التوزيع غير المتكافئ تشير إما خطأ في تصريف فعل أو التحسين nanoprecipitation احتياجات الأسلوب. بالإضافة ، يمكن قياس سطح زيتا المحتملة ZetaPALS.
ويمكن قياس كفاءة التحميل المخدرات / شحن مع HPLC القياسية.
يمكن أن تذوب الجزيئات في المذيبات العضوية وهبلك أن يؤديها لقياس امتصاص الدواء / شحن (الشكل 4). ويمكن أن يتم دراسة الافراج عن المخدرات حيث الحركية المعروفة مدال كميات ثابتة من الشرائح النانوية في 30 - A - Lyzer وحدات غسيل الكلى MINI. في فترات زمنية محددة ، يتم جمع المحتوى في وحدة غسيل الكلى ويتم إضافة حجم مساو من المذيبات العضوية إلى حل النانوية. يتم HPLC على هذه العينات لتحديد محتوى المخدرات / البضائع.
الشكل 1. EDC / الكيمياء NHS
الشكل 2. طريقة لإعداد Nanoprecipitation النانوية البوليمرية. يضاف الحل من مذيب عضوي (أسيتونتريل أو DCM) يحتوي على الربط بين diblock PLGA والمخدرات ، أو أن تكون البضائع المحملة في الجسيمات قطرة قطرة ل3-5 مل من H 2 O. التحريك
الشكل 3. انتقال المجهر الإلكتروني من nanopartices. TEM صورة من الربط بين PLGA النانوية التي تحتوي على wortamin. وقد استخدم حمض الفسفوتنغستيك كعامل التباين.
الشكل 4. الافراج عن رقابة من المخدرات من جسيمات متناهية الصغر. باكليتاكسيل من الإفراج عن النانوية بعد الغسيل الكلوي في برنامج تلفزيوني. في ذلك الوقت لاحظت ، وإزالة الجزيئات من الأشرطة وغسيل الكلى في solublized أسيتونتريل. وقد تم قياس الحل بواسطة HPLC. وتمت مقارنة قطعتين منفصلتين من النانوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأسلوب nanoprecipitation باستخدام البوليمرات diblock المشترك يمثل بسيطة ، طريقة سريعة لمهندس النانوية البوليمرية. وتتكون النانوية الناتجة من مسعور الأساسية التي يمكن استخدامها لإيصال مركبات ضعيفة الذوبان. الطبقة السطحية للماء تمكن الذوبان المائي ممتازة مع توفير شاردة لمزيد من التصريف محتملة ليجند الاستهداف.
هناك العديد من المنصات جسيمات متناهية الصغر ، بما في ذلك الليبوزومات ، النانوية البوليمرية ، dendrimers ، والجسيمات المعدنية ونقاط الكم 14. من بين هذه المنصات ، ومنصة جسيمات متناهية الصغر البوليمرية هي واحدة من أسهل لصياغة وأكثر تنوعا من حيث التطبيقات. فهي تتطلب الحد الأدنى من الإعداد والمعدات ويمكن تعلم هذه الطريقة في عدة ساعات. كما أن لديها مجموعة واسعة من التطبيقات وتوافق مع الحياة في كل من تمكن في المختبر والمجراة في التطبيقات. قدرته على تحمل شحنة يسمح التصوير وقدرات علاجية.
ويرد EDC / NHS الكيمياء هنا لتوليد كوبوليمر diblock. ومع ذلك ، يمكن توليفها بوليمرات كتلة باستخدام المواد الحفازة المختلفة. آخر حافزا شيوعا هو octoate قصديري. وتستخدم مجموعات الهيدروكسيل من محطة الربط والشروع في مجموعات لتجميع بوليمرات كتلة. يمكن البلمرة حلقة lactide glycolide والتي بدأها أو ثنائي هيدروكسي PEG PEG monomethoxy يؤدي إلى ABA أو بوليمرات كتلة نوع AB 15 على التوالي. هذا الأسلوب من إعداد يعطي مزيدا من المرونة في التصميم ، ولكن الكيمياء EDC / NHS أسهل في الاستخدام ، ويمكن توفير الوقت عن طريق استخدام المتاحة تجاريا PLGA البوليمر.
بالإضافة إلى nanoprecipitation ، وأساليب أخرى لتوليد يمكن استخدامها diblock النانوية البوليمر. وثمة بديل شيوعا هو "النفط في المياه" طريقة مستحلب 16. الأسلوب مستحلب يبدأ من جديد مع مرحلة العضوية التي تحتوي على كوبوليمر diblock ومرحلة مائي. ومع ذلك ، بناء على المزج بين الحلين ، تتولد من خلال vortexing النانوية وsonicating. هذه الطريقة هي مشابهة جدا ، ولكن الأسلوب nanoprecipitaion يسمح مزيد من التحكم في الخطوة خلط كذلك يتجنب استخدام صوتنة.
هناك العديد من التطبيقات المحتملة لهذا النظام الأساسي. أولا ، يمكن استغلاله لإيصال المخدرات / مسعور ضعيفة الذوبان في الدراسات تسليم المخدرات. على سبيل المثال ، taxanes قابلة للذوبان سيئة وتتطلب مذيب للفي الدراسات المجراة. يمكن تغليف الأدوية النانوية البوليمرية التاكسين وتلغي الحاجة إلى المذيبات. النانوية يمكن أيضا تقديم الكواشف بيولوجيا الخلايا التي هي ضعيفة الذوبان ، مثل wortmannin. ويمكن أيضا أن تكون جزيئات البوليمر محملة صبغة الفلورسنت وتستخدم للدراسات الاتجار داخل الخلايا. يمكن أن تكون هذه الجسيمات النانوية البوليمر مترافق لاستهداف يغاندس من خلال الربط السطح. جنبا إلى جنب مع وضع العلامات الفلورية ، ويمكن استخدام هذه الجسيمات النانوية المستهدفة لتسمية الحواتم محددة أو في الخلايا. لأن كل جسيمات متناهية الصغر يمكن تغليف عدد كبير من الجزيئات نيون ، لا يمكن للجزيئات تحسين حساسية مثل هذه الدراسات البيولوجية. ويمكن أيضا الفلورسنت النانوية المسمى ستستخدم لفي الجسم الحي والتصوير ، مثل التصور الأوعية الدموية وتصلب الشرايين لويحات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من جانب لاعبي الغولف لمكافحة السرطان ، ولاية كارولينا مركز تقنية النانو للتميز منح التجريبية ، جامعة السرطان الصندوق الوطني للبحوث ومعهد الصحة K - 12 جائزة التطوير المهني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDC | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | Conjugation Reagent |
| NHS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | Conjugation Reagent |
| amine-PEG-carboxylate | Laysan Bio Inc. | Nh2-PEG-CM-5000 | Polymer (Can use any PEG MW, 5000 is listed here) |
| PLGA-carbxylate |  Lactel |
B6013-2 | Polymer |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 34856 | Solvent |
| Acetonitrile >99% purity | Sigma-Aldrich | 34851 | Solvent |
| Methanol >99% purity | Sigma-Aldrich | 34860 | Wash |
References
- Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Goëpferich, A. Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).
- Bulte, J. W. M. Nanoparticles in Biomedical Imaging. 3, (2008).
- Omid, C., Farokhzad, R. L. Impact of Nanotechnology on Drug Delivery. ACS NANO. 3, 16-20 (2009).
- Li, Y. -P., Pei, Y. -Y., Xian-Ying, Z., Zhou-Hui, G., Zhao-Hui, Z., Wei-Fang, Y., Jian-Jun, Z., Jian-Hua, Z., Xiu-Jian, G. PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats. Journal of Controlled Release. 71, 203-211 (2011).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques. , 2nd Edition, (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Lee, D. S., Kim, S. W. Biodegradable block copolymers as injectable drug-delivery systems. Nature. 388, 860-862 (1997).
- Yoo, H. S., Park, T. G. Folate receptor targeted biodegradable polymeric doxorubicin micelles. Journal of Controlled Release. 96, 273-283 (2004).
- Cheng, J., Teply, B. A., Sherifi, I., Sung, J., Luther, G., Gu, F. X., Levy-Nissenbaum, E., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Formulation of Functionalized PLGA-PEG Nanoparticles for In Vivo Targeted Drug Delivery. Biomaterials. 28, 869-876 (2007).
- Gu, F., Zhang, L. F., Teply, B. A., Mann, N., Wang, A., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Precise engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers. Proceedings of the National Academy of Science. 105, 2586-2591 (2008).
- Sanna, V., Pintus, G., Roggio, A. M., Punzoni, A., Posadino, A. M., Arca, A., Marceddu, S., Bandiera, P., Uzzau, S., Sechi, M. Targeted Biocompatible Nanoparticles for the Delivery of (-)-Epigallocatechin 3-Gallate to Prostate Cancer Cells. J. Med. Chem. 54, 1321-1332 (2011).
- Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58, 1688-1713 (2006).
- Holzer, M., Vogel, V., Mäntele, W., Schwartz, D., Haase, W., Langer, K. Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying and storage. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 428-437 (2009).
- Lee, M. K., Kim, M. Y., Kim, S., Lee, J. Cryoprotectants for Freeze Drying of Drug Nano-Suspensions: Effect of Freezing Rate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, 4808-4817 (2009).
- Wang, A. Z. Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications. Expert opinion on biological therapy. 8, 1063-1070 (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Kim, S. W. Drug release from biodegradable injectable thermosensitive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers. J. Control Release. 63, 155-163 (2000).
- Gref, R. Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres. Science. 263, 1600-1603 (1994).
