Mesure de cytosolique de Ca ^{2 +} En isolé lymphatique contractiles

Summary

Nous introduisons une approche pour évaluer la cytosolique de Ca

Abstract

Les vaisseaux lymphatiques constituent un système de transport multifonctionnel qui maintient l'homéostasie des fluides, offre des lipides dans la circulation centrale, et agit comme un système de surveillance pour les antigènes potentiellement dangereux, l'optimisation de l'immunité des muqueuses et des réponses immunitaires adaptatives ^1. La lymphe est formé à partir du liquide interstitiel qui pénètre aveugle clos lymphatiques initiaux, puis est transporté contre un gradient de pression dans les grandes lymphatiques collecte. Chaque lymphatique collecte est constitué d'une série de segments appelés lymphangions, séparées par des valves bicuspides qui empêchent le reflux. Chaque lymphangion possède un cycle de contraction qui propulse lymphatiques contre un gradient de pression vers la circulation centrale ^2. Ce schéma est analogue phasique contractiles au cycle cardiaque, avec la tension systolique et diastolique phases, et avec une fréquence inférieure ⁴ de contraction. En outre, les muscles lisses lymphatique génère ton et affiche une constriction myogénique et la dilatation in réponse aux augmentations et des diminutions de la pression luminale, respectivement ^5. Un hybride des mécanismes moléculaires qui favorisent à la fois la contractilité phasique et tonique du système lymphatique sont ainsi proposées.

Contraction du muscle lisse est généralement réglementé par le Ca ^{2 +} cytosolique de concentration ([Ca ^{2 +]} _i), plus la sensibilité au Ca ^{2 +,} des éléments contractiles en réponse aux changements dans l'environnement entourant la cellule ^6. [Ca ^{2 +]} _i est déterminée par la combinaison du mouvement de Ca ^{2 +} à travers la membrane plasmique ligand ou la tension fermée canaux Ca ^{2 +} et de la libération et l'absorption de Ca ^{2 +} dans les magasins internes. Cytosolique de Ca ^{2 +} se lie à la calmoduline et active les enzymes telles que la chaîne légère de myosine (MLC) kinase (MLCK), qui à son tour phosphoryle MLC menant à l'actine-myosine médiée contraction de ^8. Cependant, la sensibilité de cette voie à Ca 9. L'activité est réglementée par MLCP Rho kinase (ROCK) et la protéine myosine inhibiteur de phosphatase IPC-17.

Ici, nous présentons une méthode pour évaluer les changements de [Ca ^{2 +]} _i au cours du temps dans des régions isolées, les lymphatiques perfusé afin d'étudier Ca ^{2 +-dépendante} et Ca ^{2 +-sensibilisant} les mécanismes de la contraction musculaire lisse lymphatique. L'utilisation isolée lymphatiques mésentériques du rat collecte que nous avons étudié l'étirement induit des changements de [Ca ^{2 +]} _i et de l'activité contractile. Le modèle lymphatique isolé offre l'avantage de pression, débit, et la composition chimique de la solution de bain peut être étroitement contrôlées. [Ca ^{2 +]} _i est déterminé par le chargement des lymphatiques avec les ratiométrique, Ca ^{2 +} contraignant colorant Fura-2. Ces études fourniront une nouvelle approche au problème plus large de l'étude des différents mécanismes moléculaires qui régulent phasiquecontractions toniques contre la constriction des muscles lisses lymphatique.

Protocol

1. Animaux

1. Toutes les procédures ont été approuvées par les soins des animaux et du Comité institutionnel Utilisez à la Louisiana State University Health Sciences Center et ont été réalisées en conformité avec les directives du National Institute of Health (NIH Publication No. 85-12, révisée en 1996). Des rats Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 270-350 g de poids corporel) ont été logés dans une température contrôlée (22 ° C) et un éclairage contrôlé (12:12 h cycle lumineux sombre) environnement. Après leur arrivée, les rats ont été soumis à une période d'acclimatation d'une semaine et ont été fournies rats standards Chow (2018 Teklad mondiale régime 18% des rongeurs protéines, Harlan) et l'eau ad libitum.

2. Expérience Set-Up

1. Micropipettes de verre pour le montage lymphatiques sont fabriqués à partir de filaments de verre borosilicate avec OD 1.2mm, 0.69mm ID (Sutter Instrument BF 120-69-15). Tirez les pipettes en utilisant un Flaming / Brown Micropipette Extracteur modèle P-97 (Sutter InstrumORL) et sont coniques avec un broyeur Micro EG 400 (Narishige) pour obtenir un embout biseauté avec un diamètre de ~ 60 um extérieur.
2. Montez les micropipettes dans la chambre des navires isolés (modèle CH-1, les systèmes vivants, Burlington, VT). Les pipettes doivent être de résistance correspondant (ouverture même taille).
3. Remplir la chambre (5 ml) et micropipettes avec une solution saline physiologique à l'albumine (APSS, voir tableau 1). Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles dans le micropipettes ou de la tuyauterie.
4. Préparer pronation noeuds avec des sutures ophtalmiques et déposer sur chaque micropipette.

3. Collecte isolement lymphatique

1. Anesthésier les animaux avec une injection intramusculaire de kétamine / xylazine (90 et 9 mg / kg, respectivement), en utilisant une seringue BD (1 ml) et aiguille (BD biseau intradermique 26G3 / 8).
2. Vaporiser la région de l'abdomen avec de l'alcool à 70% pour stériliser, effectuer une laparotomie médiane, et extérioriser et de l'accise dans l'intestin grêle et le mésentère. Placez le tissu dans ice-froid APSS. Euthanasier les animaux avec une overdose de kétamine / xylazine et de confirmer la mort en ouvrant le coffre (comme par American Veterinary Medical Association directives sur l'euthanasie).
3. Pin une section du mésentère dans une chambre remplie de dissection glacée APSS. Soigneusement disséquer un vaisseau lymphatique collecte (80-200 pm de diamètre interne et 1-2 mm de longueur) à partir entourant le tissu adipeux et conjonctif avec l'aide d'un stéréomicroscope. Utilisez une pince à disséquer Dumont-INOX 55 (Science Tools Beaux # 11255-20) et disséquer des ciseaux à ressort (Outils Fine Science # 15000-03). Utilisez des navires isolés avec une seule vanne pour assurer un contrôle optimale de la pression dans le segment entier pendant l'expérience.
4. Transférer les lymphatiques isolés à la chambre des navires isolés contenant 5 ml de PSA. Montez le navire sur les deux micropipettes de verre de résistance appariés par l'attachant avec des sutures ophtalmiques.
5. Transfert de la chambre d'un microscope inversé fluorescente (la nôtre est une Niksur TE-2000U) équipé d'une lampe au xénon (Sutter Instruments Lambda LS2 300 W), 340/380 système de roue à filtres (Sutter Lambda 10-3 avec la technologie Chroma 340 et 380 nm filtres d'excitation), 510 nm émetteur dichroïque (D510 technologie Chroma / 80m), une caméra CCD sensibles (Photometrics HQ ^2), et le logiciel d'acquisition (Eléments Nikon AR) (figure 1).
6. Fixez le tuyau en provenance du Micropipettes réglables soit de réservoirs ou de la pompe de servo-rétroaction (Vivre systèmes d'instrumentation, Burlington VT), à la fois ce qui peut être utilisée pour modifier la pression et le débit.
7. Connectez la chambre à l'unité de chauffage (systèmes vivants) et définir le bain à 37 ° C.
8. Voir le lymphatique directement à travers la lamelle dans la base de la chambre avec un objectif 10X (Nikon plan Fluor 10x/0.3, DIC L/N1, ∞ / 0,17, DEO 16,0). Rapide des ensembles d'images en accéléré peuvent être acquises en utilisant le logiciel d'acquisition d'image (notre système a Nikon Elements AR logiciel).

2 +] _i

1. [Ca ^{2 +]} i dans le muscle lisse isolées lymphatique est mesurée par le Ca ^{2 +-détection} de colorants Fura 2-acétoxyméthyl ester (AM) (Molecular Probes, Eugene, OR).
2. Chargez le vaisseau lymphatique avec Fura-deux heures en échangeant le bain pour APSS solution contenant Fura-2 AM (2 pM) et l'acide pluronique (0,2% p / v) pendant 30 minutes à 37 ° C.
3. Après 30 minutes le changement le bain de retour à l'APSS solution. Rincer 2 fois pour laver le Fura-2 de la solution de bain. En quittant le navire pour un temps d'équilibrage d'au moins 20 min avant [Ca ^{2 +]} _i pour permettre le rétablissement des contractions spontanées.
4. Recueillir ratiométrique Fura-2 mesures dans les vaisseaux lymphatiques isolés avec un protocole d'acquisition qui illumine alternativement à 340 et 380 nm longueur d'onde pour des durées de 50 ms chacune. La lumière fluorescente passe à travers un miroir dichroïque (400 nm; Chroma Technologie Corp 400DCLP) et une large bande d'émission de filtre (510 nm, 80 nm largeur de bande; Chroma Technology Corp D510/80m) et est acquis par le Photometrics HQ ² caméra. Nous collectons des données de 2 minutes à une pression intraluminale de base de 2 cm H ₂ O et lors d'augmentations étape de 2, 4, 6, 8 et 10 cm H ₂ O.
5. Pour analyser la moyenne [Ca ^{2 +]} _i, dessiner une région d'intérêt (ROI) qui comprend la totalité des vaisseaux lymphatiques et des environs pour que le navire est entièrement suivis pendant la relaxation et la contraction (figure 2). Si l'une micropipette est dans le champ de vision de ces zones ne doivent pas être inclus dans le RSI. Les petits ROIs peuvent également être choisis, cependant un problème potentiel avec ROIs petits, c'est que les parois du vaisseau peut se déplacer légèrement dans le sens longitudinal de la RSI que le navire resserre et se détend. Un autre problème potentiel est que certains bateaux de torsion au cours de la contraction, et ces lymphatiques ne doivent pas être utilisés pour l'étude. Th.mouvements de torsion e sont généralement évités en limitant la durée de l'lymphatiques isolés à <1 mm. En outre, parfois des segments de chaque côté d'une vanne ne se contractent / se détendre dans la synchronie. Dans ce cas, parce que ces segments représentent séparés lymphangions fonctionnel, le système lymphatique doit être étudiée sur un seul côté de la vanne, ou chaque lymphangion peuvent être étudiés séparément avec un ROI placées de chaque côté. Lorsque vous utilisez un objectif 10X, les parois du vaisseau devrait rester dans concentrer pendant les contractions phasiques, cependant s'il ya des parties des murs qui sortent de se concentrer pendant les contractions de ces zones ne doivent pas être inclus dans le RSI. Un ROI de fond est également utilisé et devrait être placé loin du navire (par exemple dans le coin de l'image). Une augmentation du ratio de 340/380 indique une augmentation de [Ca ^{2 +]} _i. Diamètre luminal à divers moments peut également être mesurée en utilisant la fonction de mesurer le logiciel ou par le suivi des parois des vaisseaux au cours du temps (voir section 6). </ Li>

5. Protocole de contrôle de pression

1. Pour étudier la pression indépendante du flux imposé, la même pression doit être appliquée à chaque micropipette par la pompe de servo-retour nul. Le tube de chaque micropipette est attachée via un connecteur en T pour tube commune monté sur la pompe. Initialement fixé à la pression intraluminale moins 2 cm H ₂ O pendant 45-60 min., Ce qui est assez de temps pour permettre le développement des contractions spontanées lymphatique.
2. Pour étudier l'utilisation des seuls navires qui respectent les critères suivants dans le délai d'équilibration: (1) le navire développe ton spontané à 2 cm H ₂ O, (2) le navire développe régulièrement, contractions spontanées qui sont raisonnablement uniforme sur toute la longueur du navire . Souvent, la zone en aval d'une vanne de resserre plus que le reste du navire, et ces navires seront utilisés tant qu'il ya des preuves que le reste du navire affiche l'activité contractile.
3. Enregistrez le rapide time-lapse images lors de la procédure étape de pression. Pour chacun, la pression commencera à 2 cm H ₂ O pendant 30 s, puis est soulevée dans une étape par deux, quatre, six, huit ou dix cm H ₂ O pendant une minute, et abaissé de retour à 2 cm H ₂ O pendant 30 s.
4. Après achèvement de la série étape de pression, changer la solution de bain pour une Ca ^{2 +} libre APSS à 37 ° C pour mesurer le diamètre maximal passive (Max D) et Ca ^{2 +-fluorescence} des mesures à chacun des pressions supérieures à luminal. Le D Max est utilisé pour calculer ton et normaliser les données entre les lymphatiques de différentes tailles.

6. Paramètres lymphatique contractiles

1. Les changements dans le diamètre du vaisseau au cours du temps peut être déterminé en utilisant des outils de suivi d'objets en paquets plus l'image des logiciels d'analyse. Ceci peut être réalisé en utilisant uniquement l'un des canaux (nous utilisons le canal 340 nm mais le canal 380 pourrait également être utilisé). Un seuil de contraste est appmenti à la pile image de sorte que les parois des vaisseaux sont en surbrillance, puis ROIs englobant chaque mur sont tirés de les suivre au fil du temps (Figure 3). Le diamètre intérieur peut être déterminé en mesurant le barycentre de chaque mur et le calcul de la distance entre les deux centroïdes, moins de la moitié de l'épaisseur de chaque mur.
   Une deuxième option quand il est difficile de suivre chaque mur en raison d'un signal fort dans la zone luminale est pour mesurer le diamètre externe, et utiliser un facteur de correction basé sur une mesure statique de la paroi des vaisseaux pour obtenir un diamètre interne. Dans ce cas, le ROI couvre l'ensemble du navire et le diamètre extérieur est suivi (figure 3 B). Cette méthode peut également être utilisée pour déterminer l'ensemble visualisable section transversale du système lymphatique (figure 3 C). En raison de la forme typique d'un lymphangion, cette dernière option peut fournir une meilleure estimation du volume réel du fluide pompé à chaque contraction que l'utilisation de diamètre dans une partie sélectionnéedu navire.
2. De l'étude de time-lapse de déterminer les paramètres suivants de mesures lymphatique diamètre luminal ^4,12,13:
   Fréquence des contractions (FC), déterminée en comptant le nombre de contractions phasiques par minute.
   Fin de diamètre diastolique (EDD), qui est le diamètre juste avant une contraction phasique.
   Fin de diamètre systolique (EDD), le diamètre à la fin d'une contraction phasique.
   Amplitude de la contraction (AMP = EDD EDD), un indice simplifié de la volume d'éjection systolique.
   Le diamètre maximal passive à chaque pression (Max D; déterminée en Ca ^{2 +} sans conditions), qui peut être utilisée pour déterminer la tonalité émise par le muscle lisse lymphatique, et est également utilisée pour normaliser les données entre les lymphatiques de diamètre différent, ou lymphatique même étudié à différentes pressions luminal.
   JED _1, qui est l'EDD associé à la première contraction après une étape de pression. Il est utilisé comme point de départ pourdéterminer la constriction myogénique d'un vaisseau lymphatique en réponse à une augmentation de la pression luminale étape ^5.
   Constriction myogénique d'un lymphatiques isolés après une étape de pression est représentée par le changement normalisée dans l'EDD après une augmentation de la pression étape = 100 * (JED - EDD ₁₎ / Max D.
   Les variables supplémentaires qui peuvent être calculés, mais sont discutés ailleurs dans le détail ⁴ sont les suivants:
   Tone = 100 * (Max D - EDD) / Max D, AMP normalisée = AMP / Max D
   Indice de volume des maladies (SVI) = π (EDD ² - ESD ²⁾
   Fraction d'éjection (FE) = SVI / (πEDD2)
   Indice de débit (VFI) = FC x SVI.

7. Les résultats représentatifs:

Au début de chaque contraction phasique, il y avait une augmentation transitoire de [Ca ^{2 +]} _i (figure 4). En outre, après des hausses de la pression luminale étape, la fréquence de Ca ^{2 +} transitoires et pcontractions Hasic augmenté en synchronie. Ces observations sont similaires à une conclusion précédente en utilisant des conduits thoraciques montés sur un myographe ¹⁴ fils et de soutien des données antérieures indiquant un rôle central pour oscillatoires Ca ^{2 +} dans les magasins de communiqué interne dans le mécanisme sous-jacent au cycle phasique contractiles ^15.

Nous avons également cherché à savoir si [Ca ^{2 +]} _i pendant la diastole (entre le Ca ^{2 +} transitoires et de contractions phasiques) est associé avec le ton lymphatique et la constriction myogénique causé par l'étirement lorsque des augmentations de la pression étapes sont imposées (figure 5). Immédiatement après les augmentations étape dans la pression de 4 cm H ₂ O et supérieur, [Ca ^{2 +]} _i pendant la diastole cessé d'augmenter, par rapport aux valeurs de base avant l'étape de pression (figure 5B). En outre, après l'augmentation initiale de diamètre dû à l'augmentation de la pression étape (EDD _1), il y avait une constriction myogénique (FigUre 5C), définie comme une diminution de l'EDD à partir EDD ₁ dans les précédents rapports ^5,12. Lorsque l'on compare la variation moyenne normalisée dans l'EDD parmi les étapes de pression différents, il y avait nettement plus de constriction après des hausses de 8 et 10 cm H ₂ O par rapport à 2 cm H ₂ O (Figure 6). L'augmentation constante de [Ca ^{2 +]} _i était également liée à la pression, avec les augmentations d'échelon de 6, 8 et 10 cm H ₂ O provoque des changements significativement plus élevé en Ca ^{2 +} à 2 cm H ₂ O ( Figure 6 B). Cependant, la pression étape de Ca ^{2 +} relation semble plateau à ces pressions aussi bien. Ces résultats suggèrent que Ca ^{2 +-dépendante} mécanisme est associé à un rétrécissement lymphatique myogénique en réponse à l'étirement. Toutefois, le plateau de la pression étape de Ca ^{2 +} relation suggère un mécanisme qui augmente la sensibilité de Ca ^{2 +} peuvent également contribuer à l'augmentation constri myogéniquection sur les marches pression supérieure.

Figure 1. Schéma du système de microscope utilisé pour la mesure de [Ca ^{2 +]} _i dans une lymphatiques isolés. La chambre lymphatique isolé est placé sur la platine du microscope inversé. Le spécimen est illuminé alternativement à 340 et 380 nm, et le signal fluorescent émis par le système lymphatique est recueilli avec une caméra CCD et stockés dans un ordinateur personnel. La pression intraluminale de l'lymphatique est contrôlé par un système de rétroaction servo-nulle. L'utilisateur définit la pression pour le système, et les transducteurs de pression en ligne avec le système lymphatique relais de la pression intraluminale au système de rétroaction, ce qui peut augmenter ou diminuer dynamiquement la pression par une pompe.

Figure 2. Exemple de la région d'intérêt (ROI) de sélection pour Fura-2 études d'imagerie ratiométrique dans les vaisseaux lymphatiques isolés. La région choisie comprend la plupart du navire (à l'exception des zones de toucher le micropipettes) et ses environs pour assurer le navire sera suivi par le cours du temps ensemble. Un ROI de fond (en haut à droite) est également utilisée pour éliminer les signaux non spécifiques du bain environnant.

Figure 3. Méthodes de suivi de pompage lymphatique. A. diamètre intérieur peut être déterminé au cours du temps en utilisant ROIs que suivre le mouvement des parois du vaisseau. B. Lorsque le seuil de contraste est fixé à inclure l'ensemble du navire, le diamètre extérieur peuvent être suivis avec un retour sur investissement unique. Le diamètre intérieur peut être estimée à partir de ces mesures par la correction de l'épaisseur du mur. C. Une autre option est de suivre la zone couverte par le navire, qui peut être utilisé pour calculer le volume en corrigeant épaisseur du mur eten supposant que le système lymphatique a une géométrie cylindrique.

Figure 4. Relation entre [Ca ^{2 +]} _i et de diamètre lymphatique. Une. Images représentant d'une vidéo time-lapse de Fura-2 d'intensité (format carte de chaleur) dans un lymphatiques isolés. Les flèches dans chaque image de contour, le diamètre extérieur du navire. Image 1 montre le système lymphatique pendant la diastole, avec relativement faible [Ca ^{2 +]} _i. Dans l'image 2, l'intensité de la 340/380 rapport augmente dans les parois des vaisseaux, juste avant la contraction phasique qui se produit dans les images 3-5. Par l'image 4, le Ca ^{2 +} transitoire a pris fin, et par l'image 5, la phase systolique est terminée et le navire est de retour à son état ​​de repos. B. Une parcelle de [Ca ^{2 +]} _i et le diamètre luminal lymphatique montre qu'une augmentation transitoire de [Ca ^{2 +]} _i se produit juste avant chaquecontraction phasique.

Figure 5. Les changements dans lymphatique [Ca ^{2 +]} _i et le cycle de contraction lymphatique en réponse à l'étape des augmentations de pression. Les protocoles étape de pression (A), 340/380 données de ratio, ce qui représente [Ca ^{2 +]} _i (B), et les changements de diamètre lymphatique au cours du temps (C) sont représentés. A. base une pression luminale était de 2 cm H ₂ O et le vaisseau lymphatique a été soumis à l'étape des augmentations de 2, 4, 6, 8 et 10 cm H ₂ O. L'intervalle de temps entre chaque enregistrement pas à pas la pression était de 1-2 min. Chaque étape de pression a provoqué une augmentation de la fréquence des augmentations transitoires de [Ca ^{2 +]} _i (B) et contractions phasiques (C). Diamètre lymphatique a également augmenté avec chaque augmentation de la pression luminale étape, et pour les 4 à 10 cm H ₂ O étapes de pression, il y avait une baisse initiale de l'EDD qui ont eu lieu after EDD1 (C), précédemment décrite comme une constriction myogénique lymphatique. Il y avait également une augmentation constante de la base [Ca ^{2 +]} _i entre les transitoires immédiatement après chaque augmentation de la pression étape (B). La constriction myogénique a été plus marquée avec les étapes de pression plus grande, cependant l'augmentation de la basale [Ca ^{2 +]} _i était approximativement la même pour les 4 à 10 cm H ₂ O étapes de pression (B). Une augmentation indiqué précédemment compensatoire dans l'AMP a également été manifeste après les étapes de pression de 6 à 10 cm H ₂ O (C).

Figure 6. Constriction lymphatique myogène et l'augmentation graduelle de libre [Ca ^{2 +]} _i pendant la diastole, peu après augmentations d'échelon de pression. Une. La moyenne EDD entre 30-50 s après le ₁ EDD est utilisé pour calculer la variation de l'EDD normalisé pour chaque étape de pression. B. L'intensité de la 340/380 ratio de 30 à 50 s après le ₁ EDD a été divisé par la moyenne 340/380 ratio de cours de base (2 cm H ₂ O). * P <0,05 vs les deux cm H ₂ O étape de pression. N = 4 navires étudiés.

Vidéo 1. Exemple de contractions phasiques dans un vaisseau lymphatique isolés utilisés pour l'étude. La pression luminale a été fixé à 2 cm H ₂ O. Le temps écoulé et une barre d'échelle sont indiquées en bas. Les images en accéléré ont été recueillies avec un objectif 10X en utilisant la lumière transmise. Cliquez ici pour regarder le film.

Movie 2. Ratiométrique Fura-2 d'imagerie dans un pompage lymphatique isolé. Une échelle de la carte chaleur est représenté en haut à gauche et le temps écoulé et de barre d'échelle sont indiquées en bas. La pression était initialement fixé à 2 cm H ₂ O et a été porté à 8 cm H ₂ O à partir de 0,5 min et Returned à 2 cm H ₂ O à 1,5 min. Cliquez ici pour regarder le film.

Discussion

Une nouvelle combinaison de méthodes a été employée pour étudier intrinsèques de pompage des vaisseaux lymphatiques. La capacité de mesurer simultanément les variations de [Ca ^{2 +]} _i et de diamètre dans les vaisseaux lymphatiques de pompage permettra à des études sur les contributions relatives de Ca ^{2 +-dépendante} et Ca ^{2 +-sensibilisant} les voies de signalisation dans le mécanisme global régissant le cycle lymphatique contractiles.

Le cycle se compose de contractiles lymphatique contractions phasiques en surimpression sur ton. Les données montrent que chaque contraction phasique est associée à une augmentation transitoire de [Ca ^{2 +]} _i, suggérant un rôle central de Ca ^{2 +} dans le mécanisme de pacemaker, et que la fréquence de Ca ^{2 +} transitoires est sensible aux changements de pression luminale . Nos données montrent également que les augmentations rapides de la pression peut provoquer une augmentation régulière de la base [Ca ^{2 +]} _i entre les transitoires. Cette hausse pourrait contribuer àla constriction myogénique qui est observé dans la collecte lymphatiques suite à l'augmentation de la pression luminale étape. Toutefois, nous avons observé un plateau de l'augmentation dans cette basale [Ca ^{2 +]} _i avec des étapes de pression allant de 6 à 10 cm H ₂ O, qui avait des degrés de constriction myogénique. Ces données suggèrent qu'un autre mécanisme, peut-être une Ca ^{2 +-sensibilisant} mécanisme, est également impliqué dans la réponse myogénique à la pression.

Une hypothèse à ces études est que la majorité de la mesure de Ca ^{2 +} est contenue dans le muscle lisse. Toutefois, Ca ^{2 +} dans les cellules endothéliales et les autres types de cellules qui peuvent être présents dans les vaisseaux lymphatiques contribuent également à l'ensemble observée [Ca ^{2 +]} _i, donc les valeurs mesurées sont probablement une surestimation des muscles lisses [Ca ^{2 +]} _i dans lymphatiques. Toute ² Ca ⁺ mesuré à partir de l'endothélium ne devrait pas contribuer directementà la contraction des muscles lisses basées sur des études antérieures dans les artérioles ^16. Cette question sera abordée dans les futures expériences dans lesquelles les vaisseaux lymphatiques sont dénudées d'endothélium.

Lors de l'utilisation des teintures ratiométrique à évaluer [Ca ^{2 +]} _i dans les cellules ou les tissus, le mouvement de l'échantillon peuvent causer des artefacts. Afin de minimiser les artefacts de mouvement dans les contrats lymphatiques, nous avons utilisé un ROI qui comprend aussi bien du navire que possible pour déterminer les ratios 340/380. Nous avons également la seule étude des navires qui restent dans l'accent au cours de leur cycle de contraction. Parce que des artefacts potentiels qui pourraient résulter de mouvements du navire, plutôt que de déterminer l'absolu [Ca ^{2 +]} _i à un site particulier, on obtient la moyenne pour une grande surface de la cuve. Nous nous concentrons sur les changements relatifs à la moyenne [Ca ^{2 +]} _i dans le temps et comment ces changements se rapportent à la contraction phasique et tonique des vaisseaux.

En résumé, DETErmination des variations de [Ca ^{2 +]} _i par imagerie ratiométrique isolées lymphatiques collecte représente un outil puissant pour déchiffrer le Ca ^{2 +-dépendante} et Ca ^{2 +-sensibilisant} mécanismes sous-jacents du cycle lymphatique contractiles. Avec cette méthode, les études futures utilisant des agonistes sélectifs ou des inhibiteurs des différentes voies de transduction du signal sera également aider à différencier les mécanismes moléculaires sous-jacents uniques contraction phasique par rapport tonique dans le muscle lisse lymphatique.