Summary
نقدم هذا النهج لتقييم كا عصاري خلوي
Abstract
الأوعية اللمفاوية تشمل نظام نقل متعدد الوظائف التي تحافظ على توازن السوائل والدهون يسلم إلى الدورة الدموية المركزية ، ويعمل بمثابة نظام للمراقبة لمستضدات يمكن أن تكون ضارة ، وتحسين مناعة الغشاء المخاطي والاستجابات المناعية التكيفية 1. يتكون من السائل الخلالي الليمفاوية الذي يدخل الأعمى العضوية مفاوية الأولية ، ومن ثم يتم نقلها ضد التدرج في جو من الضغط وجمع الأوعية اللمفاوية. يتم جمع كل اللمفاوي يتكون من سلسلة من شرائح تسمى lymphangions ، مفصولة ضاحكة الصمامات التي تمنع ارتجاعي. كل lymphangion تمتلك دورة مقلص الليمفاوية الذي يدفع مقابل الضغط التدرج نحو تعميم المركزية 2. هذا النمط طوري مقلص مشابه لدورة القلب ، والانقباضي والانبساطي مراحل ، ومع 4 الانكماش أدنى تردد بالإضافة إلى ذلك ، على نحو سلس العضلات اللمفاوية يولد نغمة ويعرض انقباض عضلي وتمدد طن ردا على الزيادة والنقصان في ضغط اللمعية ، على التوالي 5. ويقترح بالتالي مزيج من الآليات الجزيئية التي تدعم كلا من انقباض طورية ومنشط لمفاوية.
وينظم عموما تقلص العضلات الملساء التي كا 2 + تركيز عصاري خلوي ([كا 2 +] I) ، بالإضافة إلى الحساسية للكا 2 + ، من العناصر مقلص في استجابة للتغيرات في البيئة المحيطة الخلية 6. [كا 2 +] ط يتحدد من قبل مجموعة من حركة كا 2 + يجند من خلال غشاء البلازما أو الجهد بوابات الكالسيوم 2 + قنوات والإفراج وامتصاص الكالسيوم 2 + من مخازن الداخلية. عصاري خلوي كا 2 + بربط كالمودولين وينشط الإنزيمات مثل ضوء سلسلة الميوسين (حركة تحرير الكونغو) كيناز (MLCK) ، والذي بدوره يؤدي إلى حركة تحرير الكونغو phosphorylates الأكتين ، الميوسين بوساطة انكماش 8. ومع ذلك ، فإن حساسية هذا الممر الى كاليفورنيا
هنا ، نقدم طريقة لتقييم التغيرات في [كا 2 +] أنا مع مرور الوقت في الأوعية اللمفاوية ، معزولة perfused من أجل دراسة كا 2 + والتي تعتمد على الكالسيوم 2 + للتوعية آليات اللمفاوية تقلص العضلات الملساء. استخدام الفئران المعزولة مفاوية المساريقي جمع درسنا تمتد بفعل التغيرات في [كا 2 +] ط مقلص والنشاط. نموذج اللمفاوية معزولة يوفر ميزة أنه يمكن الضغط والتدفق ، والتركيب الكيميائي للحمام حل لرقابة مشددة. [كا 2 +] كنت مصممة عن طريق تحميل مفاوية مع ratiometric ، كا 2 + ملزم صبغ Fura - 2. وستوفر هذه الدراسات نهجا جديدا لمشكلة أوسع نطاقا لدراسة مختلف الآليات الجزيئية التي تنظم طوريمقابل انكماش انقباض العضلات في منشط اللمفاوي على نحو سلس.
Protocol
1. الحيوانات
- وقد وافق جميع الإجراءات المتبعة في رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في جامعة ولاية لويزيانا مركز العلوم الصحية ، وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية للمعهد الوطني للصحة (NIH المنشور رقم 85-12 ، المنقحة لعام 1996). وتم إيواء الذكور سبراغ - داولي الفئران (مختبرات نهر تشارلز ، 270-350 غ من وزن الجسم) في درجة حرارة مضبوطة (22 درجة مئوية) ، وإنارة للرقابة (00:12 دورة خفيفة مظلمة ح) البيئة. بعد وصوله ، وقدمت للفئران لفترة تأقلم مدتها أسبوع واحد ، وقدمت مستوى طعام الفئران (2018 Teklad العالمية القوارض 18 ٪ بروتين حمية ، هارلان) والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
2. إعداد التجربة
- مصنوعة من الزجاج لمفاوية micropipettes متزايدة من زجاج البورسليكات مع خيوط OD 1.2mm ، ID 0.69mm (سوتر الصك BF 120-69-15). سحب ماصات باستخدام يلهب / براون Micropipette بولير طراز P - 97 (سوتر Instrumالأنف والحنجرة) ، وشطبة مع طاحونة مايكرو EG 400 (Narishige) للحصول على معلومات سرية مشطوف مع قطره ~ 60 ميكرومتر الخارجي.
- تحميل micropipettes في غرفة معزولة سفينة (طراز CH - 1 ، ونظم المعيشة ، برلنغتون ، VT). ينبغي أن تكون مطابقة ماصات المقاومة (فتح نفس الحجم).
- تملأ الغرفة (5 مل) وmicropipettes بمحلول الملح الألبومين الفسيولوجية (هذه الخدمات ، انظر الجدول 1). تأكد من عدم وجود فقاعات في micropipettes أو أنابيب ل.
- تعد الذراع عقدة مع الغرز العينية ومكان واحد على كل micropipette.
3. جمع عزل اللمفاوي
- تخدير الحيوانات مع الحقن العضلي الكيتامين / زيلازين (90 و 9 ملغم / كغم ، على التوالي) ، وذلك باستخدام حقنة دينار بحريني (1 مل) ، وإبرة دينار بحريني (شطبة الأدمة 26G3 / 8).
- رش منطقة البطن مع الكحول 70 ٪ لتعقيم ، تنفيذ البطن خط الوسط ، وexteriorize واستئصال الأمعاء الدقيقة ومساريق. وضع الأنسجة في جيمه الباردة هذه الخدمات. الموت ببطء الحيوانات مع جرعة زائدة من الكيتامين / زيلازين وتأكيد الوفاة عن طريق فتح الصدر (كما في أمريكا الجمعية الطبية البيطرية المبادئ التوجيهية بشأن القتل الرحيم).
- دبوس مقطع من مساريق في غرفة التشريح مملوءة الجليد الباردة هذه الخدمات. تشريح بعناية سفينة اللمفاوية جمع (8-20 ميكرون قطرها الداخلي و 1-2 ملم طول) من المناطق المحيطة الدهنية والنسيج الضام مع المعونة من stereomicroscope. استخدام ملقط تشريح دومون INOX - 55 (أدوات العلوم الجميلة # 11255-20) ، ومقص تشريح الربيع (أدوات العلوم الجميلة # 15000-03). استخدام سفن معزولة مع صمام واحد فقط لضمان السيطرة على ضغط الأمثل في قطاع بأكمله خلال التجربة.
- نقل اللمفاوي إلى غرفة معزولة سفينة معزولة تحتوي على 5 مل من هذه الخدمات. تحميل السفينة على الزجاج وmicropipettes two المقاومة يقابله ربط الخيوط مع العيون.
- نقل إلى غرفة المجهر الفلورسنت المقلوب (زمننا هذا نيك على TE - 2000U) مجهزة مصباح زينون (سوتر آلات امدا LS2 300 W) ، 340/380 نظام عجلة تصفية (سوتر امدا 03/10 مع تقنية كروما 340 و 380 مرشحات الإثارة نانومتر) ، 510 نانومتر باعث مزدوج اللون (D510 التكنولوجيا كروما / 80M) ، وكاميرا CCD الحساسة (Photometrics HQ 2) ، والبرمجيات لشراء (نيكون عناصر AR) (الشكل 1).
- نعلق الأنبوب مصدرها micropipettes إما للتعديل أو الخزانات إلى نظام ضخ مضاعفات الملاحظات (المعيش نظم التهوية ، برلنغتون VT) ، وكلاهما والتي يمكن استخدامها لتعديل الضغط والتدفق.
- ربط الغرفة إلى وحدة التدفئة (نظم الاستقبال) وتعيين الحمام إلى 37 درجة مئوية.
- عرض اللمفاوية مباشرة من خلال ساترة في قاعدة للغرفة مع الهدف 10X (نيكون خطة 10x/0.3 فلور ، مدينة دبي للإنترنت L/N1 ، ∞ / 0.17 WD 16.0). يمكن الحصول على صورة سريعة مجموعات الوقت الفاصل باستخدام برنامج الحصول على الصور (نظامنا نيكون AR عناصر البرنامج).
"jove_title"> 4. Ratiometric قياس [كا 2 +] ط
- [كا 2 +] يقاس ط في العضلات اللمفاوية معزولة على نحو سلس من قبل كا 2 + من بعد صبغ Fura 2 - acetoxymethyl استر (AM) (المسابر الجزيئية ، يوجين ، OR).
- تحميل سفينة اللمفاوية مع Fura - 2 بواسطة تبادل للحمام لمحلول يحتوي على هذه الخدمات ، Fura 02:00 (2 ميكرون) وحامض pluronic (0.2 ٪ بالوزن / المجلد) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- بعد 30 دقيقة تغيير حمام مرة أخرى إلى حل هذه الخدمات. شطف 2 مرات لغسل خارج Fura - 2 من الحل الحمام. مغادرة السفينة لفترة لا تقل عن موازنة 20 دقيقة قبل [كا 2 +] ط قياسات للسماح بإعادة إنشاء تقلصات عفوية.
- جمع ratiometric Fura - 2 القياسات في مفاوية معزولة مع بروتوكول الاقتناء التي تضيء بدلا من 340 نانومتر في موجات و 380 لفترات من 50 مللي ثانية لكل منهما. ضوء الفلورسنت يمر عبر مرآة مزدوج اللون (400 نانومتر ؛ شروما تيويكتسب شروما شركة تكنولوجيا D510/80m) والكاميرا 2 Photometrics المقر ؛ chnology 400DCLP كورب) واسعة النطاق الانبعاثات تصفية (510 نانومتر و 80 نانومتر عرض الفرقة. نجمعها 2 دقيقة من البيانات في الأساس الضغط داخل اللمعة من 2 سم O 2 H وخلال الزيادات خطوة +2 ، +4 ، +6 ، +8 ، و +10 سم H 2 O.
- لتحليل متوسط [كا 2 +] ط ، رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) الذي يحتوي على السفينة بأكملها اللمفاوية والمنطقة المحيطة بها بحيث يتم تعقب السفينة بالكامل خلال الاسترخاء والانكماش (الشكل 2). وينبغي إذا إما micropipette في مجال عرض هذه المناطق لا يتم تضمينها في العائد على الاستثمار. ويمكن أيضا أن يتم اختيار أصغر رويس ، ولكن هناك مشكلة محتملة مع رويس الصغيرة هو أن جدران الأوعية قد تحرك قليلا في اتجاه طولي من العائد على الاستثمار مع السفينة يضيق ويرتاح. مشكلة محتملة أخرى هي أن بعض السفن تطور خلال الانكماش ، ويجب ألا يتم استخدام هذه الأوعية اللمفاوية للدراسة. الوعادة ما يتم تجنب حركات اللف ه من خلال الحد من طول اللمفاوية معزولة لمم 1 <. بالإضافة إلى ذلك ، أحيانا شرائح على جانبي صمام لا انقباض / الاسترخاء في التزامن. في هذه الحالة ، لأن هذه القطاعات تمثل lymphangions ظيفية منفصلة ، ينبغي درس اللمفاوي على جانب واحد فقط من الصمام ، أو يمكن دراسة كل على حدة مع lymphangion دوروا وضعت على جانبي. عند استخدام 10X الهدف ، يتعين على جدران الأوعية البقاء في التركيز خلال الانقباضات طورية ، ولكن إذا كان هناك أي أجزاء من الجدران التي تخرج من التركيز خلال الانقباضات لا ينبغي أن تدرج هذه المناطق في العائد على الاستثمار. ويستخدم أيضا ROI الخلفية ويجب أن توضع بعيدا عن السفينة (على سبيل المثال في زاوية الصورة). زيادة في نسبة 340/380 يشير إلى زيادة في [كا 2 +] ط. ويمكن أيضا قطرها اللمعية في نقاط زمنية مختلفة يمكن قياسها باستخدام وظيفة البرنامج على قياس أو عن طريق تتبع جدران الأوعية على مر الزمن (انظر القسم 6). </ لى>
5. بروتوكول التحكم في الضغط
- في دراسة مستقلة عن الضغوط المفروضة التدفق ، يجب أن تطبق نفس الضغط على كل micropipette بواسطة مضخة التغذية المرتدة مضاعفات فارغة. يتم إرفاق كل من أنابيب micropipette عبر موصل - T للأنابيب مشتركة شنت على المضخة. في البداية مجموعة ضغط داخل اللمعة في 2 سم O 2 H عن 45-60 دقيقة ، وهو ما يكفي من الوقت للسماح للتنمية تقلصات اللمفاوية عفوية.
- دراسة عن استخدام السفن الوحيدة التي تستوفي المعايير التالية خلال فترة موازنة : (1) تطور السفينة نغمة عفوية في 2 سم H 2 O ، (2) السفينة تطور العادية ، تقلصات عفوية أن تكون موحدة في جميع أنحاء معقول طول السفينة . في كثير من الأحيان من منطقة المصب صمام يضيق أكثر من بقية السفن ، وسوف تستخدم هذه السفن ما دامت هناك أدلة على أن ما تبقى من السفينة يعرض النشاط مقلص.
- سجل السريع الوقت الفاصل بين الصور أثناء الضغط الداخلي الخطوة. لكل منهما ، وسوف تبدأ في الضغط 2 سم H 2 O لمدة 30 ثانية ، ثم يتم رفع في خطوة +2 ، +4 ، +6 ، +8 ، أو الطول +10 H O 2 لدقيقة واحدة ، وخفضت مرة أخرى 2 سم إلى H 2 O لمدة 30 ثانية.
- بعد الانتهاء من سلسلة الضغوط الخطوة ، تغيير إلى حل حمام كا 2 + خالية من هذه الخدمات عند 37 درجة مئوية لقياس قطرها القصوى السلبية (ماكس D) والكالسيوم 2 + قياسات ومضان في كل من الضغوط اللمعية أعلاه. يستخدم مد ماكس لحساب لهجة وتطبيع البيانات بين مفاوية من مختلف الأحجام.
6. معلمات اللمفاوية مقلص
- ويمكن تحديد التغيرات في اوعية بمرور الوقت باستخدام أدوات تتبع الكائن في معظم حزم صورة برامج التحليل. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام واحد فقط من قنوات (نستخدم القناة 340 نانومتر ولكن يمكن أيضا استخدام القناة 380 يكون). وعلى النقيض من عتبة التطبيقكذب على كومة الصور بحيث يتم تسليط الضوء على جدران الأوعية ، ومن ثم يتم رسمها رويس يشمل كل جدار لتعقب عليها على مر الزمن (الشكل 3 أ). يمكن تحديد قطرها الداخلي عن طريق قياس النقطه الوسطى من كل جدار واحتساب المسافة بين centroids اثنين ، ناقص نصف سماكة كل جدار.
أما الخيار الثاني عندما يكون من الصعب تتبع كل جدار بسبب إشارة قوية في مجال اللمعية هو قياس القطر الخارجي ، واستخدام عامل التصحيح بناء على قياس ثابت من جدران الأوعية الداخلية للحصول على القطر. في هذه الحالة ، ROI يمتد السفينة بأكملها ويتم تعقب القطر الخارجي (الشكل 3 ب). ويمكن أيضا أن تستخدم هذا الأسلوب لتحديد منطقة للعرض عبر كامل قطاعات من اللمفية (الشكل 3 C). لأن الشكل النموذجي للlymphangion ، يمكن لهذا الخيار الأخير تقديم أفضل تقدير الحجم الفعلي للضخ السائل مع كل تقلص من استخدام الإطارات في الجزء المحددللسفينة. - من هذه الدراسة تحديد الوقت الفاصل بين المعلمات التالية من القياسات اللمفاوية قطرها اللمعية 4،12،13 :
تردد الانكماش (CF) ، التي تحددها حساب عدد من تقلصات طوري في الدقيقة الواحدة.
نهاية قطرها الانبساطي (EDD) ، وهو القطر قبيل انكماش طوري.
نهاية قطرها الانقباضي (ESD) ، وقطره عند نهاية الانكماش طوري.
السعة من الانكماش (AMP = EDD - ESD) ، وهو مؤشر مبسطة من حجم السكتة الدماغية.
القطر القصوى في كل الضغط السلبي (ماكس D ؛ تحديده في كا 2 + خالية من الشروط) ، والتي يمكن استخدامها لتحديد النغمة التي تولدها عضلات اللمفاوي على نحو سلس ، ويستخدم أيضا لتطبيع البيانات بين مفاوية قطرها مختلفة ، أو ودرس في نفس اللمفاوية اللمعية الضغوط المختلفة.
EDD 1 ، والذي هو EDD المرتبطة أول انكماش بعد خطوة الضغط. ويستخدم هذا كنقطة انطلاق عندتحديد انقباض عضلي سفينة اللمفاوية ردا على خطوة زيادة في ضغط اللمعية 5.
ويمثل انقباض عضلي لاللمفاوية معزولة بعد خطوة للضغط من جانب التغيير في تطبيع EDD بعد زيادة الضغط خطوة = 100 * (EDD -- EDD 1) / د ماكس.
المتغيرات الإضافية التي يمكن حسابها ولكن تمت مناقشتها بالتفصيل في مكان آخر 4 هي :
نغمة = 100 * (ماكس د -- EDD) / ماكس D ، AMP تطبيع = AMP / ماكس D
مؤشر حجم السكتة الدماغية (SVI) = π (EDD 2 -- البيئة والتنمية المستدامة 2)
الكسر طرد (EF) = SVI / (πEDD2)
مؤشر حجم التدفق (VFI) = CF X SVI.
7. ممثل النتائج :
في بداية كل تقلص طوري ، كانت هناك زيادة مؤقتة في [كا 2 +] ط (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، بعد الزيادات الخطوة في ضغط اللمعية ، وتواتر كا 2 + العابرين و pزيادة في تقلصات hasic التزامن. هذه الملاحظات هي مشابهة لإيجاد السابقة باستخدام القنوات الصدري شنت على myograph سلك 14 ودعم البيانات السابقة مما يدل على الدور المركزي للمتذبذبة كا 2 + اطلاق سراح من مخازن الداخلية الكامنة في آلية دورة طوري مقلص 15.
نحن أيضا التحقيق في ما إذا كان [كا 2 +] يرتبط ط أثناء انبساط (بين كا 2 + العابرين وتقلصات طورية) مع نغمة اللمفاوي وانقباض عضلي بسبب تمدد عندما تفرض زيادات في ضغط الخطوة (الشكل 5). مباشرة بعد الزيادات في خطوة ضغط +4 الطول H 2 O والعالي ، [كا 2 +] ط أثناء انبساط زيادة مطردة بالمقارنة مع خط الأساس قبل الخطوة الضغط (الشكل 5B). بالإضافة إلى ذلك ، بعد زيادة أولية في قطر بسبب الزيادات خطوة في الضغط (EDD 1) ، وكان هناك انقباض عضلي (الشكللدى عودتهم 5C) ، الذي يعرف بأنه انخفاض في EDD من EDD 1 5،12 في التقارير السابقة. عند مقارنة متوسط التغير في تطبيع EDD بين الخطوات الضغط المختلفة ، كان هناك مزيد من انقباض بشكل كبير بعد زيادات +8 و +10 سم H 2 O بالمقارنة مع الطول +2 H 2 O (الشكل 6 أ). ارتفاع مطرد في [كا 2 +] كان مرتبطا أيضا أن الضغط ، مع الزيادات خطوة +6 ، +8 ، و +10 سم H 2 O تسبب تغييرات في أعلى بكثير من الكالسيوم 2 + H 2 +2 الطول O ( الشكل 6 باء). ومع ذلك ، فإن الضغوط خطوة كا 2 + علاقة يبدو أن هذه الضغوط على الهضبة كذلك. هذه النتائج تشير إلى أن يرتبط الكالسيوم (أ) 2 + التي تعتمد على آلية مع انقباض عضلي اللمفاوي استجابة للامتداد. ومع ذلك ، فإن هضبة الجولان في خطوة ضغط كا 2 + العلاقة يشير إلى وجود آلية لزيادة الكالسيوم 2 + حساسية قد يسهم أيضا في زيادة constri عضليction في الخطوات الضغط العالي.
الشكل 1. تخطيطي لنظام الاداة المستخدمة لقياس [كا 2 +] ط اللمفاوية في عزلة. وضعت غرفة معزولة اللمفاوي على مسرح المجهر المقلوب. غير مضيئة في العينة بدلا من 340 و 380 نانومتر ، والتي يتم جمعها إشارة الفلورسنت المنبعثة من اللمفاوية مع كاميرا CCD وتخزينها في جهاز كمبيوتر شخصي. يتم التحكم في الضغط داخل اللمعة من اللمفاوية عن طريق نظام التغذية المرتدة مضاعفات فارغة. المستخدم مجموعات الضغط للنظام ، ومحولات الضغط في الخط مع اللمفاوية تتابع الضغط داخل اللمعة على نظام التغذية المرتدة ، والتي يمكن رفع أو خفض ضغط حيوي عن طريق المضخة.
الشكل 2 مثال لمنطقة سياحية (ريال عمانيI) لاختيار Fura - 2 الدراسات التصوير ratiometric في الأوعية اللمفاوية معزولة. المنطقة المحددة تشمل معظم السفينة (باستثناء المناطق لمس micropipettes) والمنطقة المحيطة بها لضمان وسيتم تتبع السفينة لدوام كامل. ويستخدم أيضا ROI الخلفية (أعلى الزاوية اليمنى) للقضاء على إشارة غير محدد من حمام المحيطة بها.
الشكل 3. الليمفاوي تتبع أساليب الضخ. ويمكن تحديد قطرها ألف الداخلية على مر الزمن باستخدام رويس التي تتبع حركة السفن من الجدران. B. عندما يتم تعيين عتبة خلافا لتشمل السفينة بأكملها ، يمكن تتبع القطر الخارجي مع دوروا واحد. ويمكن تقدير القطر الداخلي من هذه القياسات عن طريق تصحيح لسماكة الجدار. C. خيار آخر هو أن تتبع المنطقة التي تشملها السفينة ، والتي يمكن استخدامها لحساب حجم عن طريق تصحيح لسماكة الجدار وعلى افتراض اللمفاوية والهندسة أسطواني.
الشكل 4. العلاقة بين [كا 2 +] ط وقطر اللمفاوي. A. ممثل الصور من الفيديو من الوقت الفاصل بين Fura - 2 شدة الحرارة (شكل الخريطة) في اللمفاوية معزولة. الأسهم في كل صورة مخطط القطر الخارجي للسفينة. 1 صورة يظهر اللمفاوية أثناء انبساط ، مع منخفضة نسبيا [كا 2 +] ط. في الصورة 2 ، ويزيد من كثافة نسبة 340/380 في جدران السفينة ، قبل الانكماش الذي يحدث في طوري صور 3-5. حسب الصورة 4 ، انتهت كا 2 + عابرة ، وصورة 5 ، المرحلة الانقباضي قد انتهت والسفينة تعود إلى حالتها يستريح باء. قطعة من [كا 2 +] ط وقطر اللمعية اللمفاوي يظهر ان زيادة عابرة في [كا 2 +] ط يحدث فقط قبل كلطوري الانكماش.
الشكل 5. التغييرات في اللمفاوي [كا 2 +] ط ودورة اللمفاوية مقلص في الخطوة استجابة لزيادة في الضغط. وترد البروتوكولات الخطوة الضغط (A) ، وبيانات نسبة 340/380 ، وهو ما يمثل [كا 2 +] I (B) ، والتغيرات في القطر اللمفاوي على مر الزمن (C). وقد ألف خط الأساس الضغط اللمعية 2 سم H 2 O وتعرضت السفينة اللمفاوي إلى الخطوة زيادات +2 ، +4 ، +6 ، +8 ، و +10 سم H 2 O. وكان الفاصل الزمني بين كل الضغوط تسجيل الخطوة 1-2 دقيقة. تسبب كل خطوة زيادة الضغط في كل من تردد يزيد عابرة في [كا 2 +] I (B) وتقلصات طوري (C). كما زادت قطر اللمفاوية مع كل خطوة في زيادة الضغط اللمعية ، وبالنسبة لل4-10 سم H 2 الخطوات الضغط O ، كان هناك انخفاض في EDD الأولية التي وقعت AFثالثا EDD1 (C) ، كما هو موضح سابقا انقباض عضلي اللمفاوي. كان هناك أيضا زيادة مطردة في القاعدية [كا 2 +] ط بين العابرين على الفور بعد كل خطوة زيادة في الضغط (B). كان انقباض عضلي أكثر وضوحا مع الخطوات الكبيرة الضغط ، إلا أن الزيادة في [كا 2 +] القاعدية كنت تقريبا الشيء نفسه بالنسبة للالطول 4-10 H الضغط O 2 الخطوات (B). وكان ذكر سابقا زيادة تعويضية في AMP الواضح أيضا بعد خطوات ضغط 6-10 سم H 2 O (C).
الشكل 6. انقباض عضلي اللمفاوي والزيادة التدريجية في الخطوط [كا 2 +] ط انبساط خلال فترة وجيزة بعد الزيادات خطوة في الضغط. A. ويستخدم المتوسط بين 30-50 ق EDD بعد 1 EDD لحساب التغير في EDD تطبيع لكل خطوة الضغط. B. تم تقسيم شدة 340/380 ق 30-50 بعد نسبة 1 EDD من نسبة 340/380 المتوسط خلال خط الأساس (2 سم H 2 O). * P <0.05 مقابل الطول H 2 +2 خطوة ضغط الإخراج. N = 4 سفن دراستها.
فيلم 1. مثال من تقلصات في طوري سفينة اللمفاوية المعزولة المستخدمة في الدراسة. تم تعيين ضغط اللمعية في 2 سم O. 2 H يتم عرض الوقت المنقضي وبار النطاق في الجزء السفلي. وقد جمعت هذه الصور مع مرور الزمن هدف 10X باستخدام الضوء المنقولة. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
الفيلم 2. Ratiometric Fura - 2 في التصوير اللمفاوية منعزلة الضخ. ويبين مقياس الخريطة الحرارة في أعلى اليسار وتظهر في الوقت المنقضي وشريط في أسفل الجدول. كان من المقرر في البداية الضغط على 2 سم H 2 O ورفعت إلى 8 سم O 2 H ابتداء من الساعة 0،5 دقيقة وreturneد 2 سم إلى H 2 O عند 1.5 دقيقة. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كان يعمل الرواية مزيج من الأساليب لدراسة جوهرية ضخ الأوعية اللمفاوية. القدرة على قياس التغيرات في وقت واحد [كا 2 +] وأنا وقطر في مفاوية ضخ تسمح للدراسات للمساهمات النسبية للكا 2 + والتي تعتمد على الكالسيوم 2 + للتوعية مسارات إشارات في الآلية الشاملة تنظم دورة اللمفاوية مقلص.
دورة اللمفاوية مقلص يتكون من تقلصات طوري فرضه على لهجة. وتشير البيانات إلى أن يرتبط كل الانكماش طوري مع ارتفاع عابر في [كا 2 +] ط ، مما يدل على الدور المركزي للكا 2 + في آلية pacemaking ، وأنه تردد كا 2 + العابرين حساسة للتغيرات في ضغط اللمعية . البيانات المتوفرة لدينا تبين أيضا أن الزيادة السريعة في الضغط يمكن أن تثير ارتفاعا مطردا في القاعدية [كا 2 +] ط بين العابرين. وهذا قد يسهم في ارتفاعوانقباض عضلي التي لوحظت في جمع الزيادات الخطوة التالية مفاوية في ضغط اللمعية. ومع ذلك ، لاحظنا هضبة من الزيادات في هذه القاعدية [كا 2 +] ط بخطوات ضغط تتراوح 6-10 سم 2 O H ، الذي كان بدرجات متفاوتة من انقباض عضلي. هذه البيانات تشير إلى أن تشارك أيضا آلية أخرى ، وربما كا 2 + للتوعية الآلية ، في الاستجابة للضغوط عضلي.
مع افتراض واحد هذه الدراسات هو أن يرد غالبية + 2 قياس الكالسيوم في العضلات الملساء. ومع ذلك ، كا 2 + في الخلايا البطانية وأنواع الخلايا الأخرى التي قد تكون موجودة في مفاوية تسهم أيضا في العام احظ [كا 2 +] ط ، وبالتالي فإن القيم المقاسة وربما كان من المبالغة في العضلات الملساء [كا 2 +] i في الأوعية اللمفاوية. ولا يتوقع اي كا 2 + تقاس من البطانة إلى المساهمة مباشرةلتقلص العضلات على نحو سلس على أساس دراسات سابقة في الشرايين 16. وستعالج هذه المسألة في المستقبل في التجارب التي تعرت من بطانة الأوعية اللمفاوية.
عند استخدام الأصباغ ratiometric لتقييم [كا 2 +] ط في الخلايا أو الأنسجة ، وتنقل العينات يمكن أن يسبب التحف. لتقليل الآثار الحركة في التعاقد مفاوية ، ونحن استخدام عائد استثمار التي تضم أكبر قدر من السفينة وقت ممكن لتحديد نسب 340/380. علينا أيضا أن الدراسة الوحيدة التي تبقى السفن في التركيز خلال دورتهن مقلص. بسبب التحف المحتملة التي قد تنشأ عن حركة السفن ، بدلا من تحديد المطلق [كا 2 +] كنت في موقع معين ، نحصل على متوسط مساحة واسعة من السفينة. نحن نركز على التغيرات النسبية في المتوسط [كا 2 +] ط بمرور الوقت ، وكيف ترتبط هذه التغييرات إلى انكماش طورية ومنشط للأوعية الدموية.
في تتدهور ، ملخصrmination التغيرات في [كا 2 +] ط بواسطة التصوير ratiometric معزولة في جمع الأوعية اللمفاوية يمثل أداة قوية لكا ال 2 + التي تعتمد على فك والكالسيوم 2 + للتوعية الآليات الكامنة دورة اللمفاوية مقلص. مع هذا الأسلوب ، فإن الدراسات المستقبلية باستخدام منبهات أو مثبطات انتقائية لمختلف مسارات نقل الإشارة يساعد أيضا التفريق بين الآليات الجزيئية الكامنة وراء الانكماش فريدة طوري مقابل منشط اللمفاوية في العضلات الملساء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
References
- Chakraborty, S. Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, Suppl 1. 94-94 (2010).
- Zawieja, D. Lymphatic biology and the microcirculation: past, present and future. Microcirculation. 12, 141-141 (2005).
- Benoit, J. N., Zawieja, D. C., Goodman, A. H., Granger, H. J. Characterization of intact mesenteric lymphatic pump and its responsiveness to acute edemagenic stress. Am. J. Physiol. 257, H2059-H2059 (1989).
- Davis, M. J., Davis, A. M., Ku, C. W., Gashev, A. A. Myogenic constriction and dilation of isolated lymphatic vessels. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 296, H293-H293 (2009).
- Dougherty, P. J., Davis, M. J., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. Calcium sensitivity and cooperativity of permeabilized rat mesenteric lymphatics. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 294, R1524-R1524 (2008).
- Fay, F. S., Shlevin, H. H., Granger, W. C., Taylor, S. R. Aequorin luminescence during activation of single isolated smooth muscle cells. Nature. 280, 506-506 (1979).
- Wang, W. Inhibition of myosin light chain phosphorylation decreases rat mesenteric lymphatic contractile activity. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 726-726 (2009).
- Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-157 (1997).
- Ratz, P. H., Berg, K. M., Urban, N. H., Miner, A. S. Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KCl as a calcium-sensitizing stimulus. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 288, C769-C769 (2005).
- Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase. Physiol. Rev. 83, 1325-1325 (2003).
- Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Molina, P. E., Breslin, J. W. Adaptation of mesenteric collecting lymphatic pump function following acute alcohol intoxication. Microcirculation. 17, 514-514 (2010).
- Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism. Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).
- Shirasawa, Y., Benoit, J. N. Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).
- Imtiaz, M. S. Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization. Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).
- Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation. Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).
- Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent. 286, H2287-H2287 (2004).
