Misura della Ca citosolico ^{2 +} In isolati Linfatici contrattile

Summary

Vi presentiamo un approccio per valutare la Ca citosolico

Abstract

Vasi linfatici comprende un sistema multifunzionale di trasporto che mantiene l'omeostasi dei fluidi, fornisce i lipidi alla circolazione centrale, e agisce come un sistema di sorveglianza per gli antigeni potenzialmente dannosi, ottimizzando l'immunità mucosale e la risposta immunitaria adattativa ^1. La linfa è formata da liquido interstiziale che entra linfatici iniziali cieco-ended, e poi viene trasportata contro un gradiente di pressione in grandi vasi linfatici di raccolta. Ogni linfatico raccolta è costituita da una serie di segmenti chiamati lymphangions, separati da valvole bicuspide che impediscono il riflusso. Ogni lymphangion possiede un ciclo contrattile che spinge linfa contro un gradiente di pressione verso la circolazione centrale ^2. Questo modello contrattile fasica è analogo al ciclo cardiaco, con fasi sistolica e diastolica, e con un ⁴ contrazione minore frequenza. Inoltre, il muscolo liscio linfatico genera tono e visualizza la costrizione e la dilatazione miogenica in risposta ad aumenti e diminuzioni della pressione luminale, rispettivamente ^5. Un ibrido di meccanismi molecolari che supportano sia la contrattilità fasica e tonica dei vasi linfatici sono quindi proposti.

Contrazione della muscolatura liscia è generalmente regolata dal Ca ^{2 +} citosolico concentrazione ([Ca ^{2 +]} _i) più sensibilità al Ca ^{2 +,} degli elementi contrattili in risposta ai cambiamenti nell'ambiente che circonda la cellula ^6. [Ca ^{2 +]} _i è determinato dalla combinazione del movimento di Ca ^{2 +} attraverso la membrana plasmatica legante o tensione gated canali Ca ^{2 +} e il rilascio e l'assorbimento di Ca ^{2 +} dalle riserve interne. Citosolico di Ca ^{2 +} si lega alla calmodulina e attiva gli enzimi come la catena leggera della miosina (MLC) chinasi (MLCK), che a sua volta fosforila MLC porta alla actina-miosina-mediata contrazione ^8. Tuttavia, la sensibilità di questa via di Ca 9. MLCP attività è regolata da Rho chinasi (ROCK) e l'inibitore della proteina fosfatasi miosina CPI-17.

Qui vi presentiamo un metodo per valutare le variazioni [Ca ^{2 +]} _i nel tempo isolato, linfatici perfuso al fine di studiare Ca ^{2 +-dipendente} e Ca ^{2 +-sensibilizzante} meccanismi della contrazione muscolare liscia linfatico. Utilizzando isolato linfatici mesenterica di ratto raccolta abbiamo studiato tratto cambiamenti indotti in [Ca ^{2 +]} _i e l'attività contrattile. Il modello linfatico isolato offre il vantaggio che la pressione, flusso, e la composizione chimica della soluzione bagno può essere strettamente controllati. [Ca ^{2 +]} _i è stato determinato dal carico linfatico con il raziometrici, Ca ^{2 +-binding} dye Fura-2. Questi studi forniranno un nuovo approccio al problema più ampio di studiare i diversi meccanismi molecolari che regolano fasicacontrazioni tonico contro costrizione nel muscolo liscio linfatico.

Protocol

1. Animali

1. Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa alla Louisiana State University Health Sciences Center e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del National Institute of Health (NIH pubblicazione n ° 85-12, riveduta nel 1996). Maschi Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 270-350 g di peso corporeo) sono stati alloggiati in una temperatura controllata (22 ° C) e l'illuminazione controllata (12:12 h ciclo di luce scura) ambiente. Dopo l'arrivo, i ratti sono stati sottoposti ad un periodo di una settimana di acclimatazione e sono stati forniti di serie ratto chow (2018 Teklad globale del 18% Proteine ​​Dieta roditori, Harlan) e acqua ad libitum.

2. Esperimento Set-Up

1. Micropipette di vetro per linfatici montaggio sono realizzati in vetro borosilicato con filamento OD 1.2mm, ID 0,69 millimetri (Sutter Instrument BF 120-69-15). Tirare le pipette con un Flaming / Brown Micropipetta Estrattore modello P-97 (Sutter StrumENT) e sono conici con un Grinder Micro EG 400 (Narishige) per ottenere una punta smussata con un ~ 60 micron di diametro esterno.
2. Montare il micropipette nella camera vaso isolato (modello CH-1, i sistemi viventi, Burlington, VT). Le pipette devono essere abbinati resistenza (apertura stesse dimensioni).
3. Riempire la camera (5 ml) e micropipette con albumina-soluzione fisiologica salina (APSS, vedi tabella 1). Assicurarsi che non vi siano bolle nella micropipette o il tubo.
4. Preparare overhand nodi con suture oftalmiche e posto uno per ogni micropipetta.

3. Raccolta di isolamento linfatico

1. Anestetizzare gli animali con una iniezione intramuscolare di ketamina / xylazina (90 e 9 mg / kg, rispettivamente), utilizzando una siringa BD (1 ml) e ago (conici BD intradermici 26G3 / 8).
2. Spruzzare la zona dell'addome con il 70% di alcool per sterilizzare, eseguire una laparotomia mediana, ed esteriorizzare e accise piccolo intestino e mesentere. Posizionare il tessuto in ice-freddo APSS. Eutanasia degli animali con una overdose di ketamina / xylazina e confermare la morte aprendo il petto (come da linee guida American Veterinary Medical Association sull'eutanasia).
3. Pin una sezione di mesentere in una camera piena di dissezione ghiacciata APSS. Con attenzione sezionare una nave linfatico raccolta (80-200 micron diametro interno e 1-2 mm di lunghezza) da tessuto adiposo circostante e connettivo con l'ausilio di uno stereomicroscopio. Usa dissezione Dumont pinze-INOX 55 (Strumenti di scienze Belle # 11255-20) e dissezione forbici a molla (Strumenti di scienze Belle # 15000-03). Usare vasi isolati con una sola valvola per garantire un controllo ottimale della pressione nel segmento intero durante l'esperimento.
4. Trasferire il linfatico isolato alla camera di vascello isolato contenente 5 ml di APSS. Montare la nave sulle due resistenze di pari micropipette di vetro legando con le suture oftalmiche.
5. Trasferire la camera di un microscopio a fluorescenza invertito (la nostra è una Nikil TE-2000U) dotato di una lampada allo xeno (Sutter Instruments Lambda LS2 300 W), 340/380 sistema di ruota portafiltri (Sutter Lambda 10-3 con tecnologia Chroma 340 e 380 nm di eccitazione filtri), 510 nm emettitore dicroici (D510 tecnologia Chroma / 80m), un CCD sensibile fotocamera (Photometrics HQ ^2), e software per l'acquisizione (Nikon Elementi AR) (Figura 1).
6. Collegare il tubo proveniente dal micropipette sia per serbatoi regolabile o il servo-sistema di feedback pompa (Living Instrumentation Systems, Burlington VT), sia che può essere utilizzato per alterare la pressione e flusso.
7. Collegare la camera per l'unità di riscaldamento (sistemi viventi) e impostare il bagno a 37 ° C.
8. Mostra il linfatico direttamente attraverso il vetrino nella base della camera con un obiettivo 10X (Nikon Plan Fluor 10x/0.3, DIC L/N1, ∞ / 0,17, WD 16,0). Rapido time-lapse set di immagini possono essere acquisite tramite il software di acquisizione delle immagini (il nostro sistema ha Nikon Elements AR).

2 +] _i

1. [Ca ^{2 +]} i nel muscolo liscio isolato linfatico è misurato dal Ca ^{2 +-sensing} colorante Fura 2-acetossimetil estere (AM) (Molecular Probes, Eugene, OR).
2. Caricare il vaso linfatico con Fura-2 AM da scambiare il bagno di APSS soluzione contenente Fura-2 AM (2 mM) e l'acido Pluronic (0,2% peso / volume) per 30 minuti a 37 ° C.
3. Dopo 30 minuti cambia il bagno indietro APSS soluzione. Lavare 2 volte per lavare la Fura-2 dalla soluzione bagno. Lasciare la nave per un tempo di equilibrio di almeno 20 minuti prima di [Ca ^{2 +]} _i misure per consentire il ripristino delle contrazioni spontanee.
4. Raccogliere raziometrico Fura-2 misure in vasi linfatici isolati, con un protocollo di acquisizione che illumina alternativamente a 340 e 380 nm di lunghezza d'onda durata di 50 ms ciascuno. La luce fluorescente passa attraverso uno specchio dicroico (400 nm; Chroma Technology Corp. 400DCLP) e una larga banda di emissione filtro (510 nm, 80 nm, larghezza di banda; Chroma Technology Corp. D510/80m) ed è acquisito dal HQ fotometrici fotocamera da ^2. Raccogliamo 2 minuti di dati a una pressione basale intraluminale di 2 cm H ₂ O e aumenta durante la fase di +2, +4, +6, +8 e +10 cm H ₂ O.
5. Per analizzare la media [Ca ^{2 +]} _i, disegnare una regione di interesse (ROI) che include l'intero vaso linfatico e l'area circostante in modo che la nave sia pienamente monitorati durante il rilassamento e contrazione (Figura 2). Se uno dei due micropipetta è nel campo visivo queste aree non devono essere inclusi nel ROI. ROI più piccoli possono anche essere scelti, però un potenziale problema con ROI piccolo è che le pareti nave può muovere leggermente in senso longitudinale dal ROI, come la nave si contrae e si rilassa. Un altro potenziale problema è che alcuni vasi torsione durante la contrazione, e questi vasi linfatici non deve essere utilizzato per lo studio. Thmovimenti di torsione e di solito sono evitate limitando la lunghezza della linfatico isolato a <1 mm. Inoltre, a volte i segmenti su entrambi i lati di una valvola non si restringono / relax in sincronia. In questo caso, perché questi rappresentano segmenti separati lymphangions funzionale, il linfatico dovrebbe essere studiato su un solo lato della valvola, oppure ogni lymphangion possono essere studiati separatamente con un ROI posizionato su entrambi i lati. Quando si utilizza un obiettivo 10X, le pareti dei vasi deve rimanere a fuoco durante le contrazioni fasica, ma se ci sono tratti di mura che vanno fuori fuoco durante le contrazioni queste aree non devono essere inclusi nel ROI. Un ROI di fondo è utilizzato e deve essere collocato lontano dalla nave (ad esempio in un angolo dell'immagine). Un aumento del rapporto di 340/380 indica un aumento di [Ca ^{2 +]} _i. Diametro luminale in vari momenti può anche essere misurata utilizzando la funzione misura del software o con il tracciamento della pareti dei vasi nel tempo (vedi paragrafo 6). </ Li>

5. Pressione Control Protocol

1. Per studiare la pressione dipende dal flusso imposto, la stessa pressione deve essere applicato a ogni micropipetta dal servo-pompa nullo feedback. Il tubo da ogni micropipetta è collegato tramite un connettore a T per tubi comune montata sulla pompa. Inizialmente impostare la pressione endoluminale a 2 cm H ₂ O per 45-60 min., Che è il tempo sufficiente per consentire lo sviluppo delle contrazioni spontanee linfatico.
2. Per lo studio utilizzare navi solo che soddisfano i seguenti requisiti entro il periodo di equilibrio: (1) la nave si sviluppa tono spontaneo a 2 cm H ₂ O (2), la nave si sviluppa regolari, contrazioni spontanee che sono ragionevolmente uniforme su tutta la lunghezza della nave . Spesso la zona a valle da una valvola restringe più rispetto al resto della nave, e queste navi saranno utilizzate fino a quando vi è evidenza che il resto della nave mostra attività contrattile.
3. Registrare il rapido time-lapse immagini durante la procedura passo pressione. Per ciascuna, la pressione inizierà a 2 cm H ₂ O per 30 s, quindi è sollevata in un passo a +2, +4, +6, +8, o +10 cm H ₂ O per un minuto, e abbassato di nuovo a 2 cm H ₂ O per 30 s.
4. Dopo il completamento della serie di step di pressione, cambiare la soluzione ad un bagno di Ca ^{2 +} senza APSS a 37 ° C per misurare il diametro massimo passivo (Max D) e Ca ^{2 +-fluorescenza} misurazioni in ciascuna delle pressioni superiori a lume. Il D Max viene utilizzato per calcolare il tono e normalizzare i dati tra i vasi linfatici di dimensioni diverse.

6. Parametri linfatico contrattile

1. Cambiamenti nel diametro del vaso nel corso del tempo può essere determinata utilizzando strumenti di monitoraggio oggetto in gran parte dei pacchetti software di analisi delle immagini. Ciò può essere ottenuto utilizzando solo uno dei canali (si usa il canale 340 nm, ma il canale 380 potrebbe anche essere utilizzato). Una soglia di contrasto è di circamentito alla serie di immagini in modo che le pareti dei vasi vengono evidenziati, e poi ROI che comprende ogni parete sono disegnate per monitorare nel tempo (Figura 3). Il diametro interno può essere determinata misurando il baricentro di ogni parete e calcolando la distanza tra i due centroidi, meno la metà dello spessore di ciascuna parete.
   Una seconda opzione quando è difficile tenere traccia ogni parete a causa di un segnale forte nella zona del lume è quello di misurare il diametro esterno e utilizzare un fattore di correzione sulla base di una misurazione statica delle pareti dei vasi di ottenere diametro interno. In questo caso, il ROI si estende l'intero vaso ed il diametro esterno è tracciato (Figura 3 B). Questo metodo può essere utilizzato anche per determinare il tutto visualizzabile sezione trasversale del linfatico (Figura 3 C). A causa della forma tipica di una lymphangion, questa seconda opzione può fornire una stima migliore del volume effettivo del fluido pompato ad ogni contrazione rispetto all'utilizzo di diametro in una parte selezionatadella nave.
2. Dal time-lapse studio di determinare i seguenti parametri di misurazione del diametro luminale linfatico ^4,12,13:
   Contrazione di frequenza (FC), determinato dal conteggio del numero di contrazioni fasiche al minuto.
   Fine diametro diastolico (EDD), che è il diametro appena prima di una contrazione fasica.
   Fine sistolica diametro (ESD), il diametro al fine di una contrazione fasica.
   Ampiezza di contrazione (AMP = EDD-ESD), un indice semplificata della gittata sistolica.
   Il diametro massimo passivo ad ogni pressione (Max D; determinato a Ca ^{2 +} senza condizioni), che può essere utilizzato per determinare il segnale generato dal muscolo liscio linfatico, ed è anche utilizzato per normalizzare i dati tra vasi linfatici di diametro diverso, o linfatico stesso ha studiato presso diverse pressioni luminale.
   EDD _1, che è l'EDD associata alla prima contrazione dopo una fase di pressione. Questo viene utilizzato come punto di partenza quandodeterminare costrizione miogena di una nave linfatico in risposta ad un aumento della pressione luminale passo ^5.
   Miogena costrizione di un linfatico isolato dopo una fase di pressione è rappresentato dalla variazione normalizzata in EDD a seguito di un aumento di pressione passo = 100 * (EDD - EDD ₁₎ / Max D.
   Ulteriori variabili che possono essere calcolati, ma sono discussi altrove nel dettaglio ⁴ sono:
   Tono = 100 * (Max D - EDD) / Max D, AMP normalizzato = AMP / Max D
   Indice del volume ictus (SVI) = π (EDD ² - ESD ²⁾
   Frazione di eiezione (EF) = SVI / (πEDD2)
   Indice del volume di flusso (VFI) = CF x SVI.

7. Rappresentante dei risultati:

All'inizio di ogni contrazione fasica, c'è stato un aumento transitorio della [Ca ^{2 +]} _i (Figura 4). Inoltre, dopo un aumento della pressione luminale passo, la frequenza di Ca ^{2 +} transitori e pcontrazioni Hasic aumentato in sincronia. Queste osservazioni sono simili a una precedente ricerca utilizzando condotti toracica montata su un filo miografo ¹⁴ e il supporto dei dati precedenti che indicano un ruolo centrale per il rilascio oscillatorio Ca ^{2 +} dai depositi interni del meccanismo alla base del ciclo contrattile fasica ^15.

Abbiamo anche studiato se [Ca ^{2 +]} _i durante la diastole (tra la Ca ^{2 +} transitori e contrazioni fasiche) è associato con il tono linfatico e costrizione miogenici causati da allungare quando aumenta passo di pressione vengono imposte (Figura 5). Immediatamente dopo passo aumento della pressione di +4 cm H ₂ O e superiori, [Ca ^{2 +]} _i durante la diastole in costante aumento, rispetto al basale prima del passo di pressione (Figura 5B). Inoltre, dopo l'aumento iniziale di diametro a causa del passo aumenta di pressione (EDD _1), vi era costrizione miogenico (Fig.URE 5C), definita come una diminuzione della EDD da EDD ₁ in relazioni precedenti ^5,12. Nel confrontare la variazione media normalizzata in EDD tra le diverse fasi di pressione, non c'era costrizione significativamente più dopo un aumento di +8 e +10 cm H ₂ O rispetto a +2 cm H ₂ O (Figura 6 A). Il costante aumento della [Ca ^{2 +]} _mi è stato anche in relazione alla pressione, con gli aumenti fase di +6, +8 e +10 cm H ₂ O causando cambiamenti significativamente più alti di Ca ^{2 +} di +2 cm H ₂ O ( Figura 6 B). Tuttavia, la pressione step-Ca ^{2 +} rapporto sembra altopiano a queste pressioni pure. Questi risultati suggeriscono che un Ca ^{2 +-dipendente} meccanismo è associata a costrizione linfatico miogenico in risposta ad allungare. Tuttavia, l'altopiano della pressione step-Ca ^{2 +} rapporto suggerisce un meccanismo che aumenta la sensibilità del Ca ^{2 +} può anche contribuire a una maggiore miogenico constriction a passi pressione più elevata.

Figura 1. Schematica del sistema di microscopio utilizzato per la misurazione della [Ca ^{2 +]} _i in un isolato linfatico. La camera linfatico isolato è posto sul palcoscenico del microscopio invertito. Il campione è illuminato alternativamente a 340 e 380 nm, e il segnale fluorescente emesso dal linfatico viene raccolto con una telecamera CCD e conservati in un personal computer. La pressione intraluminale del linfatico è controllato da un servo-sistema di feedback nullo. L'utente imposta la pressione per il sistema, ed i trasduttori di pressione in linea con il linfatico relè la pressione intraluminale al sistema di feedback, che può dinamicamente alzare o abbassare la pressione tramite una pompa.

Figura 2. Esempio di Regione di Interesse (ROI) la selezione per la Fura-2 studi di imaging raziometrico in vasi linfatici isolati. La regione selezionata include la maggior parte della nave (escluse le aree di toccare il micropipette) e la zona circostante per garantire la nave sarà monitorato per il corso intero tempo. Un ROI di fondo (in alto a destra) è anche usato per eliminare il segnale non specifico dal bagno circostante.

Figura 3. Metodi di inseguimento di pompaggio linfatico. A. diametro interno può essere determinata nel tempo utilizzando ROI che il movimento traccia delle pareti dei vasi. B. Quando la soglia di contrasto è impostato per includere l'intero vaso, il diametro esterno può essere monitorati con un ROI singolo. Diametro interno può essere stimato da queste misurazioni attraverso la correzione per lo spessore della parete. C. Un'altra opzione è quella di seguire l'area compresa dalla nave, che può essere utilizzato per calcolare il volume attraverso la correzione per lo spessore della parete eassumendo il linfatico ha geometria cilindrica.

Figura 4. Relazione tra [Ca ^{2 +]} _i e diametro linfatico. A. Immagini rappresentative di un time-lapse video della Fura-2 intensità (in formato mappa di calore) in un isolato linfatico. Le frecce in ogni immagine delineare il diametro esterno della nave. Immagine 1 mostra il linfatico durante la diastole, con relativamente bassa [Ca ^{2 +]} _i. In immagine 2, l'intensità del rapporto 340/380 aumenta nelle pareti dei vasi, poco prima della contrazione fasica che si verifica nelle immagini 3-5. Per immagine 4, il Ca ^{2 +} transitorio si è concluso, e per immagine 5, la fase sistolica si è conclusa e la nave sta tornando al suo stato di riposo. B. Una trama di [Ca ^{2 +]} _i linfatici ed il diametro luminale mostra che un aumento transitorio della [Ca ^{2 +]} _i si verifica appena prima di ognicontrazione fasica.

Figura 5. Variazioni linfatico [Ca ^{2 +]} _i e il ciclo linfatico contrattile in risposta al passo aumento della pressione. I protocolli di pressione passo (A), 340/380 dati ratio, che rappresenta il [Ca ^{2 +]} _i (B), e cambiamenti di diametro linfatico nel corso del tempo (C) vengono visualizzati. A. pressione basale lume era di 2 cm H ₂ O e il vaso linfatico è stato sottoposto a passo aumenta di +2, +4, +6, +8 e +10 cm H ₂ O. L'intervallo di tempo tra ogni fase di registrazione di pressione era di 1-2 min. Ogni passo di pressione ha causato un aumento sia della frequenza di aumenti transitori [Ca ^{2 +]} _i (B) e contrazioni fasiche (C). Diametro linfatico aumentato con l'aumentare della pressione passo del lume, e per i 4-10 cm H ₂ O passi pressione, c'è stata una diminuzione iniziale della EDD che si sono verificati after EDD1 (C), precedentemente descritta come costrizione linfatico miogenico. Ci fu anche un costante aumento del basale [Ca ^{2 +]} _i transienti tra immediatamente dopo ogni aumento di punto di pressione (B). La costrizione miogenici è stato più pronunciato con i passaggi più pressione, tuttavia l'aumento basale [Ca ^{2 +]} _i è stato di circa lo stesso per i 4-10 cm H ₂ O passi di pressione (B). Un aumento precedentemente riportato compensatorio AMP è stata evidente anche dopo i passi pressione di 6-10 cm H ₂ O (C).

Figura 6. Costrizione linfatico miogenici e l'aumento graduale della libera [Ca ^{2 +]} _i durante la diastole, poco dopo il passo aumenta di pressione. A. La media EDD tra 30-50 s dopo l'EDD ₁ è utilizzato per calcolare la variazione di EDD normalizzata per ogni fase di pressione. B. L'intensità del rapporto 340/380 30-50 s dopo l'EDD ₁ è stato diviso per la media di 340/380 rapporto durante la linea di base (2 cm H ₂ O). * P <0,05 rispetto al centimetro H 2 O ₂ step di pressione. N = 4 vasi studiati.

Movie 1. Esempio di contrazioni fasiche in un vaso linfatico isolata utilizzati per lo studio. La pressione luminale è stato fissato a 2 cm H ₂ O. Il tempo trascorso e una barra di scala sono riportati in basso. Il time-lapse immagini sono state raccolte con un obiettivo 10X a luce trasmessa. Clicca qui per guardare il film.

Movie 2. Raziometrica Fura-2 immagini in un isolato di pompaggio linfatico. Una scala della mappa di calore è mostrato in alto a sinistra e il tempo trascorso e la barra di scala sono riportati in basso. La pressione è stata inizialmente fissata al 2 cm H ₂ O ed è stato alzato a 8 cm H ₂ O a partire da 0,5 min e Returned a 2 cm H ₂ O a 1,5 min. Clicca qui per guardare il film.

Discussion

Una nuova combinazione di metodi è stato impiegato per lo studio intrinseco di pompaggio dei vasi linfatici. La possibilità di misurare simultaneamente i cambiamenti in [Ca ^{2 +]} _i vasi linfatici e del diametro di pompaggio permetterà di studi sul contributo relativo di Ca ^{2 +-dipendente} e Ca ^{2 +-sensibilizzanti} vie di segnalazione nel meccanismo generale che regolano il ciclo contrattile linfatico.

Il ciclo linfatico contrattile costituito da contrazioni fasiche sovrapposta tono. I dati mostrano che ogni contrazione fasica è associato ad un aumento transitorio [Ca ^{2 +]} _i, suggerendo un ruolo centrale di Ca ^{2 +} nel meccanismo pacemaking, e che la frequenza di Ca ^{2 +} transitori è sensibile ai cambiamenti di pressione luminale . I nostri dati mostrano anche che un rapido aumento della pressione può provocare un aumento costante nel basale [Ca ^{2 +]} tra _i transienti. Questo aumento può contribuire ala costrizione miogenica che si osserva nella raccolta di vasi linfatici in seguito ad aumenti della pressione passo del lume. Tuttavia, abbiamo osservato un altopiano degli aumenti in questo basale [Ca ^{2 +]} _i passi con pressioni che vanno 6-10 cm H ₂ O, che aveva vari gradi di costrizione miogenico. Questi dati suggeriscono che un altro meccanismo, forse un Ca ^{2 +-sensibilizzante} meccanismo, è anche coinvolto nella risposta miogenico alla pressione.

Un presupposto di questi studi è che la maggior parte delle misurato Ca ^{2 +} è contenuto nel muscolo liscio. Tuttavia, Ca ^{2 +} in cellule endoteliali e altri tipi di cellule che possono essere presenti nei vasi linfatici anche contribuire alla osservato generale [Ca ^{2 +]} _i, quindi i valori misurati sono probabilmente una sovrastima della muscolatura liscia [Ca ^{2 +]} _i in vasi linfatici. Qualsiasi ² Ca ⁺ misurata dalla endotelio non è prevista la partecipazione direttaper la contrazione muscolare liscia sulla base di studi precedenti in arteriole ^16. Questo problema verrà affrontato in futuri esperimenti in cui vengono spogliate dei vasi linfatici di endotelio.

Quando si utilizza coloranti raziometrico per valutare [Ca ^{2 +]} _i in cellule o tessuti, il movimento del campione può causare artefatti. Per ridurre al minimo gli artefatti movimento in aggiudicatrici linfatici, abbiamo utilizzato un ROI che include tanto della nave quanto possibile stabilire rapporti di 340/380. Abbiamo anche solo studio navi che rimanere a fuoco durante il loro ciclo contrattile. A causa di artefatti potenziali che possono derivare dal movimento nave, piuttosto che determinare l'assoluta [Ca ^{2 +]} _i in un determinato sito, si ottiene la media per una vasta area della nave. Ci concentriamo sulle variazioni relative alla media [Ca ^{2 +]} _i nel tempo e come questi cambiamenti si riferiscono alla contrazione fasica e tonica dei vasi.

In sintesi, deterioramentormination delle variazioni di [Ca ^{2 +]} _i da immagini raziometrico isolato in vasi linfatici di raccolta rappresenta un potente strumento per decifrare il Ca ^{2 +-dipendente} e Ca ^{2 +-sensibilizzanti} meccanismi alla base del ciclo contrattile linfatico. Con questo metodo, gli studi futuri che utilizzano agonisti selettivi o inibitori di vari percorsi di trasduzione del segnale anche aiutare a differenziare i meccanismi molecolari alla base unica contrazione fasica contro tonico linfatico nel muscolo liscio.