Meting van cytosolische Ca ^{2 +} In geïsoleerde contractiele lymphatische

Summary

We introduceren een benadering van de cytosolische Ca evalueren

Abstract

Lymfevaten bevatten een multifunctioneel transport systeem dat vloeistof homeostase onderhoudt, levert lipiden naar de centrale circulatie, en fungeert als een systeem van toezicht voor de potentieel schadelijke antigenen, het optimaliseren van mucosale immuniteit en adaptieve immuunreacties ^1. Lymfe is gevormd uit interstitiële vloeistof die blind-ended initiële lymfevaten komt, en dan wordt getransporteerd tegen een druk gradiënt in grotere lymfevaten verzamelen. Elke verzamelen van lymfatische is opgebouwd uit een reeks van segmenten genoemd lymphangions, gescheiden door premolaren kleppen die terugstroming te voorkomen. Elke lymphangion beschikt over een contractiele cyclus die lymfe tegen een druk gradiënt in de richting van de centrale circulatie ² voortstuwt. Deze fasische contractiele patroon is analoog aan de hartcyclus, met een systolische en diastolische fasen, en met een lagere frequentie krimp ^4. Daarnaast, lymfatische gladde spieren genereert toon en displays myogene vernauwing en verwijding in reactie op de stijgingen en dalingen in de luminale druk, respectievelijk ^5. Een hybride van moleculaire mechanismen die zowel de fasische en tonische contractiliteit van de lymfevaten te ondersteunen zijn dus voorgesteld.

Samentrekking van de gladde spieren in het algemeen bij de cytosolische Ca ^{2 +-concentratie} ([Ca ^{2 +]} _i) plus gevoeligheid voor Ca ^{2 +,} van de contractiele elementen in antwoord op veranderingen in de omgeving rondom de cel ^6. [Ca ^{2 +]} _i wordt bepaald door de combinatie van de beweging van Ca ^{2 +} door middel van plasma membraan ligand of spanningsgevoelige Ca ^{2 +} kanalen en de vrijlating en opname van Ca ^{2 +} uit interne winkels. Cytosolische Ca ^{2 +} bindt aan calmoduline en activeert enzymen zoals myosine lichte keten (MLC) kinase (MLCK), die op zijn beurt fosforyleert MLC leidt tot actine-myosine-gemedieerde contractie ^8. Echter, de gevoeligheid van deze weg naar Ca 9. MLCP activiteit wordt gereguleerd door Rho kinase (ROCK) en de myosine fosfatase inhibitor proteïne CPI-17.

Hier presenteren we een methode om veranderingen te evalueren in [Ca ^{2 +]} _i loop van de tijd in geïsoleerde, perfusie lymfatische om Ca ^{2 +-afhankelijke} en Ca ^{2 +-sensibiliserende} mechanismen van lymfatische gladde spiercontractie te bestuderen. Met behulp van geïsoleerde rat mesenteriale het verzamelen van lymfevaten we stretch-geïnduceerde veranderingen bestudeerd in [Ca ^{2 +]} _i en contractiele activiteit. De geïsoleerde lymfatische model biedt het voordeel dat de druk, flow, en de chemische samenstelling van het bad oplossing kan strak worden gecontroleerd. [Ca ^{2 +]} _i werd bepaald door het laden van lymfevaten met de ratiometrische, Ca ^{2 +-bindende} kleurstof Fura-2. Deze studies zullen een nieuwe benadering van het bredere probleem van het bestuderen van de verschillende moleculaire mechanismen die reguleren fasischcontracties versus tonic vernauwing in lymfatische gladde spieren.

Protocol

1. Dieren

1. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op de Louisiana State University Health Sciences Center en werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het National Institute of Health (NIH publicatie No 85-12, herzien in 1996). Mannelijke Sprague-Dawley ratten (Charles River Laboratories, 270-350 g lichaamsgewicht wt) werden ondergebracht in een gecontroleerde temperatuur (22 ° C) en gecontroleerde verlichting (12:12 h licht donker cyclus) omgeving. Na aankomst werden de ratten onderworpen aan een een-week acclimatiseringsperiode en werden voorzien standaard rat chow (2018 Teklad Global 18% Eiwit knaagdierendieet, Harlan) en water ad libitum.

2. Experiment Set-Up

1. Glas Micropipetten voor het monteren van lymfevaten zijn gemaakt van borosilicaatglas met een gloeidraad OD 1,2 mm, ID 0.69mm (Sutter Instrument BF 120-69-15). Trek de pipetten met behulp van een Flaming / Brown Micropipet Puller model P-97 (Sutter Instrument) en zijn bevel met een Micro Grinder EG 400 (Narishige) om een ​​afgeschuinde tip te verkrijgen met een ~ 60 micrometer buitendiameter.
2. Monteer de micropipetten in het geïsoleerde vat kamer (model CH-1, Living Systems, Burlington, VT). De pipetten moeten worden afgestemd weerstand (even groot opening).
3. Vul de kamer (5 ml) en micropipetten met albumine-fysiologische zoutoplossing (APSS, zie tabel 1). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de micropipetten of de slang.
4. Bereid overhandse knopen met oogheelkundige hechtingen en plaats een op elke micropipet.

3. Verzamelen Lymfatische Isolatie

1. Verdoven van de dieren met een intramusculaire injectie van ketamine / xylazine (90 en 9 mg / kg, respectievelijk), met behulp van een BD-injectiespuit (1 ml) en naald (BD intradermale bevel 26G3 / 8).
2. Spray de buik gebied met 70% alcohol te steriliseren, het uitvoeren van een middellijn laparotomie, en exterioriseren en accijnzen van de dunne darm en het mesenterium. Plaats het weefsel in ice-koud APSS. Euthanaseren van de dieren met een overdosis ketamine / xylazine en bevestig de dood door het openen van de borst (zoals per American Veterinary Medical Association richtlijnen voor euthanasie).
3. Pin een deel van mesenterium in een dissectie kamer gevuld met ijskoude APSS. Zorgvuldig ontleden een verzamelen lymfevat (80-200 um inwendige diameter en 1-2 mm van de lengte) uit de omliggende vet-en bindweefsel met behulp van een stereomicroscoop. Gebruik ontleden Dumont tang-INOX 55 (Fine Science Tools # 11255-20) en ontleden van de lente schaar (Fine Science Tools # 15000 tot 03). Gebruik geïsoleerde schepen met slechts een ventiel om een ​​optimale drukregeling in het gehele segment zorgen tijdens het experiment.
4. Overdracht van de geïsoleerde lymfatische aan de geïsoleerde vat kamer met 5 ml van de APSS. Monteer het schip op de twee weerstand gematchte glas micropipetten door koppelverkoop met de oogheelkundige hechtingen.
5. Breng de kamer tot een omgekeerde fluorescentie microscoop (de onze is een Nikop de TE-2000U) uitgerust met een xenon lamp (Sutter Instruments Lambda LS2 300 W), 340/380 filter wiel systeem (Sutter Lambda 10-3 met Chroma Technology 340 en 380 nm excitatie filters), 510 nm dichroïsche emitter (Chroma Technology D510 / 80m), een gevoelige CCD-camera (Photometrics HQ ^2), en software voor acquisitie (Nikon Elementen AR) (figuur 1).
6. Bevestig de slang afkomstig van de micropipetten ofwel verstelbare reservoirs of aan de servo-feedback pomp systeem (Living Systems Instrumentatie, Burlington VT), beide die kan worden gebruikt om de druk en flow veranderen.
7. Sluit de kamer aan op het verwarmingstoestel (Living Systems) en zet het bad tot 37 ° C.
8. Bekijk de lymfatische rechtstreeks via de dekglaasje in de basis van de kamer met een 10X objectief (Nikon Plan Fluor 10x/0.3, DIC L/N1, ∞ / 0,17, WD 16,0). Een snelle time-lapse afbeelding sets kunnen worden verkregen met behulp van het beeld acquisitie software (ons systeem heeft Nikon Elements AR software).

2 +] _i

1. [Ca ^{2 +]} i in het geïsoleerde lymfatische gladde spieren wordt gemeten door de Ca ^{2 +-sensing} kleurstof Fura 2-acetoxymethyl ester (AM) (Molecular Probes, Eugene, OR).
2. Laad de lymfevat met Fura-2 AM door het uitwisselen van het bad om de oplossing met Fura-2 AM (2 uM) en Pluronic zuur (0,2% gew / vol) gedurende 30 minuten APSS bij 37 ° C.
3. Na 30 minuten terug te gaan het bad om de oplossing te APSS. Spoel twee keer te wassen de Fura-2 uit het bad oplossing. We verlaten het schip voor een equilibratie tijd van ten minste 20 minuten voor [Ca ^{2 +]} _i metingen, zodat herstel van spontane weeën.
4. Verzamel ratiometrische Fura-2-metingen in geïsoleerde lymfevaten met een overname protocol dat afwisselend bij 340 en 380 nm golflengte licht voor de duur van 50 ms per stuk. De tl-licht gaat door een dichroïsche spiegel (400 nm; Chroma Technology Corp 400DCLP) en een brede band emissie filter (510 nm, 80 nm bandbreedte; Chroma Technology Corp D510/80m) en is verworven door de Photometrics HQ ^twee camera. Wij verzamelen twee minuten van gegevens op een baseline intraluminale druk van 2 cm H ₂ O en bij stap verhoogt van +2, +4, +6, +8 en +10 cm H ₂ O.
5. Voor het analyseren van de gemiddelde [Ca ^{2 +]} _i, trekken een regio van belang (ROI) dat de hele lymfevat en het omliggende gebied, zodat het schip volledig is gevolgd tijdens de ontspanning en contractie (figuur 2) omvat. Als een van beide micropipet is op het gebied van mening dat deze gebieden moeten niet worden opgenomen in de ROI. Kleinere ROI kan ook worden gekozen, maar een potentieel probleem met kleine ROI's is dat de vaatwanden iets kan bewegen in de lengterichting uit de ROI als het vat vernauwt en ontspant. Een ander potentieel probleem is dat sommige schepen twist tijdens de contractie, en deze lymfevaten mogen niet gebruikt worden voor studie. The draaibewegingen worden meestal vermeden worden door het beperken van de lengte van de geïsoleerde lymfatische tot <1 mm. Daarnaast, soms segmenten aan weerszijden van een klep niet constrict / ontspanning synchroon. In dit geval, omdat deze segmenten afzonderlijke functionele lymphangions vertegenwoordigen, moet de lymfatische worden bestudeerd slechts aan een zijde van de klep, of elk lymphangion kunnen afzonderlijk worden bestudeerd met een ROI aan weerszijden. Bij gebruik van een 10X objectief, moet de vaatwanden blijven in focus tijdens de fasische contracties, maar als er delen van de muren die uit te gaan van de focus tijdens de weeën deze gebieden moeten niet worden opgenomen in de ROI. Een achtergrond ROI wordt ook gebruikt en moet ver worden geplaatst uit het vat (bijvoorbeeld in de hoek van het beeld). Een toename van de 340/380 ratio geeft een toename van [Ca ^{2 +]} _i. Luminale diameter op verschillende tijdstippen kan ook worden gemeten met behulp van de software te meten functie of door het volgen van de vaatwanden in de tijd (zie paragraaf 6). </ Li>

5. Pressure Control Protocol

1. Voor het bestuderen van de druk onafhankelijk van de opgelegde stroom, moeten dezelfde druk worden toegepast op elk micropipet van de servo-null feedback pomp. De slangen van elk micropipet is verbonden via een T-connector om gemeenschappelijke slang gemonteerd op de pomp. In eerste instantie zet de intraluminale druk op 2 cm H ₂ O voor 45-60 min.., Wat genoeg is tijd om de ontwikkeling van lymfatische spontane contracties mogelijk te maken.
2. Voor studie gebruik alleen schepen die aan de volgende criteria binnen het evenwicht periode te voldoen: (1) het vaartuig ontwikkelt zich spontaan toon op 2 cm H ₂ O, (2) het vaartuig ontwikkelt regelmatige, spontane weeën die redelijkerwijs uniform zijn over de lengte van het schip . Vaak is het gebied stroomafwaarts van een klep vernauwt meer dan de rest van het schip, en deze vaartuigen, zolang er bewijs is dat de rest van het schip contractiele activiteit displays worden gebruikt.
3. Neem de snelle time-lapse beelden tijdens de druk stap procedure. Voor ieder zal de druk beginnen bij 2 cm H ₂ O voor 30 s, en dan wordt opgeworpen in een stap met +2, +4, +6, +8 of +10 cm H ₂ O gedurende een minuut, en weer omlaag tot en met 2 cm H ₂ O voor 30 s.
4. Na voltooiing van de druk stap-serie, wijzigt het bad oplossing voor een Ca ^{2 +-vrij} APSS bij 37 ° C om de maximale passieve diameter (Max D) en Ca ^{2 +-fluorescentie} metingen te meten bij elk van de bovenstaande luminale druk. De Max D wordt gebruikt om de toon te berekenen en gegevens tussen de lymfevaten van verschillende grootte te normaliseren.

6. Lymfatische contractiele Parameters

1. Veranderingen in het vat met een diameter loop van de tijd kan worden bepaald met behulp van object tracking tools in de meeste beeldanalyse software pakketten. Dit kan worden bereikt door het gebruik van slechts een van de kanalen (we gebruiken het 340 nm kanaal, maar de 380-kanaal kan ook worden gebruikt). Een contrast drempel appgelogen om de afbeelding te stapelen, zodat de vaatwanden worden gemarkeerd, en vervolgens ROI omvat elke muur worden getrokken om ze te volgen in de tijd (figuur 3 A). De inwendige diameter kan worden bepaald door het meten van het zwaartepunt van elke muur en het berekenen van de afstand tussen de twee centroïden, minus de helft van de dikte van elke muur.
   Een tweede optie wanneer het moeilijk is om bij te houden elke muur te wijten aan een sterk signaal in de luminale gebied is om uitwendige diameter te meten, en een correctiefactor gebaseerd op een statische meting van de vaatwanden aan de interne diameter te verkrijgen gebruiken. In dit geval is de ROI overspant de gehele schip en de buitendiameter is gevolgd (Figuur 3 B). Deze methode kan ook gebruikt worden om de hele zichtbare dwarsdoorsnede van het lymfestelsel (figuur 3 C) te bepalen. Vanwege de typische vorm van een lymphangion, kan deze laatste optie zorgen voor een betere schatting van het werkelijke volume van de vloeistof gepompt met elke wee dan het gebruik van diameter in een geselecteerd gedeeltevan het schip.
2. Van de time-lapse studie bepalen van de volgende parameters van lymfatische luminale diameter metingen ^4,12,13:
   Contractie frequentie (CF), bepaald door het tellen van het aantal fasische contracties per minuut.
   Eind diastolische diameter (EDD), dat is de diameter vlak voor een driefase krimp.
   Einde systolische diameter (ESD), de diameter aan het eind van een driefase contractie.
   Amplitude van de contractie (AMP = EDD-ESD), een vereenvoudigde index van het slagvolume.
   De maximale passieve diameter bij elke druk (max. D; bepaald in Ca ^{2 +-vrije} omstandigheden), die kan worden gebruikt om de toon die door het lymfestelsel gladde spieren te bepalen, en wordt ook gebruikt om gegevens te normaliseren tussen de lymfevaten van verschillende diameter, of dezelfde lymfatische studeerde aan verschillende luminale druk.
   EDD _1, dat is de EDD geassocieerd met de eerste contractie na een druk stap. Dit wordt gebruikt als uitgangspunt bij hethet bepalen van myogene vernauwing van een lymfevat in reactie op een stap verhoging van de luminale druk ^5.
   Myogene vernauwing van een geïsoleerde lymfatische na een druk stap wordt vertegenwoordigd door de genormaliseerde verandering in de EDD na een druk stap stijging = 100 * (EDD - EDD ₁₎ / Max D.
   Extra variabelen die kunnen worden berekend, maar worden elders in detail ⁴ bod komen zijn:
   Toon = 100 * (Max D - EDD) / Max D, genormaliseerd AMP = AMP / Max D
   Slagvolume-index (SVI) = π (EDD ² - ESD ²⁾
   Ejectiefractie (EF) = SVI / (πEDD2)
   Volume Flow Index (VFI) = CF x SVI.

7. Representatieve resultaten:

Aan het begin van elke fasisch contractie, was er een tijdelijke toename van [Ca ^{2 +]} _i (Figuur 4). Daarnaast, na stap toename van de luminale druk, de frequentie van de Ca ^{2 +} transiënten en phasic contracties meer synchroon. Deze observaties zijn vergelijkbaar met een eerdere vinden met behulp van thoracale leidingen gemonteerd op een draad myograph ¹⁴ en ondersteunen eerdere gegevens die erop wijzen een centrale rol voor oscillerende Ca ^{2 +} release van interne winkels in het mechanisme achter de driefase contractiele cyclus ^15.

We hebben ook onderzocht of [Ca ^{2 +]} _i tijdens de diastole (tussen de Ca ^{2 +} transiënten en fasische contracties) wordt geassocieerd met de lymfatische toon en myogene vernauwing veroorzaakt door de rekken bij het ​​stap voor verhoging van de druk worden opgelegd (zie figuur 5). Onmiddellijk na stap toename van de druk van +4 cm H ₂ O en hoger, [Ca ^{2 +]} _i tijdens de diastole gestaag toegenomen, ten opzichte van baseline voorafgaand aan de druk van stap (figuur 5B). Daarnaast, na de initiële toename in diameter te wijten aan de stap toename van de druk (EDD _1), was er myogene vernauwing (FigUre 5C), gedefinieerd als een afname van de EDD van EDD _een in eerdere verslagen ^5,12. Bij het ​​vergelijken van de gemiddelde genormaliseerde verandering in EDD tussen de verschillende druk stappen, was er significant meer vernauwing na de stijgingen van +8 en +10 cm H ₂ O in vergelijking tot +2 cm H ₂ O (Figuur 6 A). De gestage toename van [Ca ^{2 +]} _i was ook te maken met druk, met de stap toename van +6, +8, en +10 cm H ₂ O veroorzaken significant hoger wijzigingen in de Ca ^{2 +} dan +2 cm H ₂ O ( Figuur 6 B). Echter, de druk van stap-voor Ca ^{2 +} relatie lijkt plateau aan deze druk ook. Deze resultaten suggereren dat een Ca ^{2 +-afhankelijk} mechanisme wordt in verband gebracht met lymfatische myogene vernauwing in reactie op de rekken. Echter, het plateau in de druk stap-Ca ^{2 +} relatie suggereert een mechanisme dat Ca ^{2 +} verhoogt de gevoeligheid kan ook bijdragen aan de toegenomen myogene constrictie op de hogere druk stappen.

Figuur 1. Schema van de microscoop wordt gebruikt voor het meten van [Ca ^{2 +]} _i in een geïsoleerde lymfatische. De geïsoleerde lymfatische kamer wordt geplaatst op het podium van de omgekeerde microscoop. Het monster is afwisselend verlicht bij 340 en 380 nm, en het fluorescerende signaal uitgezonden door het lymfestelsel wordt verzameld met een CCD-camera en opgeslagen in een personal computer. De intraluminale druk van het lymfestelsel wordt gecontroleerd door een servo-null feedback systeem. De gebruiker stelt de druk voor het systeem, en de druk transducers in lijn met de lymfatische relais de intraluminale druk om de feedback systeem, dat dynamisch kan verhogen of verlagen druk via een pomp.

Figuur 2. Voorbeeld van een regio of Interest (ROI) selectie voor Fura-2 ratiometrische imaging studies in geïsoleerde lymfevaten. De keuze van de regio omvat het grootste deel van het schip (met uitzondering van gebieden die het aanraken van de micropipetten) en het omringende gebied te verzekeren van het schip worden bijgehouden voor de gehele tijdsverloop. Een achtergrond ROI (rechts bovenin) wordt ook gebruikt om niet-specifieke signaal van de omliggende bad te elimineren.

Figuur 3. Methoden voor het bijhouden van lymfatische pompen. A. Interne diameter kan worden bepaald na verloop van tijd met behulp van ROI dat spoor beweging van de vaatwanden. B. Wanneer het contrast drempel is ingesteld op het gehele vaartuig omvatten, kan de buitendiameter worden gevolgd met een ROI. Inwendige diameter kan worden geschat op basis van deze metingen door te corrigeren voor de wanddikte. C. Een andere optie is om bij het gebied omsloten door het schip, die kan om het volume te berekenen worden gebruikt door te corrigeren voor wanddikte enervan uitgaande dat de lymfatische heeft cilindrische geometrie.

Figuur 4. Verband tussen [Ca ^{2 +]} _i en lymfestelsel diameter. A. Vertegenwoordiger van beelden van een time-lapse video van Fura-2-intensiteit (warmte-kaart formaat) in een afgelegen lymfatische. De pijlen in elk beeld een overzicht van de buitendiameter van het vat. Afbeelding 1 toont de lymfatische tijdens de diastole, met relatief lage [Ca ^{2 +]} _i. In afbeelding 2, de intensiteit van de 340/380 verhouding tussen stijgingen in de vaatwanden, net voor de fasische krimp die optreedt in afbeeldingen 3-5. Door afbeelding 4, heeft de Ca ^{2 +} van voorbijgaande aard eindigde, en door het imago 5, de systolische fase is beëindigd en het schip is terug te keren naar de rusttoestand. B. Een perceel van [Ca ^{2 +]} _i en lymfestelsel luminale diameter toont aan dat een tijdelijke toename van [Ca ^{2 +]} _i komt net vóór elkefasisch krimp.

Figuur 5. Veranderingen in lymfatische [Ca ^{2 +]} _i en de lymfatische contractiele cyclus in reactie op de verhoging van de druk stap. De druk stap protocollen (A), 340/380 verhouding van gegevens, die [Ca ^{2 +]} _i (B), en veranderingen in de lymfatische diameter over de tijd (C) worden weergegeven. A. Baseline luminale druk was 2 cm H ₂ O en het lymfevat werd onderworpen aan toe van +2, +4, +6, +8 stap, en +10 cm H ₂ O. Het tijdsinterval tussen elke druk step recording was 1-2 min.. Elke stap druk veroorzaakt een toename van zowel de frequentie van de tijdelijke toename van [Ca ^{2 +]} _i (B) en fasische contracties (C). Lymfatische diameter van eveneens toe bij elke stap verhoging van de luminale druk, en voor de 4 tot 10 cm H ₂ O druk stappen, was er een aanvankelijke afname in de EDD, dat zich after EDD1 (C), die eerder beschreven als lymfatische myogene vernauwing. Er was ook een gestage toename in de basale [Ca ^{2 +]} _i tussen de transiënten onmiddellijk na elke stap verhoging van de druk (B). De myogene vernauwing was meer uitgesproken bij de grotere druk van stappen, maar de stijging van de basale [Ca ^{2 +]} _i was ongeveer gelijk voor de 4 tot 10 cm H ₂ O druk stappen (B). Een eerder gemeld compensatoire toename van de AMP was ook duidelijk na de druk stappen van 6 tot 10 cm H ₂ O (C).

Figuur 6. Lymfatische myogene vernauwing en de geleidelijke toename van de vrije [Ca ^{2 +]} _i tijdens de diastole, kort na stap toename van de druk. A. De gemiddelde EDD tussen 30-50 en na de _EDD-1 wordt gebruikt om de verandering in de genormaliseerde EDD voor elke stap de druk te berekenen. B. De intensiteit van de 340/380 verhouding 30-50 en na de _EDD-1 werd gedeeld door de gemiddelde verhouding tussen 340/380 tijdens de baseline (2 cm H ₂ O). * P <0,05 versus de +2 cm H ₂ O druk stap. N = 4 vaartuigen bestudeerd.

Film 1. Voorbeeld van een fasische contracties in een geïsoleerde lymfatische vaartuig dat wordt gebruikt voor studie. De luminale druk werd vastgesteld op 2 cm H ₂ O. De verstreken tijd en een schaal bar worden getoond aan de onderkant. De time-lapse beelden werden verzameld met een 10X objectief met behulp van doorvallend licht. Klik hier om de film te bekijken.

Movie 2. Ratiometrische Fura-2 beeldvorming in een pompende geïsoleerde lymfatische. Een warmte-schaal van de kaart wordt weergegeven in de linkerbovenhoek en de verstreken tijd en de schaal bar worden weergegeven aan de onderkant. De druk was in eerste instantie vastgesteld op 2 cm H ₂ O en werd verhoogd tot 8 cm H ₂ O vanaf 0,5 min en TERUGKEERd tot en met 2 cm H ₂ O op 1,5 min. Klik hier om de film te bekijken.

Discussion

Een nieuwe combinatie van methoden is gebruikt om intrinsieke pompen van lymfevaten te bestuderen. De mogelijkheid om gelijktijdig meten van veranderingen in [Ca ^{2 +]} _i en diameter in pompen lymfevaten zal zorgen voor studies van de relatieve bijdrage van Ca ^{2 +-afhankelijke} en Ca ^{2 +-sensibiliserend} signaal transductie in de algemene regeling met betrekking tot de lymfatische contractiele cyclus.

De lymfatische contractiele cyclus bestaat uit fasische contracties over elkaar heen toon. De gegevens tonen aan dat elk fasisch contractie gaat gepaard met een tijdelijke stijging in [Ca ^{2 +]} _i, suggereert een centrale rol van Ca ^{2 +} in de pacemaking mechanisme, en dat de frequentie van Ca ^{2 +} transients is gevoelig voor veranderingen in luminale druk . Onze gegevens tonen ook aan dat een snelle stijging van de druk kan een gestage stijging van de basale uitlokken [Ca ^{2 +]} _i tussen de transiënten. Deze stijging kan bijdragen aande myogene vernauwing die is waargenomen in het verzamelen van lymfevaten volgende stap toename van de luminale druk. Echter, we zagen een plateau van de stijging in deze basale [Ca ^{2 +]} _i met de druk stappen, variërend 6-10 cm H ₂ O, dat had verschillende gradaties van myogene vernauwing. Deze gegevens suggereren dat een ander mechanisme, eventueel een Ca ^{2 +-sensibiliserend} mechanisme, ook betrokken is bij de myogene respons op druk.

Een aanname met deze studies is dat de meerderheid van de gemeten Ca ^{2 +} is opgenomen in glad spierweefsel. Echter, Ca ^{2 +} in endotheliale cellen en andere celtypen die aanwezig kunnen zijn in de lymfevaten ook bijdragen aan de algemeen waargenomen [Ca ^{2 +]} _i, dus de gemeten waarden zijn waarschijnlijk een overschatting van de gladde spieren [Ca ^{2 +]} _i in lymfevaten. Elke Ca ^{2 +} gemeten vanaf het endotheel wordt niet verwacht om direct bij te dragenop gladde spiercontractie op basis van eerdere studies in arteriolen ^16. Dit probleem zal worden aangepakt in de toekomst experimenten die de lymfevaten worden ontdaan van endotheel.

Bij het ​​gebruik van ratiometrische kleurstoffen te beoordelen [Ca ^{2 +]} _i in cellen of weefsels, beweging van het monster kan leiden tot artefacten. Het minimaliseren van bewegingsartefacten in aanbestedende lymfevaten, gebruikten we een ROI dat zoveel van het schip mogelijk naar 340/380 ratio's te bepalen omvat. We hebben ook enige onderzoek schepen die scherp blijven tijdens hun contractiele cyclus. Vanwege mogelijke artefacten die kunnen voortvloeien uit scheepsbewegingen, in plaats van bepalen van de absolute [Ca ^{2 +]} _i op een bepaalde site, we het gemiddelde te verkrijgen voor een groot deel van het schip. Wij richten ons op de relatieve veranderingen in de gemiddelde [Ca ^{2 +]} _i over de tijd en hoe deze veranderingen verband houden met fasische en tonische contractie van de schepen.

Kort samengevat, verslechrmination van veranderingen in [Ca ^{2 +]} _i door ratiometrische beeldvorming in geïsoleerde verzamelen van lymfevaten is een krachtig hulpmiddel om het ontcijferen van de Ca ^{2 +-afhankelijke} en Ca ^{2 +-sensibiliserende} mechanismen die ten grondslag liggen aan het lymfestelsel contractiele cyclus. Met deze methode, zullen de toekomstige studies gebruik te maken van selectieve agonisten of inhibitoren van diverse signaaltransductiewegen ook helpen onderscheiden van de unieke moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen fasisch versus tonische contractie in lymfatische gladde spieren.