Summary
이 문서는 그대로 마우스 망막에서 찬란 태그의 연결 인구에서 각각의 세포의 녹음을 묘사. 두 광자 여기 적외선을 사용하여 transgenetically 라벨이 세포들은 빛의 반응, 수용 필드 속성 및 형태학을 연구하기 위해 패치 - 클램프 녹음 대상으로했다.
Abstract
생리적 속성과 손상 조직에서 특정 뉴런의 시냅스 연결을 공부하는 것은 눈에 형태학의 기능이 부족하거나 낮은 인구 밀도를 보여 이들 세포에 대한 도전이다. 이것은 특히 망막 amacrine 세포, 포유류 1 약 30 subtypes을 구성 interneurons의 매우 여러 가지 모양의 클래스에 적용됩니다. 기록 전극 이러한 세포가 발생하는 것은 드문 경우이기 때문에 망막 출력 2 형성하여 영상 처리의 중요한 부분이되고 있지만, 이러한 subtypes의 대부분은 지금 기능 맥락에서까지 연구되지 않았습니다.
최근 유전자 변형 마우스 라인의 다수가 사용할 수 막 수용체 또는 특정 조직 3,4에서 뉴런의 하위 집합만와 관련된 효소에 대한 발기인의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)와 같은 표현 형광 마커. 이러한 사전 분류 전지 따라서 accessibl 아르현장에서 생리 속성의 체계적인 연구를 허용, 미세한 통제 대상으로 이동 microelectrode 전자. 그러나, 형광 마커 여기는 살아있는 조직에 대한 phototoxicity의 위험이 동반됩니다. 망막에서이 접근 방법은 또한 여기 빛이 따라서 photopigment을 가하 표백하고 가벼운 적응 상태로 망막 회로를 전송, photoreceptors의 적절한 자극을 일으키는 문제로 방해합니다. 이러한 단점은 femtosecond 범위의 짧은 펄스의 모드 잠금 레이저로 전달되는 적외선 여기를 사용하여 극복할 수 있습니다. 두 광자 여기는 형광단에 여기에 대한 충분한 에너지를 제공하고 동시에 photodamage 5 위험을 최소화 작은 조직 볼륨 여기를 제한합니다. 적외선은 (> 850 nm의) 만 제대로 photopigments 6 흡수되기 때문에 또한, 그것은 시각적 자극에 반응하는 망막을 떠납니다.
현장 레코딩에 electrophysiological 달성하기 위해 유전자 변형 마우스 망막의 사용 보여줍니다 GFP를 표현하는 시각 두 광자 여기에 의한 타겟 세포를. 망막은 준비하고 어둠 속에서 유지 관리 및 현미경의 콘덴서 (그림 1)를 통해 예상 아르 광학 자극을 받다 수있다. 빛의 반응 패치 - 클램프 녹음 염색은 형태를 공개하여 대상 세포에 의해 다른 실험적인 수준에서 공부를 할 수 있도록 이웃 세포에 결합 간격 접합 - 중재 염료를 확인하기 위해 작성과 함께하실 수 있습니다.
Protocol
다음 설명은 실험자가 망막 구조, 패치 - 클램프 기록하고, 두 광자 현미경의 기본적인 이해를 가지고 있다고 가정합니다. 패치 - 클램프 설치 및 두 광자 이미징 시스템을 구축하고 실행에 대한 유용한 정보를 참조 심판 [7-12].
1. 동물 및 조직 준비
- 마우스가 적어도 3 시에 대한 어두운 적응 유지 carbogen와 가스에 의해 그 사이에 구성된 세포외 용액 1-2 L (MM)를 125 NaCl, 2.5 KCl, 1 CaCl 2, MgCl 2 1.6, 25 NaHCO 3, 10 D - 포도당을 준비하고 산도 7.4에 평형 상온에서 (5 % O 2 2 CO).
- 자궁 경부 전위 다음 CO 2 과다 복용에 의한 공기 꽉 챔버에 마우스를 안락사. 이 절차는 다음과 같은 단계를 어둠 속에서 수행되어야합니다. 희미한 긴 파장 조명을 (우리가 690 NM - longpas하여 차가운 광원에서 짧은 파장을 차단 사용동물의 눈 (생쥐는 빛의 스펙트럼의 붉은 부분에 가난한 비전을 가지고) 어두운 적응 유지하면서의 필터는) 개인의 비전을 지원합니다. 완전한 암흑 사용 적외선 조명 (> 800 nm의)에서 일을하고 야간 시력 고글을 착용하십시오.
- 곡선 홍채 가위의 쌍을과 해부 현미경으로 세포 배치 솔루션의 요리에게 전달 명백히하다 눈.
- 스프링 가위 (우리가 처음 피어스로 절단을위한 출발점 랜싯 사용)와 ORA의 serrata (망막 및 모양체의 경계)를 따라 눈 전구를 열어 각막과 모양체를 제거합니다. 렌즈를 꺼내 조심스럽게 안료 상피에서 망막을 분리. 망막의 방향이 공부하는 데있어 매우 중요합니다면, 심판에 원하는 표시 [12]. 망막 및 안료 상피 사이의 광학 신경을 잘라 세안 컵에서 망막를 제거합니다. 망막 표면의 방향을주의 : 드러 업 망막의 안쪽은 gangl입니다이온 전지 측면, 외부 photoreceptor 측입니다.
- 부드럽게 나무 이쑤시개의 도움으로 밀어하여 안쪽 망막 표면에서 유리체를 제거합니다. 이러한 목적으로 그냥 망막을 커버 세포외 용액의 작은 볼륨을 사용합니다. 유리체 이쑤시개로 단어는 망막에서 centrifugally 끌어올 수 있습니다. 다음, 조직 납작 촉진하기 위해 망막 주변을 따라 짧은 incisions를 적용합니다.
- 유리 바닥에 그것을 밖으로 확산 (우리가 좋은 브러쉬를 사용)과 스테인레스 스틸의 나일론 - 중독 프레임으로 고정, 녹음 챔버 다운 photoreceptor 사이드로 망막을 전송합니다. 같은 방법으로 두 번째 망막을 준비하고 나중에 사용하기 위해 carboxygenated 세포외 용액에 어두운 적응 유지.
2. 녹음
- 직립 레이저 스캐닝 현미경 어둠 속에서 녹음 챔버를 설치하고 (계속 망막 준비를 superfuse 없습니다 미만 5 ML / MIcarboxygenated 세포외 솔루션과 n은) 35 ° C.에 가열 현미경은 (또한 적외선에 민감한 CCD 카메라가 장착된) 전자 차폐를위한 패러데이 케이지 내부에 충격 흡수와 공기 테이블에 위치해 있습니다. 어둠 속에서 준비를 유지할 수있는 비 투명 커튼과 함께 새장을 커버. 우리는 또한 붉은 투명 필름으로 컴퓨터 모니터에서 빛을 해제 화면.
- 모드 잠금 상태로 전환하고, GFP - 표현 세포를 시각화하는 두 광자 여기를 사용하여 적외선 레이저 850-870 nm의 이상 파장에를 조정. 형광 세포의 명확한 인식만을위한 충분한 정도 레이저 스캐닝 소프트웨어 다운 제어 중성 농도 필터를 사용하여 레이저 출력을 감쇠
- 구성 세포 용액 (MM)를 125 K - 글루 콘 산, 10 KCl, 0.5 EGT 가득한 전류 클램프 모드 사용 유리 micropipettes에 패치 - 클램프 녹음 (우리가 1.5 mm 외경과 0.225 mm 벽 두께의 borosilicate 유리 튜브 사용)에 대한코이 (MΩ 약 5 피펫 저항을주는)와 산도 7.4로 titrated, 10 HEPES. 전압 - 클램프 기록 같은 다른 실험 조건이 다른 솔루션을 필요로합니다. 염료 주사가 필요한 경우에는 형광 프로브 (우리가 10 MM 알렉사 형석 594를 사용) 또는 추적 분자 (3 % Neurobiotin)을 추가합니다. 홀더에 micropipette를 삽입하고 기준 전극 (염소화 실버 와이어)가 기록 챔버에서 세포외 용액과 접촉되어 있는지 확인합니다.
- micropipette에 압력을 적용 대상 GFP - 표현 셀 (우리는 40 배 물 침지 목표를 사용, NA 1.25). Amacrine 세포 기관은 내부 핵 레이어의 근위 부분 (준비 시간 약 55-75 μm의 깊이)의 신경절 세포 레이어 (직접 망막의 현재 방향의 표면 아래)뿐만 아니라 위치하고 있습니다. 망막에서 대상 셀, 내부 제한 멤브레인 (glial endfeet 만든 칼집)와 micropipette에 문의하기 전에표면 침투되어야한다. 성공적인 침투는 micropipette 팁에서 밖으로 구동 및 IR - CCD 카메라에 의해 촬영된 적외선 전송 이미지 관찰 수 있듯이 기본 망막 조직에서 내부 제한 멤브레인를 분리합니다 세포내 솔루션으로 인식됩니다.
- 기록 micropipette의 위치를 보여주는 IR - CCD 카메라의 사진 두 광자 이미지에서 소마 위치를 비교하여 원하는 세포에 접근한다. GFP - 표현 세포가 방향 micropipette을 직접하기 위해 적외선 전송 이미지 인식되어야하기 때문에이 단계를 쉽게 얻을하지 않습니다과 연습이 필요합니다. micropipette 팁은 두 광자 그림에서 볼 수있는 세포 표면의 dimpling 발생했을 때 정확한 타겟팅은 이루어진다. 이 절차에 대안, 두 광자 이미지의 micropipette 위치를 나타내기 위해 세포내 솔루션에 형광 염료 (예 : 알렉사 형석 594, 100 μm의)를 사용. 두 광자 적외선 여기는 micropipette이보고 알 수있는 수 있도록이 염료의 충분한 형광을 허용합니다. 이런 목적을 위해, 또한 붉은 형광을 충당하기 위해 레이저 스캐닝 소프트웨어의 탐지 범위를 조정합니다.
- micropipette에서 압력을 해제하고 전류 클램프 모드에서 전체 세포 패치 - 클램프 구성을 얻습니다. 사용 가능한 녹음 멤브레인 -50으로 -55 뮤직 비디오의 잠재력과 적어도 20 분 지난를 제공해야합니다.
- 컴퓨터 모니터에 자극 소프트웨어 (우리는 토마스 오일러, 튀빙겐 대학, 독일 QDS를 사용하여) 11 만든 현재 시각 자극. 기록된 세포를 중심으로하는 자극의 공간적 위치를 조정 : IR - CCD 카메라와 센터링에 자리 같은 자극의 전송 이미지를 보여주는 모니터의 셀 위치를 표시한다. 빔 경로로 중성 농도 필터를 삽입하여 자극 강도를 조정. 모니터 스펙트럼과 강도의 보정을위한 참조 [14]을 참조하십시오. prolonge을 선택D interstimulus 간격 (예 : 15들) 적응을 피할 수 있습니다. 자극 타이밍의 기록을 유지하기 위해 전송 경로 내에서 photodiode을 포함합니다.
- 자극 프로토콜을 시작하고 가벼운 답변을 (우리가 아닌 요동 치고 세포 5 kHz에서에서 필터링 10 kHz에서의 샘플링 속도를 사용하여, 스파이크 녹음 20 kHz에서와 같은 높은 샘플링 속도를 권장합니다) 기록합니다. 레코딩 소프트웨어를 실행하는 빛의 자극 소프트웨어를 사용합니다.
- 색소 세포에서 micropipette 신중 retracting하기 전에 30-45 분 기록 세포에 형광 에이전트 확산을하게 작성. 세포 시체를 밖으로 뽑아 안됩니다. 비 형광 추적 Neurobiotin을 사용했다면, 그것은 (우리가 4 박 이상의 streptavidin - Cy3, 1:400을 사용 ° C 형광단에 복합 streptavidin에 바인딩하여 시각화가 필요 망막의 20 분 paraformaldehyde 고정 후, 염료 커플링에 대해 연구 streptavidin 보육이) 3 D로 연장하실 수 있습니다. 또한, 주사도 함께 수행할 수염료가 찔려 죽은 세포 (0.25-1 NA, 100 MS, 간격 100 MS, 총 시간 3-6 분 직사각형 펄스)로 iontophoretically 구동됩니다 날카로운 전극 (MΩ> 100).
3. 대표 결과 :
다음 결과는 티로신 hydroxylase 13,14, 카테 합성의 단계를 (: : GFP 마우스 TH) 제한 속도를 catalyzing 효소에 대한 모터 아래에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 마우스에 대한 연구에서 발생한. GFP 신호 별개의 두 세포 집단의 밝기에 따라 (그림 2A) 구분됩니다. 높은 GFP 수준을 표현 전지 (GCL, 그림 2B)의 내부 핵 계층 (INL, 그림 2A)에 위치하거나 신경절 세포 레이어에 있질 세포 기관을 가지고 있으며 (IPL, 그림 2C) 내부 plexiform 계층의 중간에 계충화하다 . 그들은 제 2 형 세포 14-16으로 확인되었으며 체계적 형태에 관한 연구 (그림 3)과 선출 수rical 활동 (그림 4)의 인구 밀도는 250 세포 / mm 2 금액에도 불구하고.
그림 1. 실험 설정의 도식 표현. 의 2 광자 여기 (빨간색 점선 빛의 경로) 형광단 - 표현 그대로 망막에있는 세포를하는 것은 가능 시각 micropipette (녹색 방출 광 경로)에 의해 타겟팅. 망막은 현미경 (노란색 조명 경로)의 콘덴서를 통해 투사 광 자극에 받게되며, 셀룰러 가벼운 응답이 기록됩니다.
그림 2. GFP - 표현 TH의 망막에있는 세포를 flatmount : GFP의 마우스. 약한 형광을 (A, 화살촉 참조) 보여주는 INL에 위치한 제 1 형 세포 (DA 세포)와 강렬한 라벨 제 2 형 전지 : 두 집단은 GFP 신호의 밝기로 구분할 수INL (A, 화살표 참조) 또는 GCL (B)와 IPL의 지층 S3 (C)에 돌기 충화에 있질 중 세포 시체. 스케일 바, 50 μm의.
그림 3. 추적기 Neurobiotin로 주입 2 형 세포의 형태론. 추적은 streptavidin - Cy3 바인딩 (마젠타)에 의해 연속적으로 시각되었습니다. 또한 GFP 신호 (녹색)를 묘사하는 현미경은, GCL와 IPL을 다루는 이미지 스택의 투영이다. 스케일 바, 50 μm의.
그림 4. GCL에있는 제 2 형 세포의 빛 반응. scotopic 범위에서 증가하고 강도의 하얀 빛을 전체 필드에 조명에 반응 패턴. 자극 강도는 초당로드 (RH * /로드 / s)의 당 photoisomerizations에 있습니다. 3 s의 장기간 자극이 더 뚜렷한을 위해 사용되었다응답 자극 시작될 때 구성 요소 (반응) 및 (응답 OFF) 오프셋의 이온.
Discussion
이 방법은 망막에 adaptational 상태에 영향을 미치는없이 영상지도하에 손상 망막에서 특정 뉴런의 전기적 특성을 연구하기위한 가능성을 제공합니다. 그것은 특히 다소 저조한 amacrine 세포의 대부분의 인구와 같은 낮은 인구 밀도로 인해 공부를 현재에있어 세포의 특성에 적합합니다. 두 광자 여기도 조직 17 깊은 부분, 정확한 타겟팅을위한 전제 조건과 성공적인 패치 - 클램핑 특히 세포 기관의 높은 밀도와 INL의 세포.에서 높은 해상도와 높은 명암 영상을 허용
분리된 마우스 망막의 실험 조건 하에서 3-4 H를 위해 가능한 것입니다. 두 번째 망막이 지속 carbogen의 가스 하에서 완전한 어둠에 저장되어있다면, 그것은 표백하지 않은 photopigment의 보라색 색상을 유지하고 처음으로 망막과 실험을 마치신 후 사용할 수 있습니다. 처음에는,를 대상으로망막 wholemount에 micropipette과 선택한 셀 어둠에서 근무 특히, 약간의 도전이며 연습이 필요합니다. 셀 및 micropipette가 동시에 두 광자 여기 아래에 표시되기 때문에 micropipette에 형광 염료를 포함시키는 것은 절차를 간소화하실 수 있습니다. 단, 세포내 솔루션 구성 요소를 추가하면 gigaseal 형성을 방해하거나 녹음 품질이 고통의 원인이 될 수 있습니다. 일단 성공적으로 달성, 좋은 녹음은 약 1 H. 지난 수
적외선 여기 가벼운 반면, 자체에만 제대로 망막 photoreceptors에 의해 흡수, 흥분 GFP - 표현 스펙트럼의 보이는 부분에 세포가 빛을 방출. 그러나, fluorophores은 망막의 adaptational 조건을 변경할 가능성이없는 작은 초점 볼륨에 흥분하고 있습니다. 모든 더 여기는 타겟팅에 필요한 빛과 반응 녹화 중에 꺼질 수 있습니다.
usefuln이 방법의 ESS는 이미 electrophysiological 녹음이 달리 오직 사고 12 가능했을있는 amacrine 세포 14,18의 특정 인구에 대한 연구에 의해 입증됩니다. 마지막으로,이 강력한 기술은 더욱 약리 접근 14, CA 2 + 영상 19를 포함하거나 immunocytochemical 연구 또는 전자 현미경에 대한 주입 세포를 사용하여 확장할 수 있습니다. 그 방법은, 망막 회로에 주어진 세포 유형의 기능적 위치 풀어하실 수 있습니다.
Disclosures
마우스는 처리과 기관 동물 복지 지침과 독일 정부에서 발급한 동물 실험에 대한 법률에 따라 euthanized되었다.
Acknowledgments
이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (KD와 RW에 WE849/16 1 / 2)에 의해 지원되었다. 우리는 빛의 자극 소프트웨어 QDS에 대한 토마스 오일러 (Töbingen, 독일)에 감사하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Night-vision goggles | Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany | Xtron F1 | includes a 800 nm light source |
| Optical filter | Schott AG | RG9 | longpass filter with cutoff at 690 nm |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | curved with 22 mm blade |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | straight with 3 mm blade |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | 200-100 500 0180 type A(TC) | Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182) |
| Flow heater | Multi Channel System MCS GmbH | PH01, TC01 | heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller |
| Laser scanning microscope | Leica Microsystems | DM LFS | controlled by Leica Confocal Software |
| Air table | Newport Corp. | VH 3036W-OPT | |
| Laser | Newport Corp. | Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser | |
| CCD camera | pco AG, Kelheim, Germany | PixelFly QE | including control software |
| Micropipette glass capillaries | Hilgenberg, Malsfeld, Germany | 1408411 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | fluorescent dye |
| Neurobiotin | Axxora | VC-SP-1120-M050 | non-fluorescent tracer |
| Streptavidin-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | 210-100 000 0010 | motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5 |
| Patch-clamp amplifier | npi electronic | SEC-05LX npi | |
| Digitizer | National Instruments | BNC-2090 | |
| Data acquisition software WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/ software.htm | |
| Visual stimulus generator QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Germany | has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor) | |
| Neutral density filters | ITOS, Mainz, Germany |
References
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