Summary
אנו מתארים טכניקה תיוג ומעקב בתאי גזע עם ה-FDA, תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). זו טכניקת דימות הסלולר אשר מנצל מגנטית (MR) תהודה להדמיה, הוא נגיש לניטור ארוך טווח האבחנה של להצליח או להיכשל engraftments תא גזע לחולים.
Abstract
תא גזע טיפולים מבוססי להציע פוטנציאל משמעותי בתחום של רפואה רגנרטיבית. עם זאת, הרבה נשאר להיות מובן לגבי vivo ב קינטיקה של התאים המושתלים. שיטה לא פולשנית כדי לפקח שוב ושוב בתאי גזע המושתלים in vivo תאפשר לחוקרים ישירות לצג של השתלות מוח עצם ולזהות התוצאות engraftment להצליח או להיכשל.
מגוון רחב של בתאי גזע ממשיך להיחקר עבור יישומים רבים מספור. פרוטוקול זה מתמקד 3 אוכלוסיות תאים שונות גזע: כליה עובריים אנושיים 293 (HEK293) תאים, אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSC) ו המושרה גזע pluripotent (שב"ס) תאים. HEK 293 תאים שמקורם בתאי כליה עובריים אנושיים הגדלים עם תרבות ה-DNA טעון adenovirus 5. תאים אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקר כי הם בתרבית בקלות, לגדול במהירות והם transfected בקלות. hMSCs נמצאים במח מבוגר. תאים אלה can להיות משוכפל כמו תאים שלא עברו התמיינות, תוך שמירה על multipotency או פוטנציאל להתמיין למספר מצומצם של גורל התא. hMSCs יכול לבדל את שושלות של רקמות mesenchymal, כולל osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, גידים, שרירים, stroma מוח. תאים iPS הם reprogrammed גנטית תאים בוגרים ששונו לבטא גנים וגורמים דומים המאפיינים המגדירים של בתאי גזע עובריים. תאים אלה הם משמעות pluripotent יש להם את היכולת להתמיין לכל שושלות תאים 1. שני hMSCs ותאי iPS הוכיחו יכולת ההתחדשות רקמות ב-vivo.
תהודה מגנטית (MR) הדמיה יחד עם שימוש של תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIO) תוויות nanoparticle תא הוכיחו יעילות של מעקב vivo לתאי גזע בשל החלטה אנטומי ליד מיקרוסקופית, דם כבר מחצית החיים המאפשר הדמיה האורך ואת גבוה sensitivity לגילוי תאים הניתנים על ידי MR הדמיה של SPIO חלקיקים 2-4. בנוסף, MR הדמיה עם שימוש של SPIOs הוא לתרגום קלינית. SPIOs מורכבים הליבה תחמוצת ברזל עם מעיל dextran, carboxydextran או עמילן משטח המשמש להכיל את ליבת ברזל bioreactive מרכיבים פלזמה. סוכנים אלה יוצרים מקומיים inhomogeneities השדה המגנטי להוביל אות ירד ב T2 משוקלל תמונות MR 5. למרבה הצער, SPIOs הם כבר לא מיוצרים. הדור השני, ultrasmall SPIOs (USPIO), לעומת זאת, מציעים חלופה. Ferumoxytol (FerahemeTM) הוא אחד USPIO מורכבת הליבה שאינו stoichiometric מגנטיט מוקף מעיל carboxymethylether polyglucose סורביטול. גודל colloidal, חלקיק של ferumoxytol הוא 17-30 ננומטר כפי שנקבע על ידי פיזור האור. משקל מולקולרי הוא 750 kDa, ואת relaxivity קבוע בשדה 2T-MRI הוא 58.609 מ"מ 1 sec-1 כוח 4. Ferumoxytol לאחרונה ה-FDAשל תוספת ברזל לטיפול מחסור בברזל אצל מטופלים עם אי ספיקת כליות 6. בקבוצה שלנו יש להחיל את סוכן להשתמש "את התווית" תיוג עבור יישומים סלולריים. הטכניקה שלנו מוכיח תיוג יעיל בתאי גזע עם ferumoxytol שמוביל משמעותית תופעות MR האות של תאים הנקרא על תמונות MR. טכניקה זו ניתן להחיל לניטור בלתי פולשני של טיפולים בתאי גזע במסגרות טרום קליניים וקליניים.
Protocol
1. יום 1
1) פלייט תאים
- פלייט hMSC בבקבוק T75 בבית% confluency של 80 לפחות 18-24 שעות לפני תיוג. עיין טבלה מס '1 להוראת עבור כלי חלופי.
2. יום 2
2) להכין פתרון תיוג. הכנה זו תווית אחת (1) T75 בקבוק ב 80% confluency עם ריכוז של 400 מיקרוגרם Fe / ml. עיין טבלה מס '1 להוראת עבור כלי חלופי.
- יצירת פתרון (פתרון 1) על ידי ערבוב 1 מ"ל של סרום ללא מדיה 93.1 μl של ferumoxytol (מניות: 30 מ"ג / מ"ל) בצינור חרוטי 15 מ"ל.
- יצירת הפתרון השני (פתרון 2) על ידי ערבוב 1 מ"ל של סרום ללא מדיה 7 μl של סולפט protamine (מניות: 10 מ"ג / מ"ל) בתוך שפופרת 15 מ"ל second חרוטי.
- אפשר כל פתרון לנוח במשך 5 דקות.
- הוספת פתרונות 1 ו -2 יחד. לערבב בעדינות את הפתרון תיוג חדש. אפשר פתרון לנוח במשך 5 דקות כדי לאפשר USPIO הפרומתחמי סולפט tamine הטופס.
- הוסף 5 מ"ל של סרום ללא מדיה מ"ל 2 מעורבת של SPIO / פתרון סולפט protamine עבור נפח סופי של 7 מ"ל.
3) הכינו תאים תיוג
- לשאוב את התקשורת בין התאים.
- לשטוף בעדינות תאים פעם אחת עם 2-3 מ"ל של טרום חימם Mg / Ca ללא D-PBS או בסרום ללא מדיה לשטוף ממני חלבונים בסרום שיורית או רכיבים אחרים לתקשורת, העלולות לפגום חומר ניגוד ספיגת ויעילות תיוג. לשאוב את הנוזלים ולשטוף.
4) תווית תאים
- מוסיפים את מ"ל להשלים 7 של תיוג פתרון תאים.
- המקום התאים לתוך אינקובטור (37 ° C / 5% CO 2) ולאפשר לתאים כדי לדגור בפתרון תיוג במשך 4 שעות.
- הוסף 700 μl של FCS לפתרון תיוג של תאים כדי להשיג ריכוז בסרום סופי של 10%. סרום הוא הוסיף ליצור מחדש את הסביבה העשירה של התאים אשר מורגלים, ועל מנת לסייע minimizing מוות של תאים העלולה לנבוע שינוי פתאומי חשיפה 24 שעות ביממה לסביבה בסרום חופשי.
- אפשר התאים כדי לדגור עם פתרון תיוג עבור 20 שעות נוספות.
3. יום 3
5) הכנת תאים שכותרתו
- לשאוב את הפתרון תיוג מן התאים.
- לשטוף בעדינות תאים עם 2-3 מ"ל של טרום חימם Mg / Ca ללא D-PBS. לשאוב את PBS. חשוב להשתמש Mg / Ca ללא PBS כמו מ"ג ו Ca יפגע את היעילות של טריפסין בשלב הבא.
- הוסף 2 מ"ל של טריפסין מראש חימם 0.05% אל התאים להטות את הבקבוק קדימה ואחורה על מנת להבטיח את פני השטח של הבקבוק מכוסה בשכבה דקה של טריפסין. המקום התאים באינקובטור (37 ° C / 5% CO 2) ולאפשר התאים לנוח 5-7 דקות או עד התאים מתחילים להתנתק הצלחת. זה עשוי להיות נחוץ כדי לאשר ניתוק תחת מיקרוסקופ. לטפוח בעדינות את צידי הבקבוק במידת הצורך כדי facilitate על פני קרום התא ניתוק.
- הוסף 4 מ"ל של טרום חימם התקשורת מלאה הבקבוק על מנת לנטרל את טריפסין. לשטוף בעדינות את הבקבוק על ידי pipetting טריפסין / מדיה / פתרון התא למעלה ולמטה מספר פעמים. אסוף את הפתרון כולו צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה הפתרון הנייד RCF 400 במשך 5 דקות.
- בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע לתא גלולה. Resuspend התאים 5 מ"ל של התקשורת (סרום המכיל סרום או ללא). צנטריפוגה הפתרון הנייד RCF 400 במשך 5 דקות.
- חזור על לשטוף תא המתואר בשלב 5.5. בסך הכל, התאים יהיו שטופים שלוש פעמים להסיר סוכן שיורית, בניגוד חופשי בתקשורת על פני השטח של התאים.
- ספירת תאים בשלב זה להשיג את ספירת התאים המדויק ביותר, כמו תאים יאבדו במהלך הכביסה הקודמת. בצעו בדיקת הכדאיות של תאים. תאים מוכנים כעת לניתוח עתידיים או יישום ניסיוני. MR הדמיה ניתן לבצע עם T1 ו-W T2-w פרמטרים, כי למרות ferumoxytol הוא סוכן T2-W לעומת זאת, ferumoxytol גם מפגין השפעות T1. נציג T2-w פרמטרים MRI כי ניתן להשתמש בתאים תמונה ferumoxytol שכותרתו כוללים: FSE או SE_Multislice רצפים עם TR של 2000-2500 ms ו TE של 60-80 אלפיות. כדי לרכוש תמונה T1-W, להקטין את הערך TE על FSE או רצף SE_Multislice או להשתמש רצף GRE עם TR גבוה TE נמוך. איור 4 מדגים את פוטנציאל היישום vivo הדמיה שכותרתו בתאי גזע.
4. נציג תוצאות:
תאים תווית להוכיח השפעה משמעותית לעומת המחשיך או שלילית על T2 משוקלל תמונות MR ואת אפקט הניגוד התבהרות או חיובית על T1-משוקלל תמונות MR (איור 2). אורך MR הדמיה בדיקות כדאיות שבוצעו 5 ימים תיוג הודעה הפגינו שום איתות משמעותי MR ואין השפעה משמעותית על כדאיות בהשוואה לקבוצת הביקורת ללא תווית (מידע לא מוצג).
jove_content "> בתאי גזע תווית יכול לאחר מכן להיות מובחן לתוך תאים מסוגים שונים או מוזרק לווריד במשך בחקירה vivo.
באיור 1. קו הזמן סכמטי תיוג בתאי גזע עם nanoparticle תחמוצת ברזל, ferumoxytol.
באיור 2. תמונות של MR sagittal חתכים צינורות thrrough Eppendorf עם תאים גלולה התא. א) שולטת ללא תווית. ב) תאים תווית הוכחת T2 משמעותי או השפעה שלילית חומר ניגוד על FSE T2 משוקלל או SE_Multislice הדמיה סוכן T1 או חיובית לעומת השפעה על רצף GRE-T1 משוקלל.
באיור 3. חתכים sagittal של צינורות Eppendorf עם תאים פל תאמאפשר. קטנה כמו 10,000 תאים שכותרתו ferumoxytol ניתן לאתר באמצעות T2-w MR הדמיה.
איור 4. להדמיה של MR ferumoxytol שכותרתו בתאי גזע שהוחדר לתוך החדרים מוחין Murine. א) ציר הסיבוב, MR דמותו של ברין Murine עם זריקה לא של USPIO שכותרתו בתאי גזע. ב) ציר הסיבוב, C) העטרה, ו-D) sagittal תמונות MR המתארת את אפקט T2, בניגוד שלילית של USPIO שכותרתו בתאי גזע (חצים לבנים) מוזרק במוח Murine.
1. טבלת כמות adaptions תיוג התאים כלי חלופי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיפור היעילות של engraftments תא גזע הוא קריטי לקידום רפואה רגנרטיבית. טכניקה לא פולשנית להדמיה עבור בתאי גזע in vivo משפר באופן משמעותי את יכולתנו להבין את המנגנונים להוביל לתוצאות engraftment מוצלח. תיוג להדמיה מגנטית MR, כגון ההליך שהראנו, מאפשר לעקוב אחר vivo בתאי גזע עם MR הדמיה. בתאי גזע שכותרתו מגנטית בעבר הושתלו רקמות היעד כבר דמיינו עד שבועות עם MR הדמיה 7. לטווח ארוך תיוג הדמיה האורך אפשרי בגלל אחסון lysosomal של חלקיקי תחמוצת ברזל בתוך התאים 8. אתגרים, לעומת זאת, לעשות להתכתב עם ניטור ארוך טווח של תאים הנקרא ברזל. אחד האתגרים הקשורים הדמיה האורך של תאים הנקרא ברזל הוא בריא, תאים חיים מתרבים חומר ניגוד מופץ daughter תאים. התפלגות הסוכן בניגוד לתאי הבת אינה אחידה וכתוצאה מכך אפקט דילול סימנה של הסוכן לעומת זאת לאורך זמן. האתגר השני קשור ניטור ארוך טווח של תאים הנקרא ברזל הוא להבדיל בין תאים שכותרתו במקור קיימא מן phagocytes תושב, כגון מקרופאגים, אשר ייתכן phagocytosed שוחרר חומר ניגוד מ, שכותרתה במקור תאים מתים 4. הקבוצה שלנו זיהה הבדלים לטווח ארוך קינטיקה האות של קיימא אפופטוטיים השתלות מוח עצם, אשר היה שכותרתו עם חלקיקי תחמוצת ברזל מלבד ferumoxytol 9-11. מחקרים עתידיים נדרשים לקבוע אם עקרונות אלה חלים גם על ferumoxytol שכותרתו השתלות תאים.
בעוד במחקר זה תיוג ההשפעות האפשריות ferumoxytol יכול להפגין על יכולת התמיינות בתאי גזע לא נבדק, מחקרים קודמים הראו השפעה מנה SPIO תלוי בידולקיבולת tiation ומינונים SPIO שלא לפגוע פוטנציאל בידול, דבר המצביע, מנה ferumoxtyol שלא לפגוע יכולת התמיינות בתאי גזע יכול גם להיות נחושה 12, 13.
SPIOs גדולה (קוטר הידרודינמית> 50 ננומטר) שהוחלו בעבר למטרות מעקב התא הבאה תיוג בתאי גזע באמצעות טכניקות שונות, כולל תיוג הדגירה transfection פשוטה עם סוכנים electroporation או transfection כגון protamine, lipofectin ו poly-L-ליזין (PLL) 3 , 13-16., אמנם לא תמיד הכרחי עבור התא עם תיוג SPIOs, שיטות transfection תיוג תא הוכיחו מועיל להקל על תיוג והגברת היעילות תיוג 15. SPIOs אשר שימשו במשך תיוג תא, לעומת זאת, הם כבר לא מייצרים מסיבות מסחריות. Ultrasmall SPIO (USPIO, בקוטר הידרודינמית <50 ננומטר) כגון ferumoxytol, מצד שני הם עדיין להיות מיוצראך דורשים סיוע של סוכן transfection כדי להשיג יעילות ספיגת הסלולר 8. סולפט protamine הוא סוכן transfection החלים קלינית שיוצר קומפלקסים עם USPIOs כדי להקל על ספיגת phagocytic של הסוכן בניגוד ידי בתאי גזע 17. השילוב של ה-FDA סולפט protamine USPIO עם ה-FDA, ferumoxytol, מספק פוטנציאל תרגום הקליניים של תא גזע טכניקות מעקב באמצעות שימוש מותווים של סוכן זה. ראוי לציין, ferumoxytol הוכיחה פרופיל בטיחות מצוין בניסויים קליניים 18. להדמיה ישירה של התאים המושתלים באמצעות טכניקה כמו זה הוכיח תאפשר הבנה טובה יותר של הגורמים המקדמים או לפגום מוצלח תא השתלות גזע לעזור לזהות את הטכניקות המבטיחות ביותר ליישומים קליניים. עם השימוש של סמנים תא החלים קלינית וציוד הדמיה, זו טכניקת דימות באופן עקרוני, נגישחולים אשר עוברים השתלות מוח עצם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל התורמים ללמוד את ההצעה הזו לא גילויים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי של דלקת מפרקים ומחלות עור השלד והשרירים: 3R01AR054458-02S2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | Or other base medium for desired stem cell line to be used |
| D-PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25300-120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Ferumoxytol (Feraheme) |
AMAG | 59338-0775-01 | |
| Protamine Sulfate | APP Pharmaceuticals | 22930 |
References
- Narsinh, K. H., Plews, J., Wu, J. C. Comparison of human induced pluripotent and embryonic stem cells: fraternal or identical twins? Mol Ther. 19, 635-638 (2011).
- Bulte, J. W. In vivo MRI cell tracking: clinical studies. AJR. Am. J. Roentgenol. 193, 314-325 (2009).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging. J. Vis. Exp. (13), e685-e685 (2008).
- Tallheden, T., Nannmark, U., Lorentzon, M. In vivo MR imaging of magnetically labeled human embryonic stem cells. Life. Sci. 79, 999-1006 (2006).
- Jung, C. W., Jacobs, P. Physical and chemical properties of superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil. Magn. Reson. Imaging. 13, 661-674 (1995).
- Coyne, D. W. Ferumoxytol for treatment of iron deficiency anemia in patients with chronic kidney disease. Expert. Opin. Pharmacother. 10, 2563-2568 (2009).
- Li, Z., Suzuki, Y., Huang, M. Comparison of reporter gene and iron particle labeling for tracking fate of human embryonic stem cells and differentiated endothelial cells in living subjects. Stem Cells. 26, 864-873 (2008).
- Metz, S., Bonaterra, G., Rudelius, M. Capacity of human monocytes to phagocytose approved iron oxide MR contrast agents in vitro. Eur. Radiol. 14, 1851-1858 (2004).
- Nedopil, A., Klenk, C., Kim, C. MR signal characteristics of viable and apoptotic human mesenchymal stem cells in matrix-associated stem cell implants for treatment of osteoarthritis. Invest. Radiol. 45, 634-640 (2010).
- Kraitchman, D. L., Heldman, A. W., Atalar, E. In vivo magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells in myocardial infarction. Circulation. 107, 2290-2293 (2003).
- Stuckey, D. J., Carr, C. A., Martin-Rendon, E. Iron particles for noninvasive monitoring of bone marrow stromal cell engraftment into, and isolation of viable engrafted donor cells from, the heart. Stem Cells. 24, 1968-1975 (2006).
- Henning, T. D., Sutton, E. J., Kim, A. The influence of ferucarbotran on the chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Contrast. Media. Mol. Imaging. 4, 165-173 (2009).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Kalish, H. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Nedopil, A. J., Mandrussow, L. G., Daldrup-Link, H. E. Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (38), e1793-e1793 (2010).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Wilson, L. B. Comparison of transfection agents in forming complexes with ferumoxides, cell labeling efficiency, and cellular viability. Mol Imaging. 3, 24-32 (2004).
- Babic, M., Horak, D., Trchova, M. Poly(L-lysine)-modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling. Bioconjug Chem. 19, 740-750 (2008).
- Golovko, D. M., T, H. enning, Bauer, J. S. Accelerated stem cell labeling with ferucarbotran and protamine. Eur. Radiol. 20, 640-648 (2010).
- Lu, M., Cohen, M. H., Rieves, D. FDA report: Ferumoxytol for intravenous iron therapy in adult patients with chronic kidney disease. Am. J. Hematol. 85, 315-319 (2010).
