Summary
Bu makale, tek tek hücrelerin sağlam fare retinada floresan etiketli nöron popülasyonları kayıt gösteriyor. Iki foton kızılötesi uyarma kullanarak transgenetically etiketli hücreleri ışık tepkileri, açık alan özellikleri, ve morfoloji çalışması için patch-klemp kayıt için hedef alındı.
Abstract
Fizyolojik özellikleri ve sağlam doku belirli nöronların sinaptik bağlantıların incelenmesi göze çarpan morfolojik özellikleri olmayan ya da düşük bir nüfus yoğunluğu bu hücreler için bir meydan okuma. Bu durum özellikle, retina amacrine hücreleri, memeliler 1 kabaca 30 alt tipi oluşturan internöronlar son derece çok şekilli bir sınıf için geçerlidir . Görsel işleme retina çıkış 2 şekillenmesinde çok önemli bir parçası olmanın rağmen bu hücrelerin bir kayıt elektrodu ile karşılaşan nadir bir olay olduğundan, bu alt tiplerinin çoğu artık işlevsel bir bağlamda çalışılmıştır değil.
Son zamanlarda, bir çok transgenik fare hatları kullanılabilir ifade floresan membran reseptörlerine ya da belirli bir doku 3,4 nöronların sadece bir alt kümesini özel enzimler için yararlanıcı grupların kontrolü altında yeşil floresan proteini (GFP) gibi belirteçler . Bu ön-işaretli hücrelerin bu nedenle accessible in situ fizyolojik özelliklerinin sistematik çalışma izin mikroskobik kontrolü altında hedef yönettiği mikroelektrot. Ancak, floresan belirteçlerin uyarma canlı doku için fototoksisite riski eşlik eder. Retina, bu yaklaşımın ek olarak uyarma ışık fotoreseptörlerin uygun stimülasyon neden olduğu, böylece photopigment inflicting ağartma ve ışık adapte retina devreler transfer sorunu bir engel teşkil etmektedir. Bu sakıncaları femtosecond aralığı kısa darbeler bir mod-kilitli lazer tarafından teslim kızılötesi uyarma kullanarak üstesinden. İki foton uyarma fluorofor uyarma için yeterli enerjiyi sağlar ve aynı zamanda küçük bir doku hacmi fotohasar 5 tehlikeleri en aza indirmek için uyarma kısıtlar. Ayrıca, kızılötesi ışık (850 nm) sadece kötü photopigments 6 tarafından emilir beri görsel uyaranlara duyarlı retina bırakır.
"jove_content"> in situ kayıtlarında elektrofizyolojik ulaşmak için bir transgenik fare retinanın kullanımını göstermek GFP ifade görsel iki foton uyarma tarafından hedef hücreleri . Retina hazırlanan ve karanlıkta tutulan ve mikroskop (Şekil 1) kondenser yoluyla tahmin edilmektedir optik uyaranlara maruz olabilir. Boya dolgu morfolojisini ortaya çıkarmak için, hedef hücre farklı deneysel düzeylerde ele böylece, komşu hücreler için kaplin boşluğu kavşağı-aracılı boya kontrol etmek için ışık yanıtları Patch-klemp kayıt ile kombine edilebilir.
Protocol
Aşağıdaki açıklama, deneyci, retina yapısı, patch-kelepçe kayıt, ve iki-foton mikroskopi temel bir anlayış olduğunu varsayar. Patch-kelepçe kurulum ve iki foton görüntüleme sistemi kurmak ve işletmek konusunda yararlı bilgiler için refs [7-12].
1. Hayvan ve doku hazırlama
- Fare, en az 3 saat süreyle karanlığa uyumlu tutun Bu arada, carbogen ile gazla oluşan ekstrasellüler çözüm 1-2 l (mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 1 CaCl 2, 1.6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glukoz hazırlamak ve pH 7.4 'e dengelenmesi oda sıcaklığında (% 5 O 2 CO 2). bir
- CO 2 doz aşımı servikal dislokasyon ile hava geçirmez bir odasında fare Euthanize. Bu prosedür ve aşağıdaki adımları karanlıkta yapılmalıdır. Uzun dalga boyu loş aydınlatma (690 nm-longpas soğuk ışık kaynağı kısa dalga boylarında blok kullanın.hayvanın gözleri koyu (fareler sadece ışık tayfının kırmızı bölümüne kötü bir vizyona sahip) adapte tutarak filtre) kişisel vizyonu desteklemek için. Zifiri karanlığa kullanımı (> 800 nm) kızılötesi aydınlatma çalışmaları ve gece görüş gözlüğü kullanınız.
- Kavisli iris makası çifti ve ekstrasellüler çözüm diseksiyon mikroskobu altında yerleştirilen bir tabak aktarabilirsiniz aydınlatmak gözler.
- Kornea ve bir çift yaylı makas (ilk delmek için kesim için bir başlangıç noktası bir neşter kullanmak) ora serrata (retina ve siliyer cisim arasındaki sınır) birlikte göz ampul açarak siliyer cisim çıkarın. Lens ve retina pigment epiteli dikkatle ayırın. Retinanın yönünü incelemek için önemli ise, Ref gibi göstermektedir [12]. Kes retina pigment epiteli arasında optik sinir ve retina Göz yuvası kaldırmak. Retina yüzeylerin yönde Not: kıvrılmış retinanın iç Gangliyon pil tarafı; dış fotoreseptör tarafı.
- Vitreus iç retina yüzeyinde bir kürdan yardımı ile yavaşça çekerek çıkarın. Bu amaçla, sadece retinanın küçük bir hacim kaplayan ekstrasellüler çözüm kullanın. Vitreus kürdan sopa ve retina kapalı savurma sürüklenebilir. Sonra, doku düzleştirme kolaylaştırmak için retina çevresince kısa kesiler geçerlidir.
- Cam taban üzerine yaymak (biz ince bir fırça kullanın), paslanmaz çelik bir naylon sinirli çerçeve ile hareketsiz, kayıt odasının aşağı fotoreseptör tarafı retina aktarın. Aynı şekilde ikinci retina hazırlayın ve daha sonra kullanmak için carboxygenated ekstrasellüler çözüm koyu adapte tutmak.
2. Kayıtlar
- Dik bir lazer tarama mikroskop altında karanlıkta kayıt odası yükleyin ve (sürekli retina hazırlık superfuse en az 5 ml / micarboxygenated ekstrasellüler çözüm n) 35 ° C'ye kadar ısıtılır Mikroskop (bir kızılötesi hassas CCD kamera ile donatılmıştır) elektronik koruma için bir Faraday kafesi içinde bir şok emici hava tablo yer almaktadır. Kafes, karanlıkta hazırlık tutmak için şeffaf olmayan bir perde ile kaplayın. Ayrıca, bilgisayar monitörleri ışık kapalı kırmızı şeffaf film ekran.
- Mod-kilitli duruma geçiş, GFP ifade hücreleri görselleştirmek için iki foton uyarma, kızılötesi lazer 850-870 nm ya da daha uzun dalga boylarında ayarlayın. Floresan hücre net olarak tanınması için yeterli bir derece için lazer tarama yazılımı tarafından kontrol nötral yoğunluk filtreleri kullanarak lazer çıktı zayıflatır.
- Oluşan hücre içi çözüm (mM) 125 K-glukonat, 10 KCl, 0.5 EGT dolu akım kelepçe modunu kullanmak cam mikropipetler yama klemp kayıtları (borosilikat cam tüp 1,5 mm dış çapında ve 0,225 mm et kalınlığı)KOH (M yaklaşık 5 pipet direnç veren) ile pH 7.4 'e titre, 10 Hepes. Voltaj-klemp kayıt gibi diğer deneysel koşullar altında, farklı bir çözüm gerektirdiğini unutmayın. Boya enjeksiyonları istenirse, floresan bir prob (10 mM Alexa Fluor 594) veya bir izleme molekülü (3% Neurobiotin) ekleyin. Mikropipet yuvaya yerleştirin ve referans elektrot (klorlu gümüş tel) kayıt odasında ekstraselüler çözümü ile temas halinde olduğundan emin olun.
- Mikropipet basınç uygulayın ve hedef GFP-eksprese eden hücre (40 kat su altında kalacak hedefi, NA 1.25). Amacrine hücre gövdeleri iç nükleer tabakanın proksimal parçası (hazırlık içinde yaklaşık 55-75 mikron derin) ganglion hücre tabakası (doğrudan retinanın yönde yüzeyinin altında) hem de bulunmaktadır. Hedeflenen hücre, iç limitan membran (glial endfeet yapılmış bir kılıf) ile retina mikropipet temasa geçmeden önceyüzeyine nüfuz olmak zorundadır. Başarılı penetrasyon mikropipet ucundan dışarı sürülür ve IR CCD kamera tarafından yakalanan bir kızılötesi görüntü görülebilir olarak altta yatan retina dokusunun iç sınırlayıcı zarı ayırır intrasellüler çözümü ile tanınır.
- IR CCD kamera kayıt mikropipet konumunu gösteren resim ile iki foton görüntü soma pozisyonu karşılaştırarak istediğiniz hücreye Yaklaşım. GFP-eksprese eden hücre mikropipet doğru yönlendirmek için kızılötesi görüntü kabul etmek gerekir, çünkü bu adımı kolayca elde olmadığına dikkat edin ve biraz pratik gerektirir. Doğru hedefleme mikropipet ucu iki foton görüntü görülebilir hücre yüzeyinin dimpling neden olduğunda elde edilir. Bu yönteme alternatif olarak, iki foton görüntü mikropipet konumunu ortaya çıkarmak için intrasellüler çözüm floresan boya kullanın (örneğin, Alexa Fluor 594, 100 mcM). İki foton kızılötesi uyarım bu boya mikropipet ayırt yapmak için yeterli floresan sağlar. Bu amaçla, lazer tarama yazılımı kırmızı floresan de kapsayacak şekilde algılama aralığı ayarlayın.
- Mikropipet baskısı bırakın ve akım kelepçe modunda bir bütün hücre patch-klemp yapılandırma almak. Kullanılabilir bir kayıt, bir zar potansiyeli -50 ile -55 mV ve en azından 20 dakika için son vermelidir.
- Bir bilgisayar monitörü stimülasyon yazılım (QDS: Thomas Euler, Tübingen Üniversitesi, Almanya) 11 tarafından oluşturulan Mevcut görsel uyaranlara . Stimülasyon kaydedilen hücre merkezli mekansal konumunu ayarlayın: IR CCD kamera ve merkezi bir nokta gibi uyaran üzerine iletim görüntü gösteren monitör hücre pozisyonunu işaretleyin. Işın yoluna nötral yoğunluk filtreleri takarak uyaran yoğunluğunu ayarlayın. Ref [14] monitör spektrum ve yoğunluk kalibrasyonu için bkz. Prolonge seçind interstimulus aralığı (örneğin 15 s) uyum önlemek için. Uyaran zamanlama kaydını tutmak için bir ışın yolu içinde fotodiyot ekleyin.
- Stimülasyon protokolü başlatın ve hafif yanıtları (5 kHz-spike olmayan hücreler için filtreleme ile 10 kHz örnekleme oranı kullanır; başak kayıt için 20 kHz gibi yüksek bir örnekleme oranı tavsiye edilir) kayıt. Kayıt yazılımı tetiklemek için ışık uyarımı yazılımı kullanın.
- Boya için dolgu hücre mikropipet dikkatle geri çekilmeden önce, 30-45 dakika süreyle kayıtlı hücreye floresan ajan diffüz izin. Hücre gövdesinden dışarı çekmeye özen gösterin. Floresan olmayan tracer Neurobiotin kullanılmış olsaydı, bir fluorofor konjuge streptavidin (4 gece boyunca streptavidin Cy3, 1:400 ° C bağlanarak görselleştirme ihtiyaçlarını retina paraformaldehid fiksasyon 20 dakika sonra, boya-kaplin çalışmaları streptavidin inkübasyon) 3 d uzatılabilir. Alternatif olarak, enjeksiyonlar da yapılabilir.boya kazığa hücre (0,25-1 nA, 100 ms aralığı 100 ms, toplam süre 3-6 dk dikdörtgen darbeler) iontophoretically tahrik keskin elektrot (M 100).
3. Temsilcisi Sonuçlar:
Aşağıdaki sonuçlar bir fare üzerinde yapılan bir çalışmada tirozin hidroksilaz 13,14, katekolamin sentezini adım (: GFP fare TH) hız sınırlama katalize enzim organizatörü altında yeşil floresan proteini (GFP) ifade kaynaklanan. GFP sinyal iki farklı hücre popülasyonlarının parlaklık dayanarak ayırt edilebilir (Şekil 2A). Yüksek GFP düzeyde eksprese eden hücrelerin (GCL, Şekil 2B), iç nükleer tabaka (INL, Şekil 2A) bulunan ya da ganglion hücre tabakası yerinden hücre bedenlere sahip ve iç pleksiform tabakasının ortasında tabakalandırmak (IPL, Şekil 2C) . Tip 2 hücreler 14-16 olarak tespit edildi ve morfolojisi açısından sistematik olarak incelenmiştir (Şekil 3) ve seçme olabilirrical aktivite (Şekil 4), nüfus yoğunluğu 250 hücre / mm 2 miktarda bile.
Şekil 1. Deney düzeneği şematik. İki foton uyarma (kırmızı noktalı ışık yolu) fluorofor ifade sağlam retina hücre görsel bir mikropipet (yeşil emisyon ışık yolu) hedeflemektedir. Retinanın, mikroskop (sarı ışık yolu) kondansatör aracılığıyla yansıtılan optik uyaranlara maruz kalır ve hücresel ışığı yanıtları kaydedildi.
Şekil 2. GFP ifade TH bir retina flatmount hücreleri: GFP fare. Zayıf floresan (A, ok) gösteren INL bulunan tip 1 hücrelerinin (DA hücreleri) ve yoğun etiketli tip 2 hücreleri iki nüfus GFP sinyal parlaklık tarafından ayırt edilebilir.INL (A, oklara bakın) veya GCL (B) ve IPL stratum S3 (C) dendritik tabakalaşma yerinden ya hücre organları ile. Ölçek barlar, 50 mikron.
Şekil 3 tracer Neurobiotin enjekte tip 2 hücre morfolojisi. Tracer sonradan streptavidin Cy3 bağlama (eflatun) tarafından görüntülendi. GFP sinyal (yeşil) tasvir mikrografı, görüntü yığınlarının GCL ve IPL kapsayan bir projeksiyon. Ölçek çubuğu, 50 mm.
Şekil 4. GCL bulunan bir tip 2 hücre Işık cevapları. Tepki desen scotopic aralığında artan yoğunluğu beyaz ışık tam saha aydınlatma. Stimulus yoğunluğu çubuk (Rh * / çubuk / s), saniyede ortalama photoisomerizations verilir. 3 sn uzun bir uyaran daha iyi farklı için kullanılanyanıtı uyaran başlangıcı bileşenleri (tepki ON) ve (kapalı yanıtı) ofset iyon.
Discussion
Bu yöntem, retinanın adaptasyonel durumu etkileyen görsel rehberliği altında sağlam retina belirli nöronların elektriksel özellikleri çalışma imkanı sunuyor. Özellikle şu anda hücreleri oldukça kötü amacrine hücrelerinin çoğu popülasyonları gibi düşük nüfus yoğunluğu nedeniyle eğitim karakterizasyonu için uygundur. İki foton uyarma, 17 doku derin kısımlarında, hassas hedefleme için önkoşul ve başarılı hücrelerin özellikle hücre gövdeleri, yüksek yoğunluklu INL yama-sıkma. Bile yüksek çözünürlüklü ve yüksek kontrastlı görüntü izin
Izole fare retina deneysel koşullar altında 3-4 saat için geçerli. Ikinci retina sürekli carbogen gazlama altında tamamen karanlıkta saklanan ise, ağartılmamış photopigment mor rengini korur ve ilk retina ile deneyler bitirdikten sonra kullanılabilir. Başlangıçta, hedeflemeKaranlıkta çalışmak, özellikle de retina wholemount mikropipet ile seçili hücre biraz zorlu ve bazı pratik gerektirir. Aynı zamanda hücre ve mikropipet iki foton uyarma altında görünür çünkü mikropipet bir floresan boya dahil olmak üzere, prosedürü kolaylaştırmak. Ancak, hücre içi bir çözüm için bileşenler ekleyerek gigaseal oluşumunu engelleyen veya kayıt kalitesini acı neden olabilir. Bir kez başarıyla, iyi bir kayıt yaklaşık 1 saat sürebilir
Oysa kendisi sadece kötü kızılötesi uyarma ışığı retina fotoreseptör tarafından emilir, heyecanlı, GFP ifade spektrumun görünür hücrelerin ışık yayarlar. Ancak, fluorophores sadece retinanın adaptasyonel durumu değiştirmek olası değildir küçük bir odak hacmi heyecan duyuyoruz. Daha fazla, uyarım sadece hedefleme için gereklidir ve ışık yanıtların kayıt sırasında kapatılabilir.
Usefulnbu yaklaşımın ess zaten belirli populasyonlar üzerindeki elektrofizyolojik kayıtlar sadece kaza 12 ile aksi mümkün olurdu hangi amacrine hücreleri 14,18 çalışmalar ile gösterilmiştir. Son olarak, bu güçlü teknik bir farmakolojik yaklaşım 14, Ca 2 + görüntüleme 19 dahil ederek ya da enjekte edilen hücrelerin immünositokimyasal çalışmaları veya elektron mikroskobu kullanarak daha uzatılabilir. Bu şekilde, belirli bir hücre tipi retina devresi fonksiyonel pozisyonda sökülmüş olabilir.
Disclosures
Fare ele ve hayvan refahı için kurumsal kurallar ve hayvan deneyleri Alman hükümeti tarafından çıkarılan kanunları uyarınca ötenazi edildi.
Acknowledgments
Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (KD ve RW WE849/16 1 / 2) tarafından desteklenmiştir. Biz ışık uyarımı yazılım QDS Thomas Euler (Töbingen Almanya) teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Night-vision goggles | Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany | Xtron F1 | includes a 800 nm light source |
| Optical filter | Schott AG | RG9 | longpass filter with cutoff at 690 nm |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | curved with 22 mm blade |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | straight with 3 mm blade |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | 200-100 500 0180 type A(TC) | Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182) |
| Flow heater | Multi Channel System MCS GmbH | PH01, TC01 | heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller |
| Laser scanning microscope | Leica Microsystems | DM LFS | controlled by Leica Confocal Software |
| Air table | Newport Corp. | VH 3036W-OPT | |
| Laser | Newport Corp. | Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser | |
| CCD camera | pco AG, Kelheim, Germany | PixelFly QE | including control software |
| Micropipette glass capillaries | Hilgenberg, Malsfeld, Germany | 1408411 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | fluorescent dye |
| Neurobiotin | Axxora | VC-SP-1120-M050 | non-fluorescent tracer |
| Streptavidin-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | 210-100 000 0010 | motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5 |
| Patch-clamp amplifier | npi electronic | SEC-05LX npi | |
| Digitizer | National Instruments | BNC-2090 | |
| Data acquisition software WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/ software.htm | |
| Visual stimulus generator QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Germany | has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor) | |
| Neutral density filters | ITOS, Mainz, Germany |
References
- Masland, R. H.
- Baccus, S. A. Timing and computation in inner retinal circuitry. Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neuroscience. 160, 126-139 (2009).
- Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. Genetic address book for retinal cell types. Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells. Nature. 418, 845-852 (2002).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Plenum Press. (1995).
- Jackson, M. B. Whole-cell voltage clamp recording. Current Protocols in Neuroscience. Gerfen, C. , Wiley. (1997).
- Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pfügers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).
- Yuste, R., Konnerth, A. maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (2005).
- Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).
- Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development. J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).
- Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice. J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).
- Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina. Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).
- Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).
- Denk, W., Detwiler, P. B. Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).
