Summary
Questo articolo descrive la registrazione delle singole cellule da fluorescente tag popolazioni neuronali della retina topo intatto. Con l'eccitazione a due fotoni infrarossi cellule transgenetically etichettati sono stati mirati per patch-clamp per lo studio di registrazione le loro risposte luce, proprietà del campo recettivo, e la morfologia.
Abstract
Studiare le proprietà fisiologiche e le connessioni sinaptiche dei neuroni specifici nel tessuto intatto è una sfida per quelle cellule che la mancanza cospicua caratteristiche morfologiche o mostrare una bassa densità di popolazione. Ciò vale in particolare per le cellule amacrine della retina, una classe di interneuroni straordinariamente multiformi che compongono circa 30 sottotipi nei mammiferi 1. Pur essendo una parte cruciale della elaborazione visiva modellando l'uscita della retina 2, la maggior parte di questi sottotipi non sono stati studiati fino ad ora in un contesto funzionale, perché incontrando queste cellule con un elettrodo di registrazione è un evento raro.
Recentemente, una moltitudine di linee di topi transgenici che è disponibile esprimere marcatori fluorescenti come una proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo di promotori di recettori di membrana o enzimi che sono specifici per solo un sottoinsieme di neuroni in un tessuto dato 3,4. Questi pre-etichettati cellule sono quindi accessible per la regia microelettrodo targeting sotto controllo microscopico, permettendo lo studio sistematico delle loro proprietà fisiologiche in situ. Tuttavia, l'eccitazione di marcatori fluorescenti è accompagnata dal rischio di fototossicità per il tessuto vivente. Nella retina, questo approccio è ulteriormente ostacolata dal problema luce di eccitazione provoca una stimolazione appropriata dei fotorecettori, così infliggendo fotopigmento sbiancamento e il trasferimento dei circuiti della retina in una luce-adattato condizione. Questi inconvenienti sono superati dai con eccitazione a infrarossi fornito da un laser mode-locked in brevi impulsi del campo di femtosecondi. Eccitazione a due fotoni fornisce energia sufficiente per l'eccitazione fluoroforo e al tempo stesso limita l'eccitazione per un volume di tessuto di piccole minimizzare i pericoli di fotodanneggiamento 5. Inoltre, lascia la retina risponde agli stimoli visivi in quanto la luce infrarossa (> 850 nm) è solo scarsamente assorbito dal fotopigmenti 6.
in situ da GFP che esprimono le cellule che sono visivamente bersaglio eccitazione a due fotoni. La retina è preparato e mantenuto al buio e può essere sottoposto a stimoli ottici che vengono proiettate attraverso il condensatore del microscopio (Figura 1). Patch-clamp registrazione di risposte luce può essere combinato con colorante riempimento per rivelare la morfologia e per controllarne il gap di giunzione mediata colorante attacco alle cellule vicine, in modo che la cellula bersaglio può da studiare su diversi livelli sperimentali.
Protocol
La seguente descrizione presuppone che lo sperimentatore ha una conoscenza di base della struttura della retina, patch-clamp la registrazione e la microscopia a due fotoni. Per informazioni utili sulla realizzazione e il funzionamento di una patch-clamp setup e due fotoni sistema di imaging vedere Rif [7-12].
1. Animali e di preparazione dei tessuti
- Tenere il mouse adattato all'oscurità per almeno 3 ore Nel frattempo, preparare 1-2 l di soluzione extracellulare costituito da (in mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 1 CaCl 2, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glucosio ed equilibrare a pH 7.4 con il gas con CarboGen (5% di CO 2 in O 2) a temperatura ambiente. un
- Euthanize il mouse in una tenuta d'aria da camera di CO 2 overdose seguita da dislocazione cervicale. Questa procedura e le seguenti operazioni devono essere eseguite nelle tenebre. Utilizzare dim lunghezza d'onda di illuminazione (lunghezze d'onda di bloccare dei passi da una fonte di luce fredda da un 690 nm-longpass filtro) per sostenere una visione personale, mantenendo gli occhi dell'animale scuro-adattato (topi hanno solo una visione povera nella parte rossa dello spettro della luce). Per i lavori di illuminazione completo uso tenebre infrarossi (> 800 nm) e indossare occhiali per visione notturna.
- Enucleare gli occhi con un paio di forbici curve iris e trasferirli in un piatto di soluzione extracellulare posta sotto un microscopio da dissezione.
- Rimuovere la cornea e il corpo ciliare aprendo il bulbo dell'occhio lungo la serrata (al confine tra retina e corpo ciliare) con un paio di forbici a molla (per prima cosa usare un bisturi per forare un punto di partenza per il taglio). Togliere le lenti e attentamente separato la retina da dell'epitelio pigmentato. Se l'orientamento della retina è cruciale per il vostro studio, indicare piace in Ref. [12]. Tagliare il nervo ottico tra retina e dell'epitelio pigmentato e rimuovere la retina dalla oculare. Si noti la direzione delle superfici della retina: la parte interna del arricciato-up retina è la Gangllato celle Ioni; l'esterno è il lato dei fotorecettori.
- Rimuovere il vitreo dalla superficie interna della retina con delicatezza tirando fuori con l'aiuto di uno stuzzicadenti di legno. A tal fine, utilizzare un piccolo volume di soluzione extracellulare che copre appena la retina. I bastoncini vitreo per lo stuzzicadenti e possono essere trascinati fuori centrifuga della retina. Quindi, applicare incisioni breve lungo il perimetro della retina per facilitare l'appiattimento del tessuto.
- Trasferire la retina nella camera di registrazione fotorecettore rivolto verso il basso, lo stese sul fondo di vetro (si usa un pennello fine) e immobilizzare con una con corde in nylon telaio in acciaio inossidabile. Preparare la retina secondo nello stesso modo e tenerlo scuro-adattato in carboxygenated soluzione extracellulare per un uso successivo.
2. Registrazioni
- Installare la camera di registrazione al buio sotto un microscopio laser a scansione verticale e superfuse la preparazione della retina continuamente (non inferiore a 5 ml / min) con carboxygenated soluzione extracellulare riscaldata a 35 ° C. Il microscopio (anche dotato di una lampada sensibile camera CCD) si trova su una ammortizzante tavolo aria all'interno di una gabbia di Faraday per elettronica schermatura. Coprire la gabbia con un non-tenda trasparente per mantenere la preparazione al buio. Abbiamo anche a schermo spento la luce dal monitor dei computer da rosso pellicola trasparente.
- Tune il laser a infrarossi per 850-870 nm o lunghezze d'onda maggiori, passare alla modalità-locked condizione, e l'uso di eccitazione a due fotoni per visualizzare GFP cellule che esprimono. Attenuare la potenza laser utilizzando filtri a densità neutra controllata dal software di scansione laser fino a un grado che è appena sufficiente per un chiaro riconoscimento della cellula fluorescente
- Per i patch-clamp registrazioni in current-clamp micropipette utilizzare la modalità di vetro (usiamo tubi in vetro borosilicato di 1,5 mm di diametro esterno e lo spessore della parete 0,225 mm) riempiti con una soluzione intracellulare composta da (in mm) 125 K-gluconato, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, titolato a pH 7.4 con KOH (dando una resistenza pipetta di circa 5 MΩ). Da notare che altre condizioni sperimentali come voltage-clamp registrazione richiedono una soluzione diversa. Se le iniezioni sono colorante desiderata, aggiungere una sonda fluorescente (usiamo 10 mM Alexa Fluor 594) o di una molecola tracciante (3% Neurobiotin). Inserire la micropipetta nel supporto e assicurarsi che l'elettrodo di riferimento (filo d'argento clorurati) è in contatto con la soluzione extracellulare nella camera di registrazione.
- Applicare una pressione al micropipetta e bersagliare un GFP che esprimono cellulare (usiamo un duplice obiettivo 40-immersione in acqua; NA 1,25). Amacrine corpi cellulari si trovano nello strato delle cellule gangliari (direttamente sotto la superficie con l'orientamento attuale della retina), così come nella parte prossimale dello strato nucleare interno (circa 55-75 micron nelle profondità della preparazione). Prima micropipetta contatto con la cellula bersaglio, la membrana limitante interna (una guaina fatta di gliali endfeet) alla retinasuperficie deve essere penetrato. Penetrazione di successo è riconosciuto da soluzione intracellulare che viene cacciato dalla punta micropipetta e stacca la membrana limitante interna dal tessuto di fondo della retina come si può osservare su un'immagine trasmissione a infrarossi catturata dalla IR-CCD.
- Approccio alla cella desiderata mettendo a confronto la posizione soma dei due fotoni immagine con l'immagine della IR-CCD che mostra la posizione della micropipetta registrazione. Si noti che questo passaggio non è facile da realizzare e richiede una certa pratica, perché la GFP-esprimere la cella deve essere riconosciuto nell'immagine trasmissione a infrarossi al fine di indirizzare la micropipetta verso di esso. Targeting corretto si ottiene quando la punta micropipetta cause fossette della superficie cellulare che può essere visto in due fotoni immagine. Alternativa a questa procedura, utilizzare un colorante fluorescente (per esempio Alexa Fluor 594, 100 mM) nella soluzione intracellulare per rivelare la posizione micropipetta in due fotoni immagine. Eccitazione a due fotoni a raggi infrarossi permette di fluorescenza del colorante sufficiente per rendere la micropipetta discernibile. A tal fine, regolare il campo di rilevamento del software di scansione laser per coprire anche fluorescenza rossa.
- Scaricare la pressione dalla micropipetta e ottenere un whole-cell patch-clamp in configurazione current-clamp mode. Una registrazione utilizzabile dovrebbe dare un potenziale di membrana di -50 a -55 mV e durare almeno 20 minuti.
- Presente stimoli visivi creati da un software stimolazione (usiamo QDS da Thomas Eulero, Università di Tubinga, Germania) 11 sul monitor del computer. Regolare la posizione spaziale della stimolazione ad essere centrato sulla cella registrato: Segnare la posizione delle cellule sul monitor che mostra l'immagine di trasmissione del IR-CCD e il centro un luogo-come stimolo su di esso. Regolare l'intensità dello stimolo con l'inserimento di filtri a densità neutra nel percorso del fascio. Per la calibrazione dello spettro di monitorare e vedere l'intensità Ref. [14]. Scegli un prolonged interstimulus intervallo (ad esempio, 15 s) per evitare di adattamento. Includere un fotodiodo sul percorso del raggio di tenere traccia dei tempi stimolo.
- Avviare il protocollo di stimolazione e registrare le risposte luce (si usa una frequenza di campionamento di 10 kHz, con filtraggio a 5 kHz per non spiking cellule; per la registrazione di picco di una frequenza di campionamento più alto come 20 kHz è consigliato). Utilizzare il software leggero stimolo per attivare il software di registrazione.
- Per tingere il riempimento lasciare che la diffusa fluorescente agente nella cella registrato per 30-45 minuti prima con attenzione ritraendo la micropipetta dalla cella. Fare attenzione a non estrarre il corpo cellulare. Se il non-tracciante fluorescente Neurobiotin è stato utilizzato, ha bisogno di visualizzazione legandosi a streptavidina coniugato con un fluoroforo (usiamo streptavidina Cy3, 1:400 per tutta la notte a 4 ° C dopo 20 min paraformaldeide fissazione della retina, per tingere accoppiamento Gli studi di incubazione streptavidina può essere prolungata fino a 3 d). In alternativa, le iniezioni possono essere eseguite anche conelettrodi forte (> 100 MW), quando il colorante è guidato iontophoretically nella cella impalato (impulsi rettangolari: 0,25-1 nA, 100 ms, intervallo di 100 ms, tempo totale 3-6 minuti).
3. Rappresentante dei risultati:
I seguenti risultati provengono da uno studio su un topo che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il promotore per la tirosina idrossilasi 13,14, l'enzima che catalizza il fattore limitante nella sintesi delle catecolamine (TH:: GFP mouse). In base alla luminosità della GFP-segnale due distinte popolazioni cellulari si distinguono (Figura 2A). Cellule che esprimono il livello più alto GFP possiedono corpi cellulari situati nello strato nucleare interno (INL, figura 2A) o spostato nello strato delle cellule gangliari (GCL, Figura 2B) e stratificare nel mezzo dello strato interno plessiforme (IPL, Figura 2C) . Essi sono stati identificati come cellule di tipo 2 14-16 e potrebbe essere studiati sistematicamente in relazione alla morfologia (Figura 3) ed eleggereattività rical (Figura 4), anche se la sua densità di popolazione ammonta solo a 250 cellule / mm 2.
Figura 1. Rappresentazione schematica del setup sperimentale. Eccitazione a due fotoni (luce rossa percorso punteggiato) di fluoroforo che esprimono le cellule della retina intatta consente visivo mira da una micropipetta (percorso verde emissione di luce). La retina è sottoposta a stimoli ottici proiettata attraverso il condensatore del microscopio (percorso giallo chiaro), e le risposte cellulari leggeri vengono registrati.
Figura 2. GFP-cellule che esprimono in un flatmount della retina di un TH:: mouse GFP. Due popolazioni si distingue per la luminosità del GFP-segnale: di tipo 1 le cellule (cellule DA) situato nel INL mostrando fluorescenza debole (A, vedi frecce) e il tipo intensamente etichettati 2 cellecon i corpi cellulari sia nel INL (A, vedi frecce) o sfollati nella GCL (B) e una stratificazione dendritica nello strato S3 della IPL (C). Barre di scala, 50 micron.
Figura 3. Morfologia di una cellula di tipo 2 iniettato il tracciante Neurobiotin. Il tracciante è stata successivamente visualizzati con streptavidina Cy3-binding (magenta). Il microscopio, che è anche il segnale che raffigura GFP (verde), è una proiezione di pile immagine che copre il GCL e IPL. Scala bar, 50 micron.
Figura 4. Risposte luce di una cellula di tipo 2 si trova nella GCL. Risposta modello da luce bianca a pieno campo illuminazione di intensità crescente nella gamma scotopica. Intensità dello stimolo è dato in photoisomerizations per asta al secondo (Rh * / asta / s). Uno stimolo prolungato di 3 s è stato usato per una migliore distinteione dei componenti risposta all'esordio stimolo (ON risposta) e offset (OFF risposta).
Discussion
Questo metodo offre la possibilità di studiare le proprietà elettriche dei neuroni specifici della retina intatta sotto guida visiva senza influenzare le condizioni di adattamento della retina. E 'particolarmente adatto per la caratterizzazione di cellule che sono attualmente piuttosto poco studiato a causa della bassa densità di popolazione come la maggior parte delle popolazioni di cellule amacrine. Eccitazione a due fotoni permette ad alta risoluzione ed elevato contrasto di immagini anche da parti più profonde del tessuto 17, un prerequisito per il targeting preciso e di successo patch-bloccaggio delle cellule in particolare nel INL con la sua alta densità di corpi cellulari.
La retina del mouse isolato è praticabile per 3-4 ore in condizioni sperimentali. Se la retina secondo è conservato nella più completa oscurità sotto gas CarboGen continuo, mantiene il colore viola di fotopigmento greggi e può essere utilizzato dopo aver terminato gli esperimenti con la retina per primo. In principio, intese a promuovere l'cella selezionata con la micropipetta in wholemount retina è un po 'impegnativo e richiede una certa pratica, soprattutto quando si lavora al buio. Tra cui un colorante fluorescente in micropipetta può semplificare la procedura, perché cellulare e micropipetta sono visibili sotto eccitazione a due fotoni, allo stesso tempo. Tuttavia, l'aggiunta di componenti per la soluzione intracellulare può impedire la formazione di gigaseal o causare la qualità di registrazione a soffrire. Una volta realizzato con successo, una buona registrazione può durare per circa 1 h.
Considerando che la luce di eccitazione a infrarossi è di per sé scarsamente assorbita dal fotorecettori retinici, eccitato GFP che esprimono le cellule emettono luce nella parte visibile dello spettro. Tuttavia, fluorofori sono eccitati solo in un piccolo volume focale che non è destinata a cambiare la condizione di adattamento della retina. Tanto più, l'eccitazione è necessaria solo per il targeting e può essere spento durante la registrazione di risposte luce.
Il usefulness di questo approccio è già dimostrato da studi su popolazioni di cellule amacrine 14,18 da cui registrazioni elettrofisiologiche altrimenti sarebbe stata possibile solo per caso 12. Infine, questa potente tecnica può essere ulteriormente esteso includendo un approccio farmacologico 14, Ca 2 + 19 o immagini utilizzando cellule iniettate per gli studi di immunocitochimica e microscopia elettronica. In questo modo, la posizione funzionale di un tipo di cellula di cui i circuiti della retina possono essere svelati.
Disclosures
Topi sono stati trattati e sacrificati in conformità alle direttive istituzionali per il benessere degli animali e le leggi sulla sperimentazione animale emessi dal governo tedesco.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 a KD e RW). Siamo grati a Thomas Eulero (Töbingen, Germania) per la luce QDS software stimolazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Night-vision goggles | Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany | Xtron F1 | includes a 800 nm light source |
| Optical filter | Schott AG | RG9 | longpass filter with cutoff at 690 nm |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | curved with 22 mm blade |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | straight with 3 mm blade |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | 200-100 500 0180 type A(TC) | Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182) |
| Flow heater | Multi Channel System MCS GmbH | PH01, TC01 | heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller |
| Laser scanning microscope | Leica Microsystems | DM LFS | controlled by Leica Confocal Software |
| Air table | Newport Corp. | VH 3036W-OPT | |
| Laser | Newport Corp. | Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser | |
| CCD camera | pco AG, Kelheim, Germany | PixelFly QE | including control software |
| Micropipette glass capillaries | Hilgenberg, Malsfeld, Germany | 1408411 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | fluorescent dye |
| Neurobiotin | Axxora | VC-SP-1120-M050 | non-fluorescent tracer |
| Streptavidin-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | 210-100 000 0010 | motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5 |
| Patch-clamp amplifier | npi electronic | SEC-05LX npi | |
| Digitizer | National Instruments | BNC-2090 | |
| Data acquisition software WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/ software.htm | |
| Visual stimulus generator QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Germany | has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor) | |
| Neutral density filters | ITOS, Mainz, Germany |
References
- Masland, R. H.
- Baccus, S. A. Timing and computation in inner retinal circuitry. Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neuroscience. 160, 126-139 (2009).
- Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. Genetic address book for retinal cell types. Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells. Nature. 418, 845-852 (2002).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Plenum Press. (1995).
- Jackson, M. B. Whole-cell voltage clamp recording. Current Protocols in Neuroscience. Gerfen, C. , Wiley. (1997).
- Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pfügers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).
- Yuste, R., Konnerth, A. maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (2005).
- Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).
- Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development. J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).
- Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice. J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).
- Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina. Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).
- Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).
- Denk, W., Detwiler, P. B. Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).
