Summary
מאמר זה מתאר את ההקלטה של תאים בודדים מאוכלוסיות העצבית מתויג fluorescently ברשתית עכבר ללא פגע. באמצעות שני הפוטונים עירור בתאי אינפרא אדום שכותרתו transgenetically היו מטרה הקלטה תיקון-clamp ללמוד לאור התגובות שלהם, מאפייני שדה פתוח, ומורפולוגיה.
Abstract
ללמוד את המאפיינים פיזיולוגיים קשרים סינפטיים של נוירונים ספציפיים ברקמות שלמות היא אתגר עבור אותם תאים חוסר תכונות מורפולוגיות בולט או להראות צפיפות אוכלוסין נמוכה. זה חל במיוחד amacrine תאים ברשתית, מעמד יוצא דופן של רב צורות interneurons המרכיבים בערך 30 תת ביונקים 1. למרות היותו חלק חיוני של עיבוד חזותי על ידי עיצוב פלט הרשתית 2, רוב תת אלה לא נחקרו עד כה בהקשר פונקציונלי כי המפגש התאים האלה עם אלקטרודה ההקלטה היא אירוע נדיר.
לאחרונה, מספר רב של קווי עכבר מהונדס זמין המבטאים סמנים ניאון כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטתו של היזמים עבור קולטני קרום או אנזימים ספציפיים משנה בלבד של נוירונים רקמות נתון 3,4. אלה מראש שכותרתו תאים ולכן הם accessibl דואר אל microelectrode ביים מיקוד בשליטה מיקרוסקופיים, המתיר לימוד שיטתי של מאפיינים פיזיולוגיים שלהם באתרם. עם זאת, עירור של סמנים ניאון מלווה בסיכון phototoxicity עבור רקמת החיים. ברשתית, גישה זו היא בנוסף הקשו על ידי הבעיה האור גורם עירור גירוי מתאים של קולטני האור, ובכך גרימת photopigment הלבנת והעברת מעגלים רשתית למצב האור מותאם. חסרונות אלה להתגבר באמצעות עירור אינפרא אדום נמסר על ידי לייזר במצב נעול בפולסים קצרים של טווח femtosecond. עירור שני פוטון מספקת מספיק אנרגיה עבור עירור fluorophore ו באותו זמן מגבילה את עירור לנפח רקמה קטן למזער את הסיכונים של נזקי 5. כמו כן, הוא עוזב את הרשתית מגיבים לגירויים חזותיים מאז אור אינפרא אדום (> 850 ננומטר) נספג היטב רק על ידי photopigments 6.
s = "jove_content"> במאמר זה אנו מדגימים את השימוש של הרשתית עכבר מהונדס להשיג אלקטרו בהקלטות באתרו של ה-GFP-להביע תאים ממוקדות חזותית על ידי עירור שני הפוטונים. הרשתית היא מוכנה ומתוחזק בחשכה יכול להיות חשוף לגירויים אופטיים אשר מוקרנים דרך הקבל של המיקרוסקופ (איור 1). Patch-clamp הקלטה של תגובות אור ניתן לשלב עם צבע מילוי כדי לחשוף את המורפולוגיה כדי לבדוק לצבוע הפער צומת בתיווך צימוד תאים שכנים, כך תא היעד יכול ללמוד על רמות על ידי ניסויים שונים.
Protocol
התיאור הבא מניחה כי הנסיין יש הבנה בסיסית של מבנה הרשתית, תיקון-clamp הקלטה, שני הפוטונים במיקרוסקופ. למידע שימושי על הקמת מפעיל התקנה תיקון-clamp ושני פוטון מערכת הדמיה לראות השופטים [7-12].
1. בעלי חיים והכנה רקמה
- שמור עכבר כהה להתאים לפחות 3 ח בינתיים, להכין 1-2 l פתרון של תאית המורכב (מ"מ) 125 NaCl, KCl 2.5, 1 CaCl 2, 1.6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-גלוקוז לאזן אותו pH 7.4 בגז עם carbogen (5% ב-CO 2 O 2) בטמפרטורת החדר.
- להרדים את העכבר בתא אוויר חזק על ידי מנת יתר של CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. הליך זה לבין השלבים הבאים יש לבצע בחושך. שימוש בתאורה עמומה ארוכת הגל (אנו חוסמים אורכי גל קצרים ממקור אור קר על ידי 690 ננומטר-longpasשל מסנן) כדי לתמוך חזון אישי תוך שמירה על העיניים של החיה כהה מותאם (עכברים רק חזון עני בחלק האדום של ספקטרום האור). לעבודה תאורה להשתמש להשלים החושך אינפרא אדום (> 800 ננומטר) ללבוש משקפי ראיית לילה.
- Enucleate עיניים עם זוג מספריים מעוקל איריס ולהעבירם צלחת של פתרון תאיים תחת מיקרוסקופ לנתח.
- הסר את הקרנית ואת הגוף ריסי ידי פתיחת הנורה העין לאורך serrata אורה (הגבול בין הרשתית ואת הגוף ריסי) עם זוג מספריים אביב (אנחנו הראשונים להשתמש Lancet לחדור נקודת התחלה עבור חיתוך). קח את העדשה בזהירות להפריד את הרשתית של אפיתל הפיגמנט. אם הכיוון של הרשתית הוא חיוני כדי ללמוד שלך, מציינים את זה כמו שופט [12]. חותכים את העצב האופטי בין הרשתית לבין אפיתל הפיגמנט ולהסיר את הרשתית מן עיינית. הערה כיוון משטחי רשתית: החלק הפנימי של הרשתית מכורבל הוא ganglבצד יון התא; החיצון הוא הצד photoreceptor.
- הסר את הזגוגית מעל פני הרשתית הפנימי על ידי משיכתו בעדינות מעל בעזרת קיסם עץ. לשם כך, השתמש נפח קטן של פתרון תאיים כי רק מכסה את הרשתית. מקלות זגוגי עד קיסם והוא יכול להיגרר centrifugally את הרשתית. לאחר מכן, החל חתכים קצרים יחד למתחם הרשתית כדי להקל על שיטוח של הרקמה.
- מעבירים את הרשתית לתוך תא ההקלטה photoreceptor בצד למטה, ופרש אותה על תחתית זכוכית (אנו משתמשים במכחול דק) ו לשתק אותו עם מסגרת ניילון מתוח של נירוסטה. הכן את הרשתית השני באותו אופן ולשמור כהה להתאים פתרון תאיים carboxygenated לשימוש מאוחר יותר.
2. הקלטות
- התקינו את תא הקלטת בחושך תחת מיקרוסקופ לייזר זקוף סריקה superfuse הכנת רשתית ברציפות (לא פחות מ 5 מ"ל / min) עם פתרון תאיים carboxygenated מחומם ל 35 ° C. המיקרוסקופ (גם מצויד במצלמת CCD אינפרא אדום רגיש) שוכן על שולחן הלם קליטת האוויר בתוך כלוב פאראדיי עבור מיגון אלקטרוניים. מכסים את הכלוב עם וילון לא שקוף כדי לשמור על הכנת בחושך. יש לנו גם את המסך האור מסכי מחשב על ידי סרט אדום שקוף.
- כוון לייזר אינפרא אדום באורכי גל 850-870 ננומטר, או יותר, לעבור למצב במצב נעול, ולהשתמש שני הפוטונים עירור לדמיין GFP-להביע תאים. להחליש את פלט לייזר באמצעות מסננים צפיפות ניטרלי בשליטת התוכנה סריקה לייזר למטה במידה כי הוא מספיק רק הכרה ברורה של התא פלורסנט
- עבור תיקון-clamp הקלטות מהדק הנוכחי לשימוש micropipettes מצב זכוכית (אנו משתמשים בצינור זכוכית בורוסיליקט בקוטר 1.5 מ"מ החיצונית 0.225 מ"מ עובי דופן) מלאים פתרון תאיים המורכב (מ"מ) 125 K-gluconate, 10 KCl, 0.5 EGTא ', 10 HEPES, טיטרציה pH 7.4 עם KOH (מתן התנגדות פיפטה של כ 5 MΩ). שים לב כי תנאי הניסוי אחרים כמו הקלטה מתח-clamp דורשים פתרון אחר. אם זריקות צבע הם הרצוי, להוסיף בדיקה ניאון (אנו משתמשים 10 mM אלקסה פלואוריד 594) או מולקולה נותב (3% Neurobiotin). הכנס את micropipette לתוך מחזיק ולוודא כי הפניה אלקטרודה (חוט כסף כלור) נמצא בקשר עם הפתרון תאיים בתא ההקלטה.
- החל הלחץ micropipette ואת יעד GFP-להביע תאים (אנו משתמשים 40 פי טבילה אובייקטיבי מים; NA 1.25). גופי התא Amacrine נמצאים בשכבת גנגליון תא (ישירות מתחת לפני השטח בכיוון הנוכחי של הרשתית), וכן בחלק הפרוקסימלי של שכבת הגרעין הפנימית (כ 55-75 מיקרומטר עמוק בתוך ההכנות). לפני מגע micropipette עם תא המטרה, להגביל את הממברנה הפנימית (נדן עשוי גליה endfeet) על הרשתיתהמשטח צריך להיות חדרו. חדירה מוצלחת מוכר על ידי פתרון תאיים כי הוא מונע את מקצה micropipette ו מנתק את קרום הגבלת הפנימי של רקמת הרשתית הבסיסית כפי שניתן לראות בתמונה שידור אינפרא אדום נתפס על ידי מצלמה IR-CCD.
- הגישה לתא הרצוי על ידי השוואת עמדת סומה מהתמונה שני פוטונים עם התמונה של המצלמה IR-CCD מראה את המיקום של micropipette את ההקלטה. שים לב שלב זה לא יושג בקלות דורש קצת תרגול, משום התא GFP-לבטא יש להכיר בדמות שידור אינפרא אדום על מנת לכוון את micropipette אליה. מיקוד נכון מושגת כאשר קצה micropipette גורם מנקדים את פני השטח של התא ניתן לראות תמונה של שני הפוטון. חלופה להליך זה, השתמש צבע פלואורסצנטי (למשל אלקסה פלואוריד 594, 100 מיקרומטר) בפתרון תאיים לחשוף את המיקום micropipette בתמונה שני הפוטון. שני הפוטונים עירור אינפרא אדום מאפשרת הקרינה מספקת של הצבע הזה כדי להפוך micropipette ניכרת. לענין זה, להתאים את טווח גילוי בתוכנה סריקת לייזר כדי לכסות גם פלואורסצנטי אדום.
- שחרור הלחץ micropipette ולקבל כל תא תיקון-clamp מהדק תצורה במצב הנוכחי. הקלטה שמיש צריך לתת פוטנציאל הממברנה של mV -50 ל -55 והאחרונה דקות לפחות 20.
- גירויים חזותיים הווה נוצר על ידי תוכנה גירוי (אנו משתמשים QDs ידי תומאס אוילר, אוניברסיטת טובינגן, גרמניה) 11 על צג המחשב. התאם את המיקום המרחבי של הגירוי להיות מרוכז על התא נרשם: מארק עמדת התא על המסך מראה את התמונה של המצלמה שידור IR-CCD מרכז גירוי ספוט כמו על זה. כוון את עוצמת הגירוי על ידי הוספת פילטרים צפיפות ניטרלי לתוך הנתיב הקורה. עבור כיול של הספקטרום לפקח עוצמת לראות שופט [14]. בחר prolongeד interstimulus מרווח (למשל 15 שניות), כדי למנוע הסתגלות. כלול photodiode בתוך נתיב הקורה כדי לשמור על שיא של עיתוי הגירוי.
- הפעל את פרוטוקול גירוי ולהקליט את התגובות אור (אנו משתמשים קצב דגימה של 10 קילוהרץ עם סינון על 5 kHz שאינם spiking תאים; הקלטה ספייק קצב דגימה גבוה כמו kHz 20 מומלץ). השתמש בתוכנה גירוי האור כדי לעורר את תוכנת הצריבה.
- עבור צבע המילוי לתת מפוזר סוכן פלורסנט לתוך התא רשמה 30-45 דקות לפני retracting בעיון את micropipette מהתא. הקפידו לא להוציא את גוף התא. אם לא פלורסנט נותב Neurobiotin שימש, זה צריך להדמיה באמצעות קשירה streptavidin מצומדות כדי fluorophore (אנו משתמשים streptavidin-Cy3, מעל 1:400 בלילה 4 מעלות צלזיוס אחרי 20 דקות paraformaldehyde קיבעון של הרשתית; עבור צימוד, צבע מחקרים הדגירה streptavidin יכול להיות ממושכת 3 ד). לחילופין, זריקות יכול להיות גם הופיעה עםאלקטרודות חדה (> 100 MΩ) כאשר צבע מונע iontophoretically לתוך התא משופד (פולסים מלבני: 0.25-1 NA, 100 אלפיות, 100 אלפיות מרווח, הזמן הכולל 3-6 דקות).
3. נציג תוצאות:
את התוצאות הבאות שמקורם במחקר על עכבר לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת האמרגן עבור tyrosine hydroxylase 13,14, האנזים catalyzing שיעור הגבלת צעד בסינתזה קטכולאמינים (TH: עכבר ה-GFP). בהתבסס על הבהירות של ה-GFP אותות שתי אוכלוסיות תאים שונות וניתן להבחין בהם (איור 2A). תאים המבטאים את רמת ה-GFP גבוה בעל גוף התא ממוקם שכבת הגרעין הפנימית (INL, איור 2 א) או עקורים בשכבת תא גנגליון (GCL, איור 2B) ו לרבד באמצע השכבה הפנימית plexiform (IPL, איור 2C) . הם זוהו 2 תאים מסוג 14-16 ויכול להיחקר באופן שיטתי לגבי המורפולוגיה (איור 3) ולבחורפעילות rical (איור 4) למרות צפיפות האוכלוסין שלה מסתכם רק 250 תאים / מ"מ 2.
באיור 1. ייצוג סכמטי של הגדרת הניסוי. שני הפוטונים עירור (אור אדום שביל מקווקו) של fluorophore-להביע תאים ברשתית שלם מאפשר מיקוד הראייה על ידי micropipette (אור ירוק בנתיב פליטה). הרשתית היא נתון לגירויים אופטי מוקרן דרך הקבל של המיקרוסקופ (נתיב האור הצהוב), ותגובות אור הסלולר נרשמים.
באיור 2. GFP-להביע את התאים flatmount הרשתית של TH: עכבר ה-GFP. שתי אוכלוסיות ניתן להבחין על ידי הבהירות של אות ה-GFP: 1 סוג התאים (תאים DA) הממוקם INL מראה הקרינה חלשה (ראו ראשי חץ) וסוג שכותרתו בעוצמה 2 תאיםעם גופי התא או את INL (ראה חיצים) או עקורים בתוך GCL (B) ריבוד הדנדריטים בשכבה S3 של IPL (C). סולם ברים, 50 מיקרומטר.
באיור 3. מורפולוגיה של תא מסוג 2 מוזרק עם Neurobiotin נותב. נותב היה דמיינו לאחר מכן על ידי streptavidin-Cy3 מחייב (מג'נטה). מיקרוסקופ, שהוא גם המתארת את אות ה-GFP (ירוק), היא השלכה של ערימות התמונה מכסה את GCL ו IPL. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר.
איור 4. תגובות אור של תא מסוג 2 נמצא GCL. תגובת דפוס תאורה לבנה שדה מלא אור בעוצמה גוברת בטווח scotopic. עוצמת הגירוי ניתנת photoisomerizations לכל מוט לשנייה (Rh * / מוט / s). גירוי ממושך של 3 שימש יותר ברוריםיון של מרכיבי התגובה תחילת הגירוי (על התגובה) וכן לקזז (OFF תגובה).
Discussion
שיטה זו מציעה את האפשרות ללמוד את התכונות החשמליות של נוירונים ספציפיים ברשתית שלם תחת הדרכתו חזותי ללא השפעה על מצב adaptational של הרשתית. זה מתאים במיוחד עבור אפיון של התאים כיום למד די רע בשל צפיפות אוכלוסין נמוכה כמו רוב אוכלוסיות של תאים amacrine. שני הפוטונים עירור היתרי הדמיה ברזולוציה גבוהה וניגודיות גבוהה אפילו ממקומות עמוקים יותר של הרקמה 17, תנאי הכרחי מיקוד מדויק ומוצלח תיקון-clamping של תאים בעיקר INL עם צפיפות גבוהה של גופי התא.
הרשתית עכבר מבודד הוא בר קיימא עבור 3-4 שעות תחת תנאי הניסוי. אם הרשתית השני הוא מאוחסן בחושך מוחלט תחת בגז carbogen רציפה, הוא שומר את הצבע הסגול של photopigment מולבן וניתן להשתמש בו לאחר סיום ניסויים הרשתית הראשונה. בהתחלה, מיקודהתא הנבחר עם micropipette ב wholemount הרשתית היא קצת מאתגרת דורש קצת תרגול, במיוחד כאשר עובדים בחושך. כולל צבע פלואורסצנטי ב micropipette יכול לפשט את ההליך, כי התא micropipette גלויים תחת עירור שני פוטונים באותו זמן. עם זאת, הוספת רכיבים לפתרון תאיים עשוי לעכב היווצרות gigaseal או לגרום את איכות ההקלטה לסבול. לאחר שהושגו בהצלחה, הקלטה טובה יכולה להימשך כ 1 ח
בעוד האור עירור אינפרא אדום עצמו נספג היטב רק על ידי קולטני האור ברשתית, נרגש GFP-לבטא בתאי פולטים אור בחלק הנראה של הספקטרום. עם זאת, fluorophores שמחים רק בנפח מוקד קטן אינו צפוי לשנות את המצב adaptational של הרשתית. כל עוד, עירור נדרשת רק המיקוד יכול להיות כבוי במהלך ההקלטה של תגובות אור.
UsefulnESS של גישה זו באה לידי ביטוי כבר על ידי מחקרים על אוכלוסיות ספציפיות של תאים amacrine 14,18 שממנו הקלטות אלקטרו אחרת היה אפשרי רק במקרה 12. לבסוף, טכניקה זו עוצמה נוספת יכולה להיות מורחבת על ידי כולל גישה תרופתי 14, Ca 2 + הדמיה 19 או באמצעות התאים מוזרקים ללימודי immunocytochemical או במיקרוסקופ אלקטרונים. בדרך זו, עמדת תפקודית של סוג תא נתון המעגלים ברשתית יכול להיות פרומים.
Disclosures
העכברים טופלו ו מורדמים בהתאם להנחיות המוסדי לרווחת בעלי חיים לבין חוקי על ניסויים בבעלי חיים שהונפקו על ידי ממשלת גרמניה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (WE849/16 1 / 2 עד KD ו RW). אנו אסירי תודה תומאס אוילר (Töbingen, גרמניה) עבור QDs תוכנה גירוי האור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Night-vision goggles | Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany | Xtron F1 | includes a 800 nm light source |
| Optical filter | Schott AG | RG9 | longpass filter with cutoff at 690 nm |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | curved with 22 mm blade |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | straight with 3 mm blade |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | 200-100 500 0180 type A(TC) | Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182) |
| Flow heater | Multi Channel System MCS GmbH | PH01, TC01 | heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller |
| Laser scanning microscope | Leica Microsystems | DM LFS | controlled by Leica Confocal Software |
| Air table | Newport Corp. | VH 3036W-OPT | |
| Laser | Newport Corp. | Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser | |
| CCD camera | pco AG, Kelheim, Germany | PixelFly QE | including control software |
| Micropipette glass capillaries | Hilgenberg, Malsfeld, Germany | 1408411 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | fluorescent dye |
| Neurobiotin | Axxora | VC-SP-1120-M050 | non-fluorescent tracer |
| Streptavidin-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | 210-100 000 0010 | motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5 |
| Patch-clamp amplifier | npi electronic | SEC-05LX npi | |
| Digitizer | National Instruments | BNC-2090 | |
| Data acquisition software WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/ software.htm | |
| Visual stimulus generator QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Germany | has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor) | |
| Neutral density filters | ITOS, Mainz, Germany |
References
- Masland, R. H.
- Baccus, S. A. Timing and computation in inner retinal circuitry. Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neuroscience. 160, 126-139 (2009).
- Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. Genetic address book for retinal cell types. Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells. Nature. 418, 845-852 (2002).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Plenum Press. (1995).
- Jackson, M. B. Whole-cell voltage clamp recording. Current Protocols in Neuroscience. Gerfen, C. , Wiley. (1997).
- Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pfügers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).
- Yuste, R., Konnerth, A. maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (2005).
- Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).
- Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development. J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).
- Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice. J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).
- Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina. Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).
- Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).
- Denk, W., Detwiler, P. B. Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).
