מדידה של Cytosolic Ca ^{2 +} ב lymphatics כויץ מבודד

Summary

אנחנו מציגים גישה להעריך את Ca cytosolic

Abstract

כלי הלימפה מהווים מערכת תחבורה רב תכליתיים המקיימת הומאוסטזיס נוזל, שומנים מספקת כדי זרימת המרכזית, ופועל כמערכת מעקב עבור אנטיגנים מזיקים, אופטימיזציה חסינות הרירית ונרכשת ^1. לימפה נוצר מן נוזל interstitial שנכנס עיוורת הסתיימה lymphatics הראשוני, ולאחר מכן מועבר כנגד מפל הלחץ lymphatics איסוף גדול יותר. לימפטי כל איסוף מורכב מסדרה של קטעים בשם lymphangions, מופרדים על ידי שסתומים המונעים backflow הטוחנת. Lymphangion כל בעל מחזור התכווצות המניע הלימפה נגד הפרש לחצים לקראת מחזור המרכזי ^2. דפוס זה התכווצות phasic משול מחזור הלב, עם סיסטולי ודיאסטולי שלבים, ועם ⁴ בתדר נמוך התכווצות. בנוסף, שריר חלק הלימפה יוצרת צליל ומציג התכווצות התרחבות myogenic ואניn בתגובה עליות וירידות בלחץ luminal, בהתאמה ^5. היברידית של המנגנונים המולקולריים התומכות הן contractility phasic טוניק של lymphatics מוצעים כך.

התכווצות של שריר חלק מוסדר בדרך כלל על ידי cytosolic Ca ^{2 +} ריכוז ([Ca ^{2 +]} _i) בתוספת רגישות Ca ^{2 +,} האלמנטים כויץ בתגובה לשינויים בסביבה המקיפה את תא ^6. [Ca ^{2 +]} _i נקבעת על ידי שילוב של תנועת Ca ^{2 +} דרך הממברנה הפלסמטית ליגנד או מתח מגודרת Ca ^{2 +} ערוצים שחרור ספיגת של Ca ^{2 +} מחנויות פנימי. Cytosolic Ca ^{2 +} נקשר calmodulin ומפעיל אנזימים כגון שרשרת אור שרירן (MLC) קינאז (MLCK), אשר בתורו phosphorylates MLC המוביל להתכווצות אקטין שרירן בתיווך ^8. עם זאת, הרגישות של מסלול זה Ca 9. פעילות MLCP מוסדר על ידי Rho קינאז (רוק) לבין מעכב phosphatase שרירן חלבון למדד 17.

כאן, אנו מציגים שיטה להערכת שינויים [Ca ^{2 +]} _i לאורך זמן, lymphatics מבודד perfused כדי ללמוד Ca ^{2 +} תלויות Ca ^{2 +} ו-רגישות מנגנוני התכווצות שריר חלק הלימפה. שימוש מבודד mesenteric עכברוש lymphatics איסוף למדנו למתוח-Induced שינויים [Ca ^{2 +]} _i ו התכווצות בפעילות. המודל הלימפה מבודד מציע את היתרון הזה, הלחץ הזרימה, את ההרכב הכימי של הפתרון אמבטיה ניתן לשלוט בחוזקה. [Ca ^{2 +]} _i נקבע על ידי טעינת lymphatics עם ratiometric, Ca ^{2 +} מחייב לצבוע Fura-2. מחקרים אלה יספקו גישה חדשה לבעיה רחבה יותר של חקר המנגנונים המולקולריים שונים המווסתים phasicהתכווצויות לעומת התכווצות בשריר טוניק הלימפה חלקה.

Protocol

1. בעלי חיים

1. כל הנהלים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש ב מדינת לואיזיאנה האוניברסיטה למדעי הבריאות מרכז בוצעו בהתאם להנחיות של המכון הלאומי לבריאות (NIH פרסום מס '85-12, מתוקנת 1996). זכר Sprague-Dawley חולדות (Charles River Laboratories, 270-350 גרם גוף wt) שוכנו בטמפרטורה מבוקרת (22 ° C) ואת התאורה בסביבה מבוקרת (0:12 h מחזור אור כהה). לאחר ההגעה, החולדות הוגשו לתקופה של שבוע הסתגלות וכן נמסרו עכברוש האוכל סטנדרטית (2018 Teklad מכרסמים גלובל 18% חלבון דיאטה, הרלן) ו כרצונך מים.

2. ניסוי הגדרת

1. Micropipettes זכוכית עבור lymphatics הרכבה עשויים זכוכית בורוסיליקט עם נימה OD 1.2 מ"מ, מזהה 0.69mm (סאטר כלי BF 120-69-15). משוך את pipettes באמצעות Flaming / בראון micropipette פולר דגם P-97 (סאטר Instrument) והם שפוע עם מטחנת מיקרו EG 400 (Narishige) לקבל טיפ משופעים בקוטר ~ 60 מיקרומטר חיצונית.
2. הר micropipettes בתא כלי מבודדים (דגם CH-1, מערכות החיים, Burlington, VT). Pipettes צריכה להיות התנגדות מתאימים (הפתיחה באותו גודל).
3. ממלאים את החדר (5 מ"ל) ו micropipettes עם פתרון אלבומין, מלח פיזיולוגית (APSS, ראה טבלה 1). ודא שאין בועות micropipettes או צינורות.
4. הכן את הבוהן קשרים עם התפרים עיניים מקום אחד על כל micropipette.

3. איסוף בידוד הלימפה

1. להרדים את החיות עם זריקה תוך שרירית של קטמין / xylazine (90 ו -9 מ"ג / ק"ג, בהתאמה), באמצעות מזרק BD (1 מ"ל) ואת המחט (שיפוע BD intradermal 26G3 / 8).
2. ריסוס באזור הבטן עם אלכוהול 70% לעקר, לבצע laparotomy קו האמצע, ואת exteriorize ובלו במעי mesentery קטנים. מניחים את הרקמה ICדואר קר APSS. להרדים את החיות עם מנת יתר של קטאמין / xylazine ולאשר למוות על ידי פתיחת החזה (לפי הנחיות האמריקאי לרפואה וטרינרית האגודה על המתת חסד).
3. פין קטע mesentery בתא לנתיחה מלאה קר כקרח APSS. בזהירות לנתח כלי הלימפה איסוף (8-20 מיקרומטר קוטר פנימי של 1-2 מ"מ אורך) מ לרקמות השומן ואת החיבור בעזרת stereomicroscope. השתמש לנתח דומון מלקחיים-Inox 55 (כלי מדעי פיין # 11255-20) ו לנתח מספריים באביב (כלים המדע פיין # 15000-03). השתמש בכלי מבודד עם שסתום אחד בלבד כדי להבטיח שליטה בלחץ האופטימלי במגזר כולו במהלך הניסוי.
4. העברת הלימפה מבודד לחדר כלי מבודד המכיל 5 מ"ל של APSS. הר על גבי שני כלי התנגדות בהתאמה micropipettes זכוכית ידי קשירת עם התפרים עיניים.
5. מעבירים את תא אל מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה (שלנו הוא ניק על TE-2000U) מצויד מנורת קסנון (סאטר מכשירים Lambda LS2 300 W), 340/380 מערכת ההגה מסנן (סאטר Lambda 10-3 עם טכנולוגיה Chroma 340 ו - 380 עירור מסננים ננומטר), 510 ננומטר פולט dichroic (D510 טכנולוגיה Chroma / 80m), מצלמת CCD רגיש (Photometrics HQ ^2), תוכנה לרכישת (ניקון אלמנטים AR) (איור 1).
6. צרף את צינורות שמקורם micropipettes או אל מאגרי מתכווננת או מערכת סרוו משוב המשאבה (מערכות החיים מכשור, Burlington VT), הן אשר ניתן להשתמש בהם כדי לשנות את הלחץ ואת זרימת.
7. חבר את תא ליחידת חימום (מערכות חיים) ולהגדיר את האמבט עד 37 ° C.
8. צפה הלימפה ישירות דרך coverslip בבסיס של החדר במטרה 10X (ניקון תוכנית פלואוריד 10x/0.3, DIC L/N1, ∞ / 0.17, WD 16.0). ראפיד זמן לשגות קובע התמונה ניתן לרכוש באמצעות רכישת התמונה תוכנה (שהמערכת שלנו Nikon תוכנה אלמנטים AR).

"Jove_title"> 4. מדידה של Ratiometric [Ca ^{2 +]} _i

1. [Ca ^{2 +]} i בשריר הלימפה מבודדים חלקה נמדדת על ידי Ca ^{2 +} חישה לצבוע Fura 2-acetoxymethyl אסתר (AM) (בדיקות מולקולריות, יוג'ין, OR).
2. טען את כלי הלימפה עם Fura, 02:00 על ידי החלפת אמבטיה כדי APSS תמיסה המכילה Fura, 02:00 (2 מיקרומטר) וחומצה pluronic (0.2% wt / כרך) במשך 30 דקות ב 37 ° C.
3. אחרי 30 דקות לשנות את האמבטיה בחזרה APSS פתרון. לשטוף 2 פעמים כדי לשטוף את Fura-2 מפתרון אמבטיה. השאר את כלי בפעם איזון של לפחות 20 דקות לפני [Ca ^{2 +]} _i מדידות כדי לאפשר מחדש את הקמתה של התכווצויות ספונטניות.
4. איסוף ratiometric Fura-2 מדידות lymphatics מבודד עם פרוטוקול הרכישה כי לחילופין מאיר ב 340 ו 380 אורכי גל nm לתקופות של 50 מילישניות לכל. אור ניאון עובר דרך מראה dichroic (400 ננומטר, Chroma טהchnology קורפ 400DCLP) והלהקה רחב פליטה פילטר (510 ננומטר, 80 ננומטר רוחב פס, Chroma טכנולוגיה קורפ D510/80m) והיא נרכשה על ידי המצלמה HQ ² Photometrics. אנו אוספים נתונים של 2 דקות בלחץ הבסיסי intraluminal של 2 ס"מ H ₂ O ובמהלך מגביר צעד של 2, 4, 6, 8, ו - 10 ס"מ H ₂ O.
5. כדי לנתח את הממוצע [Ca ^{2 +]} _i, צייר באזור של עניין (ROI), הכוללת את כלי הלימפה כולה וסביבתה, כך הוא כלי מעקב מלא בזמן הרפיה והתכווצות (איור 2). אם micropipette גם היא בתחום של נוף באזורים אלה לא צריכים להיות כלולים ההחזר על ההשקעה. ROIs קטן יכול להיות גם נבחר, עם זאת בעיה פוטנציאלית עם ROIs קטנה היא כלי קירות עשויים לנוע מעט לכיוון האורך מתוך ROI ככלי מכווץ ומשחרר. בעיה נוספת היא כי פוטנציאל כלי קצת טוויסט במהלך התכווצות, ואלה lymphatics לא אמור לשמש למחקר. ה 'תנועות פיתול דואר נמנעים בדרך כלל על ידי הגבלת אורך הלימפה המבודד מ"מ 1 <. בנוסף, לפעמים קטעים משני צדי שסתום לא להצר / להירגע בתיאום. במקרה זה, כי קטעים אלה מייצגים lymphangions פונקציונליים נפרדים, הלימפה אמור להיחקר על צד אחד בלבד של השסתום, או כל lymphangion ניתן ללמוד בנפרד עם ROI דגש על הצדדים. בעת שימוש מטרה 10X, קירות כלי צריכים להישאר בפוקוס במהלך הצירים phasic, אולם אם ישנם חלקים של הקירות לצאת להתמקד במהלך הצירים באזורים אלה לא צריכים להיות כלולים ההחזר על ההשקעה. ההחזר על ההשקעה רקע משמש גם צריך להיות ממוקם רחוק מן הכלי (למשל בפינה של התמונה). הגדלת יחס 340/380 מציין עלייה [Ca ^{2 +]} _אני. קוטר לומינל בנקודות זמן שונות ניתן למדוד באמצעות פונקציית מידה של תוכנה או על ידי מעקב על הקירות כלי לאורך זמן (ראה סעיף 6). </ Li>

5. לשלוט בלחץ פרוטוקול

1. כדי ללמוד הלחץ עצמאית של זרימת שהוטל, הלחץ זהה חייב להיות מיושם על ידי כל micropipette משאבת סרוו ריק משוב. צינורות מ micropipette כל מחובר דרך מחבר-T כדי בצינור משותף רכוב על המשאבה. בתחילה להגדיר את הלחץ intraluminal ב 2 ס"מ H ₂ O דקות 45-60., וזה מספיק זמן כדי לאפשר התפתחות של התכווצויות הלימפה ספונטנית.
2. לצורך המחקר השתמש בכלי רק העונים על הקריטריונים הבאים בתוך תקופת איזון: (1) כלי מתפתח צליל ספונטני ב 2 ס"מ H ₂ O, (2) כלי מפתח רגיל, התכווצויות ספונטניות כי הם אחיד למדי על פני אורך של כלי השיט . לעתים קרובות מן הזרם באזור שסתום מגביל יותר מאשר שאר כלי השיט, ואלה ישמשו כלי כל עוד יש ראיות לכך את שארית הכלי מציג התכווצות בפעילות.
3. שיא המהיר זמן לשגות תמונות במהלך ההליך צעד הלחץ. עבור כל אחד, הלחץ יתחיל בשעה 2 ס"מ H ₂ O למשך 30 שניות, ואז הוא העלה בשלב של 2, 4, 6, 8 או 10 ס"מ H ₂ O למשך דקה אחת, והוריד בחזרה עד 2 ס"מ H ₂ O עבור 30 s.
4. לאחר השלמת סדרת צעד הלחץ, לשנות את הפתרון אמבטיה ל Ca ^{2 +} ללא APSS ב 37 ° C כדי למדוד את קוטר מרבי פסיבי (מקס D) Ca ^{2 +-מדידות} הקרינה בכל אחד הלחצים luminal לעיל. D מקס משמשת לחישוב הטון לנרמל את הנתונים בין lymphatics בגדלים שונים.

6. הלימפה פרמטרים כויץ

1. שינויים בקוטר כלי שיט לאורך זמן ניתן לקבוע באמצעות כלי מעקב אובייקט ברוב ניתוח חבילות תוכנה תמונה. זו יכולה להיות מושגת רק באמצעות אחד הערוצים (אנו משתמשים בערוץ 340 ננומטר אבל ערוץ 380 יכול לשמש גם). סף הניגוד הוא appשיקר מחסנית את התמונה כך דפנות כלי מודגשים, ולאחר מכן ROIs המקיף כל הקיר נמשכים לעקוב אחריהן לאורך זמן (איור 3). קוטר פנימי ניתן לקבוע על ידי מדידת centroid של כל קיר חישוב המרחק בין שתי centroids, מינוס חצי עובי של קיר אחד.
   האפשרות השנייה, כאשר קשה לעקוב אחר כל הקיר עקב אות חזק באזור luminal היא למדוד קוטר חיצוני, ולהשתמש גורם התיקון מבוסס על מדידה סטטית של קירות כלי להשיג בקוטר פנימי. במקרה זה, ההחזר על ההשקעה משתרע על פני כלי השיט כולו הקוטר החיצוני הוא במעקב (איור 3 ב). שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לקבוע את האזור כולו לצפייה חתך רוחב של הלימפה (איור 3 ג). בגלל הצורה האופיינית lymphangion, אפשרות זו האחרונה יכולה לספק אומדן טוב יותר של נפח בפועל של נוזל שאוב עם כל התכווצות מאשר שימוש בקוטר בחלק נבחרשל כלי השיט.
2. מהמחקר זמן לשגות לקבוע את הפרמטרים הבאים של luminal הלימפה מדידות קוטר ^4,12,13:
   התכווצות תדר (CF), נקבע על ידי ספירת מספר הצירים phasic לדקה.
   קצה בקוטר הדיאסטולי (EDD), אשר הקוטר קצר לפני התכווצות phasic.
   סיסטולי סוף קוטר (ESD), הקוטר בסוף התכווצות phasic.
   Amplitude של התכווצות (AMP = EDD-ESD), מדד מפושטת של נפח שבץ.
   קוטר מרבי פסיבי בלחץ כל (מקס D; נקבע Ca ^{2 +} ללא תנאים), אשר ניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את הטון הנוצר על ידי שרירים הלימפה חלקה, והוא משמש גם לנרמל את הנתונים בין lymphatics בקוטר שונה, או הלימפה אותו למד בבית luminal לחצים שונים.
   EDD _1, המהווה את EDD הקשורים ההתכווצות הראשונה לאחר צעד הלחץ. זה משמש כנקודת התחלה כאשרקביעת myogenic התכווצות של כלי הלימפה בתגובה לעלייה בלחץ צעד luminal ^5.
   התכווצות Myogenic של הלימפה מבודד אחר צעד לחץ מיוצג על ידי שינוי מנורמל ב EDD לאחר עלייה בלחץ צעד = 100 * (EDD - EDD ₁₎ / D מקס.
   משתנים נוספים שיכולים להיות מחושב אבל הם דנו במקומות אחרים פרט ⁴ הם:
   טון = 100 * (מקס D - EDD) / מקס D, AMP מנורמל = AMP / מקס D
   נפח מדד שבץ (SVI) = π (EDD ² - ESD ²⁾
   שבריר פליטה (EF) = SVI / (πEDD2)
   תזרים נפח אינדקס (VFI) CF = x SVI.

7. נציג תוצאות:

בתחילת כל ציר phasic, חלה עלייה חולפות [Ca ^{2 +]} _i (איור 4). בנוסף, לאחר עליות צעד בלחץ luminal, התדירות של Ca ^{2 +} הארעיים ו-pהתכווצויות hasic גדל בתיאום. תצפיות אלה דומים מציאת הקודם באמצעות צינוריות החזי רכוב על myograph חוט ¹⁴ ותמיכה נתונים קודמים מצביעים על תפקיד מרכזי oscillatory Ca ^{2 +} שחרור מחנויות פנימי במנגנון שבבסיס מחזור התכווצות phasic ^15.

חקרנו גם אם [Ca ^{2 +]} _i במהלך דיאסטולה (בין Ca ^{2 +} הארעיים ואת ההתכווצויות phasic) קשורה הטון הלימפה נגרמת על ידי התכווצות myogenic למתוח כאשר עולה מדרגה בלחץ מוטלות (איור 5). מיד לאחר עליית מדרגה בלחץ של 4 ס"מ H ₂ O גבוהה יותר, [Ca ^{2 +]} _i במהלך דיאסטולה גדל בהתמדה, לעומת הבסיס לקראת שלב הלחץ (איור 5 ב). בנוסף, לאחר הגידול הראשוני בקוטר בשל עליית מדרגה בלחץ (EDD _1), היתה מועקה myogenic (איוריור 5C), כמוגדר ירידה EDD מ EDD ₁ בדוחות קודמים ^5,12. כאשר משווים את השינוי מנורמל מתכוון EDD בין הצעדים הלחץ שונה, לא היה התכווצות משמעותית יותר לאחר עליות של 8 ו - 10 ס"מ H ₂ O, לעומת 2 ס"מ H ₂ O (איור 6). עלייה מתמדת [Ca ^{2 +]} _הייתי קשור גם ללחץ, עם עליות של צעד 6, 8, ו - 10 ס"מ H ₂ O גרימת שינויים גבוה משמעותית Ca ^{2 +} מ 2 ס"מ H ₂ O ( איור 6 ב). עם זאת, הלחץ צעד Ca ^{2 +} הקשר נראה רמה ב הלחצים הללו גם כן. תוצאות אלו מצביעות כי ² Ca ⁺ תלויי מנגנון קשורה התכווצות הלימפה myogenic בתגובה מתיחה. עם זאת, הרמה בלחץ הצעד-Ca ^{2 +} יחסים מציע מנגנון שמגביר את הרגישות Ca ^{2 +} עשוי גם לתרום גדל myogenic constriction בכל הצעדים לחץ גבוה יותר.

באיור 1. סכמטי של מערכת מיקרוסקופ המשמש למדידת [Ca ^{2 +]} _i ב הלימפה מבודד. החדר הלימפה מבודד מושם על השלב של המיקרוסקופ הפוכה. הדגימה מואר לחילופין ב 340 ו 380 ננומטר, ואת האות ניאון הנפלטת הלימפה נאסף עם מצלמת CCD ומאוחסנים במחשב האישי. הלחץ של intraluminal הלימפה הוא נשלט על ידי מערכת סרוו-null משוב. המשתמש מגדיר את הלחץ על המערכת, ואת מתמרים הלחץ קו עם הלימפה ממסר הלחץ intraluminal למערכת משוב, אשר יכול להעלות באופן דינמי או בלחץ נמוך באמצעות משאבה.

באיור 2. דוגמה של אזור עניין (ROאני) הבחירה Fura-2 בדיקות הדמיה ratiometric בכלי הלימפה מבודדים. האזור שנבחר כוללת את רוב כלי השיט (למעט אזורים נגיעה micropipettes) וסביבתה על מנת להבטיח את כלי תעקוב קורס כל הזמן. ההחזר על ההשקעה הרקע (פינה הימנית העליונה) משמש גם כדי לחסל אות ספציפי מהאמבטיה שמסביב.

באיור 3. שיטות הלימפה מעקב שאיבה. קוטר פנימי A. ניתן לקבוע לאורך זמן באמצעות ROIs כי מסלול התנועה של קירות כלי שיט. B. כאשר סף בניגוד מוגדר כוללים את כלי שלם, בקוטר החיצוני ניתן לעקוב אחר ההחזר על ההשקעה עם אחד. קוטר פנימי ניתן להעריך ממדידות אלו על ידי תיקון עבור עובי הקיר. ג. אפשרות נוספת היא לעקוב אחר האזור מוקף כלי השיט, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחשב נפח על ידי תיקון עבור עובי הקירבהנחה הלימפה בעל גאומטריה גלילית.

איור 4. הקשר בין [Ca ^{2 +]} _i ו בקוטר הלימפה.. תמונות נציגת וידאו זמן לשגות של עוצמת Fura-2 (המפה בפורמט חום) הלימפה בבית מבודד. החצים כל תמונה המתאר את הקוטר החיצוני של הספינה. תמונה 1 מראה הלימפה במהלך דיאסטולה, עם נמוך יחסית [Ca ^{2 +]} _אני. בתמונה 2, האינטנסיביות של 340/380 עולה יחס בדפנות כלי שיט, בדיוק לפני התכווצות phasic המתרחשת תמונות 3-5. לפי התמונה 4, Ca ^{2 +} חולף הסתיימה, ועל ידי תמונה 5, השלב הסיסטולי הסתיימה הספינה חוזרת למצב המנוחה שלו. B. העלילה של [Ca ^{2 +]} _i ו בקוטר הלימפה luminal מראה כי עלייה חולפות [Ca ^{2 +]} _i מתרחשת רק לפני זהphasic התכווצות.

איור 5. שינויים הלימפה [Ca ^{2 +]} _i ואת מחזור הלימפה כויץ בתגובה הצעד מגביר את הלחץ. צעד הלחץ פרוטוקולים (A), 340/380 נתוני יחס, המייצג [Ca ^{2 +]} _i (B), ואת השינויים בקוטר הלימפה לאורך זמן (ג) מוצגים. א הלחץ Baseline luminal היה 2 ס"מ H ₂ O ואת כלי הלימפה היה נתון צעד עליות של 2, 4, 6, 8, ו - 10 ס"מ H ₂ O. מרווח הזמן בין כל צעד הקלטה הלחץ היה 1-2 דקות. כל שלב הלחץ גרמה לעלייה בשכיחות שניהם עלייה זמנית [Ca ^{2 +]} _i (B) התכווצויות phasic (C). קוטר הלימפה גדל גם עם עלייה בלחץ כל צעד לומינל, ובמשך 4-10 ס"מ H ₂ O צעדים בלחץ, חלה ירידה ראשונית EDD שהתרחש after EDD1 (ג), תיאר בעבר התכווצות הלימפה myogenic. היתה גם עלייה מתמדת הבסיס [Ca ^{2 +]} _i בין הארעיים מיד לאחר להגדיל כל צעד בלחץ (B). התכווצות myogenic היתה בולטת יותר עם ​​הצעדים הלחץ גדול יותר, אולם העלייה הבסיס [Ca ^{2 +]} _הייתי בערך את אותו הדבר עבור 4-10 ס"מ H ₂ O צעדים הלחץ (B). להגדיל את הפיצוי שדווח בעבר ב AMP היה ניכר גם לאחר הצעדים הלחץ של 6-10 ס"מ H ₂ O (C).

איור 6. מועקה הלימפה myogenic והעלייה ההדרגתית חינם [Ca ^{2 +]} _i במהלך דיאסטולה, זמן קצר לאחר עליית מדרגה בלחץ.. בממוצע בין 30-50 EDD s אחרי ₁ EDD משמש לחישוב השינוי EDD מנורמל עבור כל שלב הלחץ. B. העוצמה של היחס של 340/380 30-50 אחרי ₁ EDD חולקה על ידי היחס 340/380 בממוצע במהלך המחקר (2 ס"מ H ₂ O). * P <0.05 לעומת הצעד 2 ס"מ H ₂ O הלחץ. N = 4 כלי למד.

סרט 1. דוגמה התכווצויות phasic בכלי הלימפה מבודד המשמש למחקר. הלחץ luminal נקבע על 2 ס"מ H ₂ O. הזמן שחלף ובר בהיקף מוצגים בתחתית. זמן לשגות תמונות שנאספו עם מטרה 10X באמצעות האור המועבר. לחץ כאן כדי לראות את הסרט.

2. סרט Ratiometric Fura-2 הדמיה הלימפה מבודד שאיבה. מפה בקנה מידה חום מוצג בפינה השמאלית העליונה ואת הזמן שחלף בר סולם מוצגים בתחתית. הלחץ נקבע בתחילה 2 ס"מ H ₂ O ו - הועלתה 8 ס"מ H ₂ O מתחיל ב 0.5 דקות ו returneד עד 2 ס"מ H ₂ O ב 1.5 דקות. לחץ כאן כדי לראות את הסרט.

Discussion

שילוב הרומן של שיטות הועסק ללמוד מהותי שאיבה של כלי הלימפה. היכולת למדוד בו זמנית שינויים [Ca ^{2 +]} _i ו בקוטר lymphatics שאיבה יאפשר מחקרים על התרומה היחסית של Ca ^{2 +} תלויות Ca ^{2 +} ו-רגישות מסלולי איתות במנגנון הכולל המסדירים את מחזור הלימפה התכווצות.

מחזור הלימפה כויץ מורכב התכווצויות phasic מעל גבי בטון. הנתונים מראים כי כל התכווצות phasic קשורה לעלייה חולפות [Ca ^{2 +]} _אני, מה שמרמז על תפקיד מרכזי של Ca ^{2 +} במנגנון pacemaking, וכי התדירות של Ca ^{2 +} הארעיים רגיש לשינויים בלחץ luminal . הנתונים שלנו מראים גם כי גידול מהיר בלחץ יכולה לעורר עלייה מתמדת הבסיס [Ca ^{2 +]} _i בין הארעיים. עלייה זו עשויה לתרוםהתכווצות myogenic כי הוא ציין באיסוף lymphatics לאחר עליות צעד בלחץ luminal. עם זאת, ראינו רמה של עליות זה הבסיס [Ca ^{2 +]} _i בצעדים הלחץ החל 6-10 ס"מ H ₂ O, אשר היו בדרגות שונות של התכווצות myogenic. נתונים אלו עולה כי מנגנון אחר, אולי Ca ^{2 +,} מנגנון רגישות, מעורב גם התגובה myogenic ללחץ.

הנחה אחת עם מחקרים אלה היא כי רוב נמדד ^{+ 2} Ca הכלול שריר חלק. עם זאת, Ca ^{2 +} בתאי האנדותל סוגי תאים אחרים שעשויים להיות נוכח lymphatics גם לתרום הנצפה הכוללת [Ca ^{2 +]} _i, ולכן הערכים שנמדדו הם כנראה להעריך של שרירים חלקים [Ca ^{2 +]} _i ב lymphatics. ² כל Ca ⁺ נמדד האנדותל לא צפוי לתרום ישירותלהחליק התכווצות שרירים בהתבסס על מחקרים קודמים arterioles ^16. בעיה זו יטופלו בניסויים עתידיים שבו lymphatics הן נטולות האנדותל.

כאשר משתמשים בצבעים ratiometric להעריך [Ca ^{2 +]} _i בתאים או ברקמות, תנועה של הדגימה יכול לגרום חפצים. כדי למזער את החפצים התנועה קבלנות lymphatics, השתמשנו ההחזר על ההשקעה הכוללת כמה שיותר כלי ככל האפשר כדי לקבוע 340/380 יחסי. אנחנו גם רק כלי מחקר זה להישאר בפוקוס במהלך מחזור התכווצות שלהם. בגלל ממצאים הפוטנציאלי שעלול לנבוע תנועת כלי השיט, במקום לקבוע המוחלט [Ca ^{2 +]} _אני באתר מסוים, נקבל את הממוצע עבור שטח גדול של כלי השיט. אנו מתמקדים בשינויים יחסית לממוצע [Ca ^{2 +]} _i לאורך זמן וכיצד שינויים אלה מתייחסים התכווצות phasic טוניק הכלים.

ב dete לסיכום,rmination של שינויים [Ca ^{2 +]} _i על ידי הדמיה ratiometric ב lymphatics איסוף מבודדים מהווה כלי רב עוצמה כדי לפענח את Ca ^{2 +} תלויות Ca ^{2 +} ו-רגישות המנגנונים מחזור הלימפה התכווצות. באמצעות שיטה זו, מחקרים עתידיים ניצול אגוניסטים סלקטיביים מעכבי או התמרה של המסלולים השונים האות גם יעזור לבדל את המנגנונים המולקולריים שבבסיס ייחודי התכווצות phasic לעומת טוניק בשריר הלימפה חלקה.