Summary
Denne artikkelen viser innspillingen av individuelle celler fra fluorescensmerket merket neuronal populasjoner i intakt mus netthinnen. Ved å bruke to-foton infrarøde eksitasjon transgenetically merkede cellene var målrettet for patch-clamp opptak for å studere deres lys reaksjoner, mottagelig feltegenskaper, og morfologi.
Abstract
Å studere fysiologiske egenskaper og synaptiske forbindelser av spesifikke nerveceller i intakt vev er en utfordring for de cellene som mangler iøynefallende morfologiske egenskaper eller vise en lav befolkningstetthet. Dette gjelder særlig retinal amacrine celler, en usedvanlig mangfoldig gruppe interneurons som utgjør omtrent 30 undertyper hos pattedyr 1. Selv være en avgjørende del av visuell prosessering ved å forme den retinal utgang 2, har de fleste av disse subtypene ikke blitt studert til nå i en funksjonell sammenheng, fordi møter disse cellene med et opptak elektrode er en sjelden hendelse.
Nylig er et mangfold av transgene mus linjer tilgjengelig som uttrykker fluorescerende markører som grønne fluorescerende protein (GFP) under kontroll av arrangører for membran reseptorer eller enzymer som er spesifikke for bare en undergruppe av nevroner i et gitt vev 3,4. Disse pre-merkede cellene er derfor accessible til rettet microelectrode targeting henhold mikroskopiske kontroll, tillater systematisk studie av deres fysiologiske egenskaper in situ. Imidlertid er eksitasjon av fluorescerende markører ledsaget av risikoen for fototoksisitet for de levende vev. I netthinnen, er denne tilnærmingen tillegg hemmet av problemet som eksitasjon lys forårsaker passende stimulering av fotoreseptorene, og dermed påføre photopigment bleking og overføre retinal kretser inn en lett-tilpasset tilstand. Disse ulempene er løst ved å bruke infrarøde eksitasjon levert av en modus-låst laser i korte pulser av femtosecond rekkevidde. To-foton eksitasjon gir energi nok for fluoroforen eksitasjon og samtidig begrenser eksitasjon til en liten vev volum minimere farene ved photodamage 5. Dessuten etterlater det netthinnen mottakelig for visuelle stimuli siden infrarødt lys (> 850 nm) er bare dårlig absorbert av photopigments 6.
in situ opptak fra GFP-uttrykke celler som er visuelt rettet av to-foton eksitasjon. Netthinnen er utarbeidet og vedlikeholdes i mørket og kan bli utsatt for optiske stimuli som projiseres gjennom kondensatoren av mikroskopet (Figur 1). Patch-clamp registrering av lys responser kan kombineres med fargestoff fylling å avsløre morfologi og for å se etter gap junction-mediert dye kopling til nabocellene slik at målcellen kan ved å studere på forskjellige eksperimentelle nivåer.
Protocol
Den følgende beskrivelsen forutsetter at eksperimentator har en grunnleggende forståelse av netthinnens struktur, patch-clamp opptak, og to-foton mikroskopi. For nyttig informasjon om å etablere og drive en patch-clamp setup og to-foton imaging system se dommerne [7-12].
1. Animal og vev forberedelse
- Hold musen mørk tilrettelagt for minst 3 h. I mellomtiden forbereder 1-2 l av ekstracellulært løsning bestående av (i mm) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 2 CaCl, 1.6 2 MgCl, 25 3 NaHCO, 10 D-glukose og likevekt det til pH 7,4 ved gassing med carbogen (5% CO 2 i O 2) ved romtemperatur. en
- Avlive musen i en lufttett kammer av CO 2 overdose etterfulgt av cervikal forvridning. Denne prosedyren og følgende trinn skal utføres i mørket. Bruk dim lang bølgelengde belysning (vi blokkere korte bølgelengder fra en kald lyskilde med en 690 nm-longpaser filter) for å støtte personlig visjon samtidig dyrets øyne mørke-tilpasset (mus bare har dårlig syn i den røde delen av lysspekteret). For arbeid i stummende mørke bruke infrarød belysning (> 800 nm) og slitasje nattsynbriller.
- Enucleate øynene med et par av buet iris saks og overføre dem til en rett av ekstracellulært løsning plassert under en dissekere mikroskop.
- Fjern hornhinnen og ciliarkropp ved å åpne øyet pære langs ora serrata (grensen mellom netthinnen og ciliarkropp) med et par av våren saks (vi først bruke en lansett til å pierce et utgangspunkt for skjæring). Ta ut linsen og nøye skille netthinna fra pigment epitelet. Hvis orienteringen av netthinnen er avgjørende for å studere dine, indikerer det som i Ref [12]. Skjær den optiske nerve mellom netthinnen og pigment epitelet og fjerne netthinnen fra eyecup. Merk retning av retinal overflater: innsiden av krøllet opp netthinnen er ganglion cell side; utsiden er fotoreseptoren side.
- Fjern glasslegemet fra de indre retinal overflaten ved å trekke det forsiktig ut ved hjelp av en tre tannpirker. For dette formålet, bruke en liten mengde av ekstracellulært løsning som bare dekker netthinnen. Den glasslegemet holder seg til tannpirker og kan dras centrifugally av netthinnen. Deretter gjelder kort snitt langs retinal omkretsen å lette utflating av vevet.
- Overfør netthinnen i opptaket kammeret fotoreseptoren-side ned, spre det ut på glasset bunnen (vi bruker en fin børste) og immobilize den med en nylon-strung ramme av rustfritt stål. Forbered andre netthinnen på samme måte og holde det mørkt-tilpasset i carboxygenated ekstracellulært løsning for senere bruk.
2. Recordings
- Installer innspillingen kammeret i mørket under en oppreist laser scanning mikroskop og superfuse retinal forberedelse kontinuerlig (ikke mindre enn 5 ml / min) med carboxygenated ekstracellulære Løsningen varmes til 35 ° C. Mikroskopet (også utstyrt med en infrarød-sensitive CCD kamera) ligger på en støtdempende luft bord inne i et Faraday bur for elektronisk skjerming. Dekk buret med en ikke-transparent gardin for å holde forberedelse i mørket. Vi har også skjerm av lys fra dataskjermer med rød transparent film.
- Tune den infrarøde laser til 850-870 nm eller lengre bølgelengder, bytte til mode-låst tilstand, og bruke to-foton eksitasjon å visualisere GFP-uttrykke celler. Dempe laserutskrifter med nøytral tetthet filter kontrolleres av laser scanning programvare ned til en grad som er akkurat tilstrekkelig for klar anerkjennelse av den fluorescerende celle
- For patch-clamp opptak i dagens-clamp modus bruke glass mikropipetter (vi bruker borsilikatglass rør med 1,5 mm ytre diameter og 0.225 mm veggtykkelse) fylt med intracellulære løsning bestående av (i mm) 125 K-gluconate, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, titrert til pH 7,4 med KOH (gir en pipette motstand på ca 5 MΩ). Merk at andre eksperimentelle forhold som spennings-clamp registrering krever en annen løsning. Hvis fargestoff injeksjoner er ønskelig, legge til en fluorescerende probe (vi bruker 10 mm Alexa Fluor 594) eller en tracer molekyl (3% Neurobiotin). Sett mikropipette i holderen og sørge for at referansen elektrode (klorerte sølv wire) er i kontakt med ekstracellulære løsningen i innspillingen kammeret.
- Legge trykk på mikropipette og målrette en GFP-uttrykker celle (vi bruker en 40-fold nedsenking i vann objektiv; NA 1.25). Amacrine celle organer ligger i ganglion celle lag (rett under overflaten i den aktuelle retningen på retina) samt i den proksimale del av den indre kjerne lag (ca 55-75 mikrometer dypt inne utarbeidelse). Før mikropipette kontakt med målrettede cell, den indre begrensende membran (en slire laget av glial endfeet) på retinalOverflaten må være penetrert. Vellykket penetrasjon er anerkjent av intracellulære løsning som er drevet ut fra mikropipette spissen og løsner den indre begrense membranen fra den underliggende retinal vev som kan observeres på en infrarød overføring er fanget opp av IR-CCD-kamera.
- Approach ønsket celle ved å sammenligne soma posisjon fra de to-foton bilde med bildet av IR-CCD-kamera som viser plasseringen av opptaket mikropipette. Merk at dette trinnet ikke er enkelt å oppnå og krever litt øvelse, fordi GFP-uttrykke celle er å bli anerkjent i infrarød overføring bildet for å dirigere mikropipette mot det. Riktig målgruppe er oppnådd når mikropipette spissen årsakene dimpling på celleoverflaten som kan ses i de to-foton bilde. Alternativ til denne prosedyren, kan du bruke et fluorescerende fargestoff (f.eks Alexa Fluor 594, 100 mM) i den intracellulære løsningen for å avsløre mikropipette posisjon i to-foton bilde. To-foton infrarød eksitasjon gir tilstrekkelig fluorescens av denne fargestoff for å gjøre mikropipette merkbar. For dette formålet, juster deteksjonsområde i laser scanning programvare for å dekke også rød fluorescens.
- Slipp press fra mikropipette og få en hel-cell patch-clamp konfigurasjon i dagens-klemme-modus. Et brukbart opptak bør gi en membran potensial -50 til -55 mV og vare i minst 20 min.
- Present visuelle stimuli skapt av en stimulering programvare (vi bruker QDS av Thomas Euler, Universitetet i Tübingen, Tyskland) 11 på en dataskjerm. Juster den romlige plasseringen av stimulering til å være sentrert på den innspilte cell: Merk cellen posisjon på skjermen som viser overføring bildet av IR-CCD-kamera og sentrum en plass-aktig stimulus på den. Tune den stimulus intensitet ved å sette inn nøytral tetthet filter inn i strålen banen. For kalibrering av monitor spektrum og intensitet se Ref [14]. Velg et prolonged interstimulus intervall (f.eks 15 s) for å unngå tilpasning. Inkluder en fotodiode innenfor strålingsbanen å holde oversikt over stimulus timing.
- Start stimulering protokollen og registrere lyset svar (vi bruker en samplingsfrekvens på 10 kHz med filtreringen ved 5 kHz for ikke-spiking celler, for pigg innspilling en høyere samplingsfrekvens som 20 kHz er anbefalt). Bruk lyset stimulering programvare for å utløse opptaket programvare.
- For fargestoff fylle la den fluorescerende agenten diffuse i den innspilte celle i 30-45 min før du forsiktig trekke den mikropipette fra cellen. Pass på å ikke trekke ut cellen kroppen. Hvis den ikke-fluorescerende tracer Neurobiotin ble brukt, må den visualisering ved binding til streptavidin konjugert til et fluoroforen (vi bruker streptavidin-Cy3, 1:400 over natten ved 4 ° C etter 20 min Paraformaldehyde fiksering av netthinnen, for dye-kobling studier streptavidin inkubering kan forlenges til 3 d). Alternativt kan injeksjoner også utføres medskarp elektroder (> 100 MΩ) når fargestoff er drevet iontophoretically inn i Impaled celle (rektangulære pulser: 0,25 til 1 nA, 100 ms, intervall 100 ms, total tid 3-6 min).
3. Representant Resultater:
Følgende resultater stammer fra en studie på en mus som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under arrangøren for tyrosin hydroksylase 13,14, enzymet katalyserende det hastighetsbegrensende trinnet i katekolaminer syntese (TH:: GFP mus). Basert på lysstyrken for GFP-signal to distinkte celle populasjoner er gjenkjennelig (Figur 2A). Celler som uttrykker GFP høyere nivå besitter celle organer ligger i indre kjernefysiske lag (INL, figur 2A) eller fordrevet i ganglion celle lag (GCL, figur 2B) og stratify i midten av det indre plexiform lag (IPL, figur 2C) . De ble identifisert som type 2 celler 14-16 og kunne systematisk bli studert med hensyn til morfologi (Figur 3) og utvalgterical aktivitet (figur 4), selv om dens befolkningstettheten utgjør bare til 250 celler / mm 2.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av det eksperimentelle oppsettet. To-foton eksitasjon (stiplede røde lys bane) fluoroforen-uttrykke celler i intakte netthinnen gjør visuell targeting av en mikropipette (grønn utslipp lys sti). Netthinnen er utsatt for optiske stimuli projiseres gjennom kondensatoren av mikroskopet (gult lys bane), og cellulære lette svar er registrert.
Figur 2. GFP-uttrykker cellene i netthinnen flatmount av TH:: GFP mus. To populasjoner kan være preget av lysstyrken for GFP-signal: type 1 celler (DA celler) ligger i INL viser svak fluorescens (A, se pilspisser) og intenst merket type 2 cellermed celle organer enten i INL (A, se pilene) eller fordrevet i GCL (B) og en dendrittiske lagdeling i stratum S3 av IPL (C). Scale barer, 50 mikrometer.
Figur 3. Morfologi av en type 2 celler injisert med tracer Neurobiotin. Den tracer ble deretter visualiseres med streptavidin-Cy3 binding (magenta). Den micrograph, som også skildrer GFP signal (grønn), er en projeksjon av Bildestakker dekker GCL og IPL. Scale bar, 50 mikrometer.
Figur 4. Lys svar av en type 2 celle ligger i GCL. Reaksjonsmønster til hvitt lys full-feltet belysning av økende intensitet i scotopic rekkevidde. Stimulus intensiteten er gitt i photoisomerizations per stang per sekund (Rh * / stang / s). En langvarig stimuli av 3 s ble brukt for bedre distinkteion av responsen komponentene ved stimulus onset (ON respons) og offset (OFF respons).
Discussion
Denne metoden gir mulighet til å studere elektriske egenskapene til spesifikke nevroner i intakt netthinnen i henhold til visuell veiledning uten å påvirke adaptational tilstanden på netthinnen. Det er spesielt egnet for karakterisering av celler som er i dag ganske dårlig studert på grunn av lav befolkningstetthet som de fleste bestandene av amacrine celler. To-foton eksitasjon tillater høy oppløsning og høy kontrast bildebehandling selv fra dypere deler av vevet 17, en forutsetning for nøyaktig målretting og vellykket patch-klemming av celler spesielt i INL med sin høye tetthet av celle organer.
Den isolerte musen netthinnen er levedyktig i 3-4 h under eksperimentelle forhold. Hvis den andre netthinnen er lagret i stummende mørke under kontinuerlig carbogen gassing, beholder den lilla fargen ubleket photopigment og kan brukes etter endt eksperimenter med den første netthinnen. I begynnelsen rettet motvalgt celle med mikropipette i retinal wholemount er litt utfordrende og krever litt øvelse, spesielt når du arbeider i mørket. Inkludert et fluorescerende fargestoff i mikropipette kan forenkle prosedyren, fordi celle og mikropipette er synlige under to-foton eksitasjon samtidig. Imidlertid kan legge til komponenter til den intracellulære løsningen vanskeliggjøre gigaseal formasjon eller føre til at opptakskvaliteten til å lide. Etter vellykket oppnådd, kan en god innspilling vare i ca 1 t.
Mens den infrarøde eksitasjon lyset i seg selv er bare dårlig absorbert av retinal fotoreseptorene, begeistret GFP-uttrykker cellene avgir lys i den synlige delen av spekteret. Imidlertid er fluorophores glade bare i en liten fokal volum som sannsynligvis ikke vil endre adaptational tilstanden på netthinnen. Alle de mer, eksitasjon er bare nødvendig for målretting og kan slås av under innspillingen av lys svar.
Den usefulness med denne tilnærmingen er allerede demonstrert av studier på bestemte populasjoner av amacrine celler 14,18 som elektrofysiologiske opptak ellers ville ha vært mulig bare ved et uhell 12. Endelig kan denne kraftige teknikken ytterligere utvides ved å inkludere en farmakologisk tilnærming 14, 2 Ca + bildebehandling 19 eller ved å bruke injiseres celler for immunocytochemical studier eller elektron mikroskopi. På den måten kan den funksjonelle plasseringen av en gitt celletype i retinal kretsene være unravelled.
Disclosures
Mus ble håndtert og avlives i henhold til institusjonelle retningslinjer for dyrevelferd, og lovene om dyreforsøk utstedt av den tyske regjeringen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 til KD og RW). Vi er takknemlige til Thomas Euler (Töbingen, Tyskland) for lys stimulering programvaren QDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Night-vision goggles | Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany | Xtron F1 | includes a 800 nm light source |
| Optical filter | Schott AG | RG9 | longpass filter with cutoff at 690 nm |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | curved with 22 mm blade |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | straight with 3 mm blade |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | 200-100 500 0180 type A(TC) | Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182) |
| Flow heater | Multi Channel System MCS GmbH | PH01, TC01 | heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller |
| Laser scanning microscope | Leica Microsystems | DM LFS | controlled by Leica Confocal Software |
| Air table | Newport Corp. | VH 3036W-OPT | |
| Laser | Newport Corp. | Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser | |
| CCD camera | pco AG, Kelheim, Germany | PixelFly QE | including control software |
| Micropipette glass capillaries | Hilgenberg, Malsfeld, Germany | 1408411 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | fluorescent dye |
| Neurobiotin | Axxora | VC-SP-1120-M050 | non-fluorescent tracer |
| Streptavidin-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | 210-100 000 0010 | motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5 |
| Patch-clamp amplifier | npi electronic | SEC-05LX npi | |
| Digitizer | National Instruments | BNC-2090 | |
| Data acquisition software WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/ software.htm | |
| Visual stimulus generator QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Germany | has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor) | |
| Neutral density filters | ITOS, Mainz, Germany |
References
- Masland, R. H.
- Baccus, S. A. Timing and computation in inner retinal circuitry. Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neuroscience. 160, 126-139 (2009).
- Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. Genetic address book for retinal cell types. Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells. Nature. 418, 845-852 (2002).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Plenum Press. (1995).
- Jackson, M. B. Whole-cell voltage clamp recording. Current Protocols in Neuroscience. Gerfen, C. , Wiley. (1997).
- Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pfügers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).
- Yuste, R., Konnerth, A. maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (2005).
- Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).
- Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development. J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).
- Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice. J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).
- Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina. Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).
- Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).
- Denk, W., Detwiler, P. B. Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).
