Summary
We beschrijven een techniek voor etikettering en het bijhouden van stamcellen met FDA-goedgekeurde, superparamagnetische ijzeroxide (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Deze cellulaire beeldvorming techniek die magnetische resonantie (MR) beeldvorming maakt gebruik van voor visualisatie, is gemakkelijk toegankelijk voor de lange termijn monitoring en diagnose van succesvolle of mislukte stamcellen engraftments bij patiënten.
Abstract
Stamceltherapieën bieden een aanzienlijk potentieel voor het gebied van regeneratieve geneeskunde. Moet echter nog veel worden begrepen ten aanzien van de in vivo kinetiek van getransplanteerde cellen. Een niet-invasieve methode om herhaaldelijk te controleren getransplanteerde stamcellen in vivo in staat zou stellen de onderzoekers om direct te controleren stamceltransplantaties en identificeren van succesvolle of mislukte implantatie resultaten.
Een breed scala van stamcellen nog steeds worden onderzocht voor talloze toepassingen. Dit protocol richt zich op drie verschillende stamcelpopulaties: humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen, humane mesenchymale stamcellen (hMSC) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen. HEK 293 cellen die afkomstig zijn van menselijke embryonale niercellen gekweekt in cultuur met geschoren adenovirus 5 DNA. Deze cellen worden op grote schaal gebruikt in onderzoek, omdat ze gemakkelijk gekweekt, groeien snel en zijn gemakkelijk getransfecteerd. hMSCs zijn te vinden in volwassen beenmerg. Deze cellen can worden gerepliceerd als ongedifferentieerde cellen met behoud van multipotent of de potentie om te differentiëren in een beperkt aantal van de cel lot. hMSCs kunnen differentiëren tot lineages van mesenchymale weefsels, waaronder osteoblasten, adipocyten, chondrocyten, pees-, spier-, en merg stroma. iPS cellen zijn genetisch geprogrammeerd volwassen cellen die zijn gewijzigd om genen en factoren die vergelijkbaar is met het definiëren van de eigenschappen van embryonale stamcellen uit te drukken. Deze cellen zijn pluripotent wat betekent dat ze de capaciteit hebben om te differentiëren in alle cellijnen 1. Zowel hMSCs en IPS-cellen hebben aangetoond weefsel regeneratieve capaciteit van in-vivo.
Magnetische resonantie (MR) beeldvorming in combinatie met het gebruik van superparamagnetische ijzeroxide (SPIO) nanodeeltjes cellen etiketten effectief bewezen in vivo volgen van stamcellen als gevolg van de nabije microscopische anatomische resolutie, een langere bloed half-life, dat toelaat longitudinale beeldvorming en de hoge sensitivity voor cel detectie door MR beeldvorming van SPIO nanodeeltjes 2-4. Daarnaast, MR beeldvorming met het gebruik van SPIOs is klinisch vertaalbaar. SPIOs zijn samengesteld uit een ijzeroxide kern met een dextran, carboxydextran of zetmeel oppervlakte laag die dient om de bioreactive ijzeren kern bevatten uit het plasma componenten. Deze agenten creëren lokale magnetische veld inhomogeniteiten die leiden tot een verminderde signaal op T2-gewogen MR beelden 5. Helaas zijn SPIOs niet meer geproduceerd worden. Tweede generatie, ultrakleine SPIOs (USPIO), bieden echter een levensvatbaar alternatief. Ferumoxytol (FerahemeTM) is een USPIO bestaat uit een niet-stoichiometrische magnetiet kern omgeven door een polyglucose sorbitol carboxymethylether vacht. De colloïdale, deeltjesgrootte van ferumoxytol is 17-30 nm, zoals bepaald door lichtverstrooiing. Het molecuulgewicht is 750 kDa, en de relaxatie constant op 2T MRI veld is 58.609 mM-1 sec-1 kracht 4. Ferumoxytol werd onlangs door de FDA goedgekeurde eens een ijzersupplement voor de behandeling van ijzergebrek bij patiënten met nierfalen 6. Onze groep heeft aangevraagd deze agent in een "off-label" te gebruiken voor mobiele toepassingen etikettering. Onze techniek demonstreert efficiëntie-etikettering van stamcellen met ferumoxytol die leidt tot significante MR-signaal effecten van gelabelde cellen op MR-beelden. Deze techniek kan worden toegepast voor niet-invasieve monitoring van stamcellen therapieën in pre-klinische en klinische settings.
Protocol
1. Dag 1
1) Plaat-cellen
- Plaat hMSC in een T75 kolf bij een confluentie van 80% ten minste 18-24 uur voorafgaand aan de etikettering. Zie tabel 1 voor de instructie voor alternatieve schepen.
2. Dag 2
2) Bereid de etikettering oplossing. Deze voorbereiding zal label een (1) T75 kolf bij 80% confluentie met een concentratie van 400 ug Fe / ml. Zie tabel 1 voor de instructie voor alternatieve schepen.
- Maak een oplossing (oplossing 1) door het mengen van 1 ml serum-vrij medium en 93,1 ul van ferumoxytol (voorraad: 30 mg / ml) in een 15 ml conische buis.
- Maak een tweede oplossing (oplossing 2) door het mengen van 1 ml serum-vrij medium en 7 pl van protamine sulfaat (voorraad: 10 mg / ml) in een seconde 15 ml conische buis.
- Kan elke oplossing 5 minuten rusten.
- Samen toe te voegen oplossingen 1 en 2. Meng de nieuwe etikettering oplossing. Laat de oplossing 5 minuten rusten tot USPIO-pro vergunningtamine sulfaat complexen te vormen.
- Voeg 5 ml serum-vrij medium om de mixed 2 ml van SPIO / protamine sulfaat oplossing voor een uiteindelijk volume van 7 ml.
3) Bereid cellen voor de etikettering
- Aspireren van de media uit de cellen.
- Voorzichtig een keer wassen cellen met 2-3 ml van voorverwarmde Mg / Ca-free D-PBS of serum-vrije media om weg te spoelen resterende serumeiwitten en of andere media componenten die contrastmiddel de opname en de etikettering efficiëntie zouden kunnen aantasten. Aspireren de spoel vloeistof.
4) Label-cellen
- Voeg de volledige 7 ml van de oplossing voor de etikettering van cellen.
- Plaats cellen in een incubator (37 ° C / 5% CO 2) en laat de cellen te incuberen in de etikettering oplossing voor 4 uur.
- Voeg 700 ul van FCS tot de etikettering oplossing van de cellen tot een uiteindelijke serum concentratie van 10% te bereiken. Serum wordt toegevoegd aan herstel van de verrijkte omgeving, waarvan de cellen zijn gewend, en om te helpen bij minimizing celdood die zou kunnen voortvloeien uit een abrupte verschuiving naar 24 uur blootstelling aan een serum-vrije omgeving.
- Laat de cellen om incuberen met de etikettering oplossing voor een extra 20 uur.
3. Dag 3
5) Bereid gelabelde cellen
- Aspireren de etikettering oplossing van cellen.
- Voorzichtig spoelen cellen met 2-3 ml van voorverwarmde Mg / Ca-free D-PBS. Aspireren de PBS. Het is belangrijk om Mg / Ca-vrij PBS te gebruiken als de Mg en Ca zal de efficiëntie van Trypsine aantasting in de volgende stap.
- Voeg 2 ml van de voorverwarmde 0,05% trypsine aan de cellen en kantel de fles heen en weer om het gehele oppervlak van de kolf te waarborgen is bedekt met een dun laagje van trypsine. Plaats de cellen in een incubator (37 ° C / 5% CO 2) en laat de cellen tot rust voor 5-7 minuten of tot cellen beginnen te los te maken van de plaat. Het kan nodig zijn om onthechting te bevestigen onder een microscoop. Tik zachtjes tegen de zijkanten van de kolf indien nodig facilitate cel-oppervlak van onthechting.
- Voeg 4 ml van voorverwarmde compleet media om de kolf aan het trypsine te neutraliseren. Voorzichtig spoel de kolf door pipetteren de trypsine / media / cel-oplossing op en neer meerdere malen. Verzamel de gehele oplossing in een 15 ml conische buis. Centrifugeer de cel oplossing bij 400 RCF gedurende 5 minuten.
- Voorzichtig het supernatans aspireren zonder de celpellet. Resuspendeer de cellen in 5 ml van de media (serum bevat of serum-vrij). Centrifugeer de cel oplossing bij 400 RCF gedurende 5 minuten.
- Herhaal de cel wassen beschreven in stap 5.5. In totaal zullen cellen worden gespoeld drie keer om resterende, vrij contrastmiddel te verwijderen in de media en op het oppervlak van cellen.
- Tellen cellen op dit punt om de meest accurate celgetal te bereiken, als cellen gaan verloren tijdens vorige wassen. Voer een levensvatbaarheid test van cellen. Cellen zijn nu klaar voor verdere analyse en of experimentele toepassing. MRI kan worden uitgevoerd met een T1-w en T2-w parameters, want hoewel ferumoxytol is een T2-w contrastmiddel, ferumoxytol ook vertoont T1 effecten. Representatieve T2-w MRI-parameters die gebruikt kunnen worden om de afbeelding ferumoxytol gelabelde cellen zijn onder andere: FSE of SE_Multislice sequenties met een TR van 2000-2500 ms en een TE van 60-80 ms. Tot verwerving van een T1-w beeld, verlagen de TE-waarde op een FSE-of SE_Multislice sequentie of gebruik een GRE sequentie met een hoge en een lage TR TE. Figuur 4 toont een mogelijke in-vivo-aanvraag voor het label stam cell imaging.
4. Representatieve resultaten:
Gelabelde cellen aan te tonen een significant donkerder of negatief contrast effect op de T2-gewogen MR beelden en een helder maken of positief effect op het contrast T1-gewogen MR beelden (figuur 2). Longitudinale MRI en de levensvatbaarheid van tests uitgevoerd 5 dagen na de etikettering geen significante MR-signaal en geen significante invloed op de levensvatbaarheid in vergelijking met ongelabelde controles (gegevens niet getoond) aangetoond.
jove_content "> Gelabelde stamcellen kunnen vervolgens worden onderscheiden in verschillende celtypes of intraveneus geïnjecteerd voor in vivo onderzoek.
Figuur 1. Schematische tijdlijn voor het labelen van stamcellen met ijzeroxide nanodeeltjes, ferumoxytol.
Figuur 2. MR beelden van sagittale doorsneden thrrough Eppendorf-buisjes met cellen in een cel pellet. A) Unlabeled controles. B) gelabelde cellen waaruit een significant T2 of negatief contrastmiddel effect op de T2-gewogen FSE of SE_Multislice beeldvorming en een T1 of positief contrastmiddel effect hebben op de T1-gewogen GRE volgorde.
Figuur 3. Sagittale doorsneden van Eppendorf buizen met cellen in cel PELlaat. Zo weinig als 10.000 ferumoxytol gelabelde cellen kan worden gedetecteerd via de T2-w MRI.
Figuur 4. MR visualisatie van ferumoxytol-gelabelde stamcellen geïnjecteerd in muizen-cerebrale ventrikels. A) Axiale, MR beeld van muizen Barin, zonder injectie van USPIO-gelabelde stamcellen. B) Axiale, C) coronale, en D) sagittale MR-beelden beeltenis van de T2, negatief contrast effect van USPIO-gelabelde stamcellen (witte pijlen) geïnjecteerd in een muis hersenen.
Tabel 1. Aantal aanpassingen voor de etikettering cellen in andere schepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verbetering van de effectiviteit van stamcellen engraftments is van cruciaal belang voor de vooruitgang van de regeneratieve geneeskunde. Een niet-invasieve visualisatie techniek voor stamcellen in vivo verhoogt aanzienlijk ons vermogen om de mechanismen die leiden tot een succesvolle innesteling resultaten te begrijpen. Magnetische etikettering voor MR visualisatie, zoals de procedure die wij hebben laten zien, laat in vivo volgen van stamcellen met MRI. Magnetisch gelabelde stamcellen eerder getransplanteerd in doel weefsels en zijn gevisualiseerd tot week met MRI 7. Op lange termijn etikettering en longitudinale beeldvorming is mogelijk dankzij de lysosomale stapelingsziekten van de ijzeroxide nanodeeltjes in de cellen 8. Uitdagingen, echter, in overeenstemming met een lange termijn monitoring van ijzer gelabelde cellen. Een van de uitdagingen in verband met longitudinale beeldvorming van ijzer gelabelde cellen is dat als gezonde, levensvatbare cellen woekeren het contrastmiddel wordt verspreid daughter cellen. Verdeling van het contrastmiddel de dochter van cellen is ongelijk en resulteert in een duidelijke verwateringseffect van het contrastmiddel in de tijd. Een tweede uitdaging geassocieerd met lange termijn monitoring van ijzer gelabelde cellen is het onderscheid tussen oorspronkelijk gelabeld, levensvatbare cellen tussen een ingezetene en fagocyten, zoals macrofagen, die mogelijk gefagocyteerd contrastmiddel vrijgelaten uit oorspronkelijk gelabeld, dode cellen 4. Onze groep heeft aangegeven de verschillen in de lange termijn signaal kinetiek van levensvatbare en apoptotische stamceltransplantaties, die waren gelabeld met ijzeroxide nanodeeltjes anders dan ferumoxytol 9-11. Toekomstige studies zijn nodig om te bepalen of deze beginselen ook van toepassing op ferumoxytol-gelabelde cel transplantatie.
Terwijl in dit onderzoek naar de mogelijke effecten ferumoxytol herkenbaarheid kan een expositie over de differentiatie capaciteit van stamcellen werd niet onderzocht, hebben eerdere studies aangetoond een SPIO dosisafhankelijk effect op de differendifferentiatie capaciteit en SPIO doses die geen afbreuk doen aan de differentiatie potentieel, wat suggereert, een ferumoxtyol dosis die geen afbreuk doet aan de differentiatie capaciteit van stamcellen kan ook bepaald worden 12, 13.
Grote SPIOs (hydrodynamische diameter> 50 nm) zijn eerder toegepast voor mobiele tracking doeleinden volgende stamcellen etikettering via diverse technieken, waaronder de etikettering eenvoudig incubatie en transfectie met elektroporatie of transfectie middelen zoals protamine, lipofectin en poly-L-lysine (PLL) 3 , 13-16., Hoewel het niet altijd nodig voor de cel-etikettering met SPIOs, transfectie methoden voor cel-etikettering zijn nuttig gebleken voor het vergemakkelijken van de etikettering en het verhogen van de etikettering efficiency 15. SPIOs die zijn gebruikt voor cel-etikettering, zijn echter niet meer wordt geproduceerd voor commerciële redenen. Ultrakleine SPIO (USPIO, hydrodynamische diameter <50 nm), zoals ferumoxytol, aan de andere kant nog steeds geproduceerdmaar vereisen de hulp van een transfectie middel om een efficiënte cellulaire opname acht te bereiken. Protamine sulfaat is een klinisch toepasbare transfectie-agent die complexen vormen met USPIOs tot fagocytische opname van het contrastmiddel te vergemakkelijken door stamcellen 17. De combinatie van FDA-goedgekeurde protamine sulfaat met de FDA-goedgekeurde USPIO, ferumoxytol, geeft de mogelijkheid voor klinische vertaling van stamcel-tracking technieken via off-label gebruik van dit middel. Van de nota, heeft ferumoxytol aangetoond een uitstekend veiligheidsprofiel in klinisch onderzoek 18. Directe visualisatie van de getransplanteerde cellen via een techniek die, zoals aangetoond dat men zou zorgen voor een beter begrip van de factoren die bevorderen of belemmeren een succesvolle stamceltransplantaties en helpen om de meest veelbelovende technieken voor klinische toepassingen te identificeren. Met het gebruik van klinisch toepasbare cel markers en beeldvormende apparatuur, deze beeldvormende techniek is in principe gemakkelijk toegankelijkvoor patiënten die stamceltransplantatie ondergaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle deelnemers aan deze studie bieden geen mededelingen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Nationaal Instituut van artritis en spier-en huidziekten: 3R01AR054458-02S2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | Or other base medium for desired stem cell line to be used |
| D-PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25300-120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Ferumoxytol (Feraheme) |
AMAG | 59338-0775-01 | |
| Protamine Sulfate | APP Pharmaceuticals | 22930 |
References
- Narsinh, K. H., Plews, J., Wu, J. C. Comparison of human induced pluripotent and embryonic stem cells: fraternal or identical twins? Mol Ther. 19, 635-638 (2011).
- Bulte, J. W. In vivo MRI cell tracking: clinical studies. AJR. Am. J. Roentgenol. 193, 314-325 (2009).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging. J. Vis. Exp. (13), e685-e685 (2008).
- Tallheden, T., Nannmark, U., Lorentzon, M. In vivo MR imaging of magnetically labeled human embryonic stem cells. Life. Sci. 79, 999-1006 (2006).
- Jung, C. W., Jacobs, P. Physical and chemical properties of superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil. Magn. Reson. Imaging. 13, 661-674 (1995).
- Coyne, D. W. Ferumoxytol for treatment of iron deficiency anemia in patients with chronic kidney disease. Expert. Opin. Pharmacother. 10, 2563-2568 (2009).
- Li, Z., Suzuki, Y., Huang, M. Comparison of reporter gene and iron particle labeling for tracking fate of human embryonic stem cells and differentiated endothelial cells in living subjects. Stem Cells. 26, 864-873 (2008).
- Metz, S., Bonaterra, G., Rudelius, M. Capacity of human monocytes to phagocytose approved iron oxide MR contrast agents in vitro. Eur. Radiol. 14, 1851-1858 (2004).
- Nedopil, A., Klenk, C., Kim, C. MR signal characteristics of viable and apoptotic human mesenchymal stem cells in matrix-associated stem cell implants for treatment of osteoarthritis. Invest. Radiol. 45, 634-640 (2010).
- Kraitchman, D. L., Heldman, A. W., Atalar, E. In vivo magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells in myocardial infarction. Circulation. 107, 2290-2293 (2003).
- Stuckey, D. J., Carr, C. A., Martin-Rendon, E. Iron particles for noninvasive monitoring of bone marrow stromal cell engraftment into, and isolation of viable engrafted donor cells from, the heart. Stem Cells. 24, 1968-1975 (2006).
- Henning, T. D., Sutton, E. J., Kim, A. The influence of ferucarbotran on the chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Contrast. Media. Mol. Imaging. 4, 165-173 (2009).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Kalish, H. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Nedopil, A. J., Mandrussow, L. G., Daldrup-Link, H. E. Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (38), e1793-e1793 (2010).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Wilson, L. B. Comparison of transfection agents in forming complexes with ferumoxides, cell labeling efficiency, and cellular viability. Mol Imaging. 3, 24-32 (2004).
- Babic, M., Horak, D., Trchova, M. Poly(L-lysine)-modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling. Bioconjug Chem. 19, 740-750 (2008).
- Golovko, D. M., T, H. enning, Bauer, J. S. Accelerated stem cell labeling with ferucarbotran and protamine. Eur. Radiol. 20, 640-648 (2010).
- Lu, M., Cohen, M. H., Rieves, D. FDA report: Ferumoxytol for intravenous iron therapy in adult patients with chronic kidney disease. Am. J. Hematol. 85, 315-319 (2010).
