Summary
Wir beschreiben eine Technik zur Kennzeichnung und Verfolgung von Stammzellen mit FDA-Zulassung, superparamagnetische Eisenoxid (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Diese zellulären bildgebendes Verfahren, das Magnetresonanz-(MR)-Bildgebung nutzt zur Visualisierung, ist leicht zugänglich für die langfristige Überwachung und Diagnose von Erfolg oder Misserfolg Stammzellen engraftments bei Patienten.
Abstract
Stammzell-basierte Therapien bieten erhebliches Potenzial für den Bereich der regenerativen Medizin. Dennoch bleibt noch viel zu verstehen in Bezug auf die in vivo Kinetik der transplantierten Zellen werden. Eine nicht-invasive Methode, um wiederholt zu überwachen transplantierten Stammzellen in vivo erlauben würde Ermittler direkt zu überwachen Stammzell-Transplantationen und identifizieren erfolgreiche oder erfolglose Transplantation Ergebnisse.
Eine breite Palette von Stammzellen weiterhin für unzählige Anwendungen untersucht werden. Dieses Protokoll konzentriert sich auf 3 verschiedenen Stammzell-Populationen: menschliche embryonale Nierenzellen 293 (HEK293-Zellen), humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). HEK 293 Zellen aus menschlichen embryonalen Nierenzellen in Kultur mit geschert Adenovirus 5 DNA gewachsen abgeleitet. Diese Zellen weit verbreitet sind in der Forschung eingesetzt, weil sie leicht kultiviert werden, wachsen schnell und sind leicht transfiziert. hMSCs sind bei erwachsenen Knochenmark gefunden. Diese Zellen ca.n als undifferenzierte Zellen repliziert werden unter Beibehaltung Multipotenz oder das Potential, in einer begrenzten Anzahl von Zellanlagen unterscheiden. hMSCs können Abstammungslinien von mesenchymalen Geweben, einschließlich Osteoblasten, Adipozyten, Chondrozyten, Sehnen, Muskeln und Knochenmarkstroma unterscheiden. iPS-Zellen sind genetisch adulten Zellen, die modifiziert wurden, um Gene und Faktoren ähnlich definierenden Eigenschaften von embryonalen Stammzellen umprogrammiert auszudrücken. Diese Zellen sind pluripotent dh sie haben die Fähigkeit, sich in allen Zelllinien 1 unterscheiden. Beide hMSCs und iPS-Zellen haben Tissue Regenerationsfähigkeit in-vivo demonstriert.
Magnetresonanztomographie (MRT) zusammen mit der Verwendung von superparamagnetischen Eisenoxid (SPIO) Nanopartikel-Zell-Labels haben sich für in vivo Verfolgung von Stammzellen aufgrund der Nähe mikroskopischen anatomischen Auflösung effektiv, erlaubt eine längere Blut-Halbwertszeit, die Längs-Bildgebung und die hohe sensitivity für Zell-Erkennung durch MR-Bildgebung von SPIO sofern Nanopartikel 2-4. Darüber hinaus ist der MR-Bildgebung mit dem Einsatz von SPIOs klinisch übersetzbar. SPIOs eines Eisenoxid-Kern mit einer Dextran, Carboxydextran oder Stärke Oberflächenbeschichtung, die den bioreaktiven Eisenkern aus dem Plasma-Komponenten enthalten dient zusammen. Diese Mittel schaffen lokale Magnetfeldinhomogenitäten, die zu einem verringerten Signal auf T2-gewichteten MRT-Bilder zeigen 5 führen. Leider sind SPIOs nicht mehr hergestellt. Zweite Generation, ultrakleinen SPIOs (USPIO), bieten jedoch eine gute Alternative. Ferumoxytol (FerahemeTM) ist eine USPIO einer nicht-stöchiometrischen Magnetit Kern durch eine Polyglucose Sorbit carboxymethylether Mantel umgeben sind. Die kolloidalen, Partikelgröße von ferumoxytol ist 17-30 nm durch Lichtstreuung bestimmt. Das Molekulargewicht beträgt 750 kDa, und die Relaxivität konstant bei 2T MRI Feld ist 58,609 mM-1 sec-1 Stärke 4. Ferumoxytol wurde vor kurzem von der FDA genehmigte eines ein Eisenpräparat zur Behandlung von Eisenmangel bei Patienten mit Nierenversagen 6. Unsere Gruppe hat dieses Mittel in einer "off label" Einsatz für die Zell-Kennzeichnung Anwendungen eingesetzt. Unsere Technik demonstriert eine effiziente Markierung von Stammzellen mit ferumoxytol, die zu erheblichen MR-Signal Auswirkungen der markierten Zellen auf MR-Bildern führt. Diese Technik kann für nicht-invasive Überwachung der Stammzelltherapie in der vorklinischen und klinischen Umgebungen eingesetzt werden.
Protocol
1. Tag 1
1) Platte Zellen
- Platte hMSC in einer T75-Kolben bei einer Konfluenz von 80% mindestens 18-24 Stunden vor der Markierung. Siehe Tabelle 1 für den Unterricht für alternative Fahrzeuge.
2. Tag 2
2) Bereiten Kennzeichnung Lösung. Diese Vorbereitung wird eine (1) T75-Kolben bei 80% Konfluenz mit einer Konzentration von 400 ug Fe / ml Etikett. Siehe Tabelle 1 für den Unterricht für alternative Fahrzeuge.
- Erstellen Sie eine Lösung (Lösung 1) durch Mischen von 1 ml Serum-freien Medien und 93,1 ul ferumoxytol (Bestand: 30 mg / ml) in einem 15 ml konischen Röhrchen.
- Erstellen Sie eine zweite Lösung (Lösung 2) durch Mischen von 1 ml Serum-freien Medien und 7 pl Protaminsulfat (Bestand: 10 mg / ml) in einem zweiten 15 ml konischen Röhrchen.
- Lassen Sie jede Lösung für 5 Minuten ruhen lassen.
- Add-Lösungen 1 und 2 zusammen. Vorsichtig mischen die neuen Kennzeichnungsvorschriften Lösung. Lassen Sie die Lösung für 5 Minuten ruhen lassen, um USPIO-pro erlaubenHistamin-Sulfat-Komplexe zu bilden.
- 5 ml Serum-freien Medien zu den gemischten 2 ml SPIO / Protaminsulfat-Lösung für ein Endvolumen von 7 ml.
3) Bereiten Zellen für die Etikettierung
- Saugen Sie die Medien aus den Zellen.
- Vorsichtig waschen Zellen einmal mit 2-3 ml vorgewärmten Mg / Ca-freien D-PBS oder Serum-freien Medien zu abspülen verbleibende Serumproteine und oder anderen Medien-Komponenten, die Kontrastmittelaufnahme und Kennzeichnung Effizienz beeinträchtigen könnten. Saugen Sie die Spülflüssigkeit.
4) Label-Zellen
- Fügen Sie die komplette 7 ml Lösung zur Kennzeichnung von Zellen.
- Legen Sie Zellen in einem Inkubator (37 ° C / 5% CO 2) und damit die Zellen bei der Kennzeichnung Lösung für 4 Stunden inkubiert.
- Add 700 ul FCS die Etikettierung Lösung der Zellen, um eine endgültige Konzentration im Serum von 10% zu erreichen. Serum zugesetzt wird, um die Wiederherstellung der angereicherten Umwelt, von denen die Zellen sind daran gewöhnt, und in mi unterstützennimizing Zelltod, die von einem abrupten Übergang zu 24 Stunden Exposition gegenüber einem Serum-freien Umgebung führen könnten.
- Lassen Sie die Zellen, die mit der Etikettierung Lösung für weitere 20 Stunden inkubiert.
3. Tag 3
5) Bereiten Sie markierten Zellen
- Saugen Sie die Kennzeichnung Lösung von Zellen.
- Vorsichtig spülen Zellen mit 2-3 ml vorgewärmten Mg / Ca-freien D-PBS. Saugen Sie die PBS. Es ist wichtig, Mg / Ca-freiem PBS Verwendung als Mg und Ca wird die Effizienz von Trypsin im nächsten Schritt zu beeinträchtigen.
- 2 ml vorgewärmten 0,05% Trypsin zu den Zellen und kippen Sie den Kolben hin und her, um die gesamte Oberfläche des Kolbens zu gewährleisten ist mit einer dünnen Schicht von Trypsin behandelt. Legen Sie die Zellen in einem Inkubator (37 ° C / 5% CO 2) und damit die Zellen für 5-7 Minuten oder ruhen, bis Zellen von der Platte lösen beginnen. Es kann notwendig sein, um Distanz unter einem Mikroskop zu bestätigen. Klopfen Sie leicht den Seiten des Kolbens, wenn notwendig, facilitate Zelloberflächen-Distanz.
- 4 ml vorgewärmten komplette Medien in den Kolben auf die Trypsin zu neutralisieren. Vorsichtig spülen Sie die Flasche mit einer Pipette die Trypsin / media / Zell-Lösung nach oben und unten mehrere Male. Sammeln Sie die gesamte Lösung in einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zell-Lösung bei 400 RCF für 5 Minuten.
- Vorsichtig absaugen den Überstand ohne die Zellpellet. Resuspendieren der Zellen in 5 ml Medium (Serum mit oder Serum-frei). Zentrifugieren Sie die Zell-Lösung bei 400 RCF für 5 Minuten.
- Wiederholen Sie die Zelle waschen in Schritt 5.5 beschrieben. Insgesamt werden Zellen dreimal gespült werden, um restliche, frei Kontrastmittel in den Medien und auf der Oberfläche der Zellen zu entfernen.
- Zählen von Zellen an dieser Stelle auf das genaueste Zellzahl zu erreichen, wie Zellen während der letzten Waschen verloren geht. Führen Sie eine Viabilitätstest von Zellen. Die Zellen sind nun bereit für die anschließende Analyse und oder experimentelle Anwendung. MR-Bildgebung mit T1-w durchgeführt werden und T2-w-Parameter, denn obwohl ferumoxytol ist ein T2-w-Kontrastmittel, ferumoxytol zeigt auch T1-Effekte. Vertreter T2-w MRT-Parameter, die Bild ferumoxytol markierten Zellen verwendet werden können: FSE oder SE_Multislice Sequenzen mit einer TR von 2000-2500 ms und einer TE von 60-80 ms. Zum Erwerb einer T1-w Bild, verringern Sie die TE-Wert auf einer FSE oder SE_Multislice Sequenz oder verwenden Sie einen GRE-Sequenz mit einer hohen TR und niedrige TE. Abbildung 4 zeigt eine mögliche in vivo-Anwendung für markierte Stammzelle Bildgebung.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Markierten Zellen zeigen eine deutliche Verdunkelung oder negativen Kontrast auf T2-gewichteten MRT-Bilder und eine Aufhellung oder positiven Kontrast auf T1-gewichteten MRT-Bilder (Abbildung 2). Längs der MR-Bildgebung und die Lebensfähigkeit Tests 5 Tage nach der Kennzeichnung keine signifikanten MR-Signal und keine signifikanten Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit im Vergleich zu unmarkiertem Kontrollen (Daten nicht gezeigt) nachgewiesen.
jove_content "> markierten Stammzellen können anschließend in verschiedene Zelltypen differenzieren oder intravenös in vivo Untersuchung injiziert.
Abbildung 1. Schematische Zeitplan für die Kennzeichnung Stammzellen mit Eisenoxid-Nanopartikel, ferumoxytol.
Abbildung 2. MR-Bilder des sagittalen Querschnitte thrrough Eppendorf-Röhrchen mit Zellen in einem Zell-Pellet. A) steuert Unlabeled. B) markierten Zellen zeigen eine deutliche T2 oder negative Kontrastmittel auf T2-gewichteten FSE oder SE_Multislice Bildgebung und eine T1-oder positive Kontrastmittel Effekt auf die T1-gewichteten GRE-Sequenz.
Abbildung 3. Sagittal Querschnitte der Eppendorf-Röhrchen mit Zellen in Zell-pelkönnen. So wenig wie 10.000 ferumoxytol markierten Zellen können über T2-w MRT erkannt werden.
Abbildung 4. MR Visualisierung von ferumoxytol-markierten Stammzellen in Mäuse-Hirnventrikel injiziert. A) Axial-, MR-Bild von murinen barin ohne Injektion von USPIO-markierten Stammzellen. B) Axial, C) koronal und D) sagittal MRT Darstellung des T2, negative dagegen Wirkung USPIO-markierten Stammzellen (weiße Pfeile) in einem murinen Gehirn injiziert.
Tabelle 1. Menge Anpassungen für die Markierung von Zellen in alternativen Gefäßen.
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Discussion
Verbesserung der Wirksamkeit von Stammzellen engraftments ist entscheidend für die Weiterentwicklung der regenerativen Medizin. Eine nicht-invasive Visualisierung Technik für Stammzellen in vivo signifikant verbessert unsere Fähigkeit, Mechanismen, die eine erfolgreiche Transplantation Ergebnissen führen verstehen. Magnetische Kennzeichnung für MR-Visualisierung, wie das Verfahren, das wir gezeigt haben, können in vivo Verfolgung von Stammzellen mit der MR-Bildgebung. Magnetisch markierte Stammzellen haben bisher in Zielgewebe transplantiert worden und wurden visualisiert bis zu Wochen mit der MR-Bildgebung 7. Langfristige Kennzeichnung und Längs-Bildgebung ist möglich durch die lysosomalen Speicherung der Eisenoxid-Nanopartikel in Zellen 8. Herausforderungen sind jedoch nicht mit langfristigen Überwachung der Eisen-markierten Zellen entsprechen. Eine Herausforderung mit Längs-Bildgebung von Eisen markierten Zellen verbunden ist, dass gesunde, lebensfähige Zellen vermehren sich das Kontrastmittel verteilt sich auf daughter-Zellen. Verteilung des Kontrastmittels auf Tochterzellen ist uneben und führt zu einer deutlichen Verwässerungseffekt des Kontrastmittels im Laufe der Zeit. Eine zweite Herausforderung mit langfristigen Überwachung der Eisen-markierten Zellen verbunden ist, zwischen ursprünglich gekennzeichnet, lebensfähigen Zellen aus Resident Phagozyten, wie Makrophagen, die phagozytiert freigegeben haben Kontrastmittel kann von ursprünglich gekennzeichnet, tote Zellen 4 unterscheiden. Unsere Gruppe hat Unterschiede in der langfristigen Signal Kinetik von lebensfähigen und apoptotischen Stammzelltransplantation, die mit Eisenoxid-Nanopartikel andere als ferumoxytol 9-11 worden war gekennzeichnet identifiziert. Zukünftige Studien sind erforderlich, um festzustellen, ob diese Grundsätze auch auf ferumoxytol-markierten Zelltransplantate gelten.
Während in dieser Studie die potenziellen Auswirkungen ferumoxytol Kennzeichnung auf die Differenzierung von Stammzellen wurde nicht untersucht aufweisen konnte, haben frühere Studien eine SPIO dosisabhängige Wirkung auf die differen gezeigtrenzierung Kapazität und SPIO Dosen, nicht beeinträchtigen Differenzierungspotential, was darauf hindeutet, ein ferumoxtyol Dosis, die nicht beeinträchtigt die Differenzierung von Stammzellen können auch 12, 13 bestimmt werden.
Große SPIOs (hydrodynamischen Durchmesser> 50 nm) wurden zuvor für die Zell-Tracking-Zwecke folgende Stammzellen Kennzeichnung über verschiedene Kennzeichnung Techniken einschließlich einfacher Inkubation und Transfektion mit Elektroporation oder Transfektion Mittel wie Protamin, Lipofectin und Poly-L-Lysin (PLL) 3 angewendet , 13-16., zwar nicht immer notwendig für die Markierung von Zellen mit SPIOs, Transfektion Methoden zur Markierung von Zellen haben sich als vorteilhaft erwiesen für die Erleichterung Kennzeichnung und Etikettierung zunehmende Effizienz 15. SPIOs die für die Zell-Kennzeichnung verwendet wurden, sind jedoch nicht mehr aus kommerziellen Gründen produziert. Ultrakleinen SPIO (USPIO, hydrodynamischen Durchmesser <50 nm), wie ferumoxytol, sind auf der anderen Seite noch immer produziertsondern bedarf der Hilfe eines Transfektionsagens effiziente zelluläre Aufnahme 8 zu erreichen. Protaminsulfat ist ein klinisch anwendbaren Transfektionsagens, dass Komplexe Formen mit USPIOs zu Phagozytose des Kontrastmittels durch Stammzellen 17 zu erleichtern. Die Kombination aus FDA-zugelassenen Protaminsulfat mit der FDA-Zulassung USPIO, ferumoxytol bietet das Potenzial für die klinische Übersetzung von Stammzell-Tracking-Techniken via off-label use dieses Mittels. Zu beachten ist, hat ferumoxytol ein ausgezeichnetes Sicherheitsprofil in klinischen Studien 18 gezeigt. Direkte Visualisierung der transplantierten Zellen über eine Technik, wie der Beweis wäre für ein besseres Verständnis der Faktoren, fördern oder beeinträchtigen erfolgreichen Stammzelltransplantationen und helfen, die vielversprechendsten Techniken für klinische Anwendungen zu identifizieren lassen. Mit dem Einsatz von klinisch anwendbaren Zellmarkern und bildgebende Geräte, ist diese bildgebenden Verfahren im Prinzip leicht zugänglichPatienten, die Stammzellen-Transplantationen unterziehen.
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Disclosures
Alle Mitwirkenden an dieser Studie bieten keine Meldungen vor.
Acknowledgments
3R01AR054458-02S2: Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des National Institute of Arthritis and Bewegungsapparates und Hautkrankheiten unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | Or other base medium for desired stem cell line to be used |
| D-PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25300-120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Ferumoxytol (Feraheme) |
AMAG | 59338-0775-01 | |
| Protamine Sulfate | APP Pharmaceuticals | 22930 |
References
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