Summary
Vi beskriver en teknik för märkning och spårning stamceller med FDA-godkända, superparamagnetiska järnoxid (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Detta cellulära bildteknik som använder magnetresonans (MR) imaging för visualisering är lätt åtkomliga för långsiktig övervakning och diagnos av lyckade eller misslyckade engraftments stamceller hos patienter.
Abstract
Stamcellsbaserade behandlingar erbjuder betydande potential för området regenerativ medicin. Det återstår dock mycket att förstå om in vivo kinetiken av transplanterade celler. En icke-invasiv metod för att upprepade gånger kontrollera transplanterade stamceller in vivo skulle ge utredarna att direkt kontrollera stamcellstransplantation och identifiera lyckade eller misslyckade engraftment resultat.
Ett brett utbud av stamceller fortsätter att utredas för otaliga användningsområden. Detta protokoll är inriktat på tre olika populationer stamceller: embryonala njur-293 (HEK293) celler, mänskliga mesenkymala stamceller (hMSC) och inducerad pluripotenta stamceller (IPS) celler. HEK 293 celler som härrör från mänskliga embryonala njur celler som odlas i kultur med klippt adenovirus 5 DNA. Dessa celler används mycket i forskningen eftersom de är lätt odlas, växer snabbt och är lätt transfekterade. hMSCs finns i vuxna märg. Dessa celler can ska replikeras som odifferentierade celler samtidigt multipotency eller kan differentieras till ett begränsat antal cell öden. hMSCs kan differentiera till linjerna av mesenkymala vävnader, inklusive osteoblaster, adipocyter, kondrocyter, senor, muskler och märg stroma. iPS-celler är genetiskt omprogrammeras vuxna celler som har modifierats för att uttrycka gener och faktorer som liknar att definiera egenskaperna hos embryonala stamceller. Dessa celler är pluripotenta vilket innebär att de har kapacitet att differentiera till alla cell linjer 1. Både hMSCs och iPS-celler har visat vävnad regenerativ förmåga in-vivo.
Magnetisk resonanstomografi (MR) avbildning tillsammans med användningen av oxid superparamagnetiska järn (SPIO) nanopartiklar cell etiketter har visat sig effektiv för in vivo-spårning av stamceller på grund av den nära mikroskopiska anatomiska upplösning, medger en längre blod Half-Life som längsgående avbildning och hög sensitivity för cell upptäckt som MR-avbildning av SPIO nanopartiklar 2-4. Dessutom är MR med användning av SPIOs kliniskt översättas. SPIOs består av en järnoxid kärna med en dextran, carboxydextran eller stärkelse ytskiktet som används för att innehålla bioreactive järnkärna från plasma komponenter. Dessa agenter skapa lokala magnetfält inhomogeniteter som leder till en minskad signal på T2-viktad MR-bilder 5. Tyvärr är SPIOs inte längre tillverkas. Andra generationen, ultrasmall SPIOs (USPIO), dock erbjuda ett lönsamt alternativ. Ferumoxytol (FerahemeTM) är en USPIO består av en icke-stökiometrisk magnetit kärna omgiven av ett polyglucose sorbitol carboxymethylether päls. Den kolloidala, partikelstorlek av ferumoxytol är 17-30 nm som bestäms av ljusspridning. Den molekylvikt är 750 kDa, och relaxiviteten konstant på 2T MR området är 58,609 MM-1 sec-1 styrka 4. Ferumoxytol fick nyligen FDA-godkänt ens ett järntillskott för behandling av järnbrist hos patienter med njursvikt 6. Vår grupp har tillämpat denna agent i ett "off-label" användning för applikationer cell märkning. Vår teknik visar effektiv märkning av stamceller med ferumoxytol som leder till betydande MR-signal effekter märkta celler på MR bilder. Denna teknik kan tillämpas för icke-invasiv övervakning av stamcellsbehandlingar i pre-kliniska och kliniska inställningar.
Protocol
1. Dag 1
1) Plate celler
- Plate hMSC i en T75 kolv vid en confluency 80% minst 18-24 timmar före märkning. Se tabell 1 för instruktion för alternativa fartyg.
2. Dag 2
2) Förbered märkning lösning. Denna förberedelse kommer etiketten en (1) T75 kolv vid 80% confluency med en koncentration av 400 mikrogram Fe / ml. Se tabell 1 för instruktion för alternativa fartyg.
- Skapa ett (lösning 1) genom att blanda 1 ml serum-fria medier och 93,1 ìl ferumoxytol (lager: 30 mg / ml) i ett 15 ml koniskt rör.
- Skapa en andra (lösning 2) genom att blanda 1 ml serum-fria medier och 7 ìl protaminsulfat (lager: 10 mg / ml) i en andra 15 ml koniska rör.
- Låt varje lösning vila i 5 minuter.
- Lägg lösningar 1 och 2 tillsammans. Blanda försiktigt den nya märkningen lösningen. Låt lösningen vila i 5 minuter för att tillåta USPIO-Protamin sulfat komplex bildas.
- Tillsätt 5 ml serum-fria medier till blandade 2 ml SPIO / protaminsulfat lösning för en slutlig volym på 7 ml.
3) Förbered celler för märkning
- Aspirera media från cellerna.
- Försiktigt tvätta celler gång med 2-3 ml förvärmda Mg / Ca-free D-PBS eller serum-fria medier att skölja bort rester av serumproteiner och eller andra media komponenter som skulle kunna försämra upptaget kontrastmedel och märkning effektivitet. Sug ut spola vätska.
4) Label celler
- Lägg hela 7 ml märkning lösning celler.
- Placera celler i en inkubator (37 ° C / 5% CO 2) och låta cellerna att inkubera i märkningen lösningen för 4 timmar.
- Tillsätt 700 ìl av FCS för märkning lösning av cellerna för att nå en slutlig serumkoncentration på 10%. Serum läggs till återupprätta berikad miljö där cellerna är vana vid, och att hjälpa minimizing celldöd som kan bli följden av en abrupt övergång till 24 timmars exponering för ett serum miljö.
- Låt cellerna att inkubera med märkning lösningen för ytterligare 20 timmar.
3. Dag 3
5) Förbered märkta celler
- Sug märkning lösning från celler.
- Försiktigt spola cellerna med 2-3 ml förvärmda Mg / Ca-free D-PBS. Sug ut PBS. Det är viktigt att använda Mg / Ca-fri PBS som Mg och Ca försämrar effektiviteten av trypsin i nästa steg.
- Tillsätt 2 ml förvärmda 0,05% Trypsin till cellerna och luta flaskan fram och tillbaka för att se hela ytan på kolven är täckt med ett tunt lager av trypsin. Placera celler i en inkubator (37 ° C / 5% CO 2) och låta cellerna vila i 5-7 minuter eller tills cellerna börjar lossna från plattan. Det kan bli nödvändigt att bekräfta lossnar under ett mikroskop. Knacka försiktigt på sidorna av kolven om det är nödvändigt för att fagrinden underlättar cellytan lossnar.
- Tillsätt 4 ml av förvärmda komplett media till kolven för att neutralisera Trypsin. Försiktigt skölja kolven genom att pipettera den Trypsin / media / cell lösningen upp och ner flera gånger. Samla hela lösningen i ett 15 ml koniska rör. Centrifugera cellen lösningen vid 400 RCF i 5 minuter.
- Försiktigt aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten. Resuspendera cellerna i 5 ml media (serum som innehåller eller serum-fri). Centrifugera cellen lösningen vid 400 RCF i 5 minuter.
- Upprepa cellen tvätta beskrivs i steg 5,5. Totalt kommer cellerna sköljas tre gånger för att avlägsna rester, gratis kontrastmedel i media och på ytan av cellerna.
- Räkna celler vid denna punkt för att uppnå den mest exakta celltal, som celler går förlorade under tidigare tvätt. Utför en livskraften test av celler. Celler är nu redo för senare analys och eller experimentella program. MR kan utföras med T1-w och T2-w parametrar, för även ferumoxytol är en T2-w kontrastmedel, utställningar ferumoxytol också T1 effekter. Representant T2-w MRI parametrar som kan användas för att bilden ferumoxytol märkta celler inkluderar: FSE eller SE_Multislice sekvenser med en TR för 2000-2500 ms och en TE på 60-80 ms. Att förvärva en T1-w bild, minska TE värde på en FSE eller SE_Multislice sekvens eller använda en GRE sekvens med hög TR och lågt TE. Figur 4 visar en potential in vivo ansökan märkt stamceller avbildning.
4. Representativa resultat:
Märkta celler visar en betydande mörkare eller negativ kontrast effekt på T2-viktad MR-bilder och en ljusnande eller positiv kontrast effekt på T1-viktade MR-bilder (figur 2). Längsgående MR och tester livskraft utförs 5 dagar efter märkningen visade ingen signifikant MR-signal och ingen betydande inverkan på lönsamheten jämfört med omärkta kontroller (data visas inte).
jove_content "> kan Märkta stamceller därefter differentieras till olika celltyper eller injicerat för in vivo undersökning.
Figur 1. Schematisk tidsplan för märkning av stamceller med järnoxid nanopartiklar, ferumoxytol.
Figur 2. MR bilder av sagittal tvärsnitt thrrough Eppendorf-rör med celler i en cell pellets. A) Utan etikett kontroller. B) märkt celler visar en betydande T2 eller negativ kontrastmedel effekt på T2-viktad FSE eller SE_Multislice bildbehandling och ett T1-eller positiva kontrastmedel effekt på T1-viktade GRE sekvens.
Figur 3. Sagittala tvärsnitt av Eppendorf-rör med celler i cell PELlåter. Så lite som 10.000 ferumoxytol märkta celler kan upptäckas via T2-w MR.
Figur 4. MR visualisering av ferumoxytol märkt stamceller injiceras i murina cerebrala ventriklarna. A) Axial, MR bild av murina Barin med något tillskott av USPIO märkt stamceller. B) Axial, C) koronalt och D) sagittal MR-bilder som skildrar T2, negativ kontrast effekt USPIO märkt stamceller (vita pilar) injiceras i en murin hjärna.
Tabell 1. Kvantitet anpassningar för märkning av celler i alternativa fartyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att förbättra effektiviteten i engraftments stamceller är avgörande för främjandet av regenerativ medicin. En icke-invasiv visualisering teknik för stamceller in vivo ökar kraftigt vår förmåga att förstå mekanismer som leder till framgångsrik engraftment resultat. Magnetisk märkning för MR visualisering, såsom förfarandet har vi visat, ger in vivo-spårning av stamceller med MR. Magnetiskt märkta stamceller har tidigare varit transplanterats in målvävnad och har visualiserat upp till veckor med MR 7. Långsiktiga märkning och längsgående bildbehandling är möjligt på grund av det lysosomala lagring av nanopartiklar järnoxid i celler 8. Utmaningar dock göra stämmer överens med långsiktig övervakning av järn märkta celler. En utmaning i samband med längsgående avbildning av järn märkta celler är att så friska, livskraftiga celler föröka kontrastmedlet distribueras till daughter celler. Fördelning av kontrastmedlet till dotter celler är ojämn och resulterar i en markant utspädningseffekt av kontrastmedlet över tiden. En andra utmaning i samband med långsiktig övervakning av järn märkta celler skilja mellan ursprungligen märkt, livskraftiga celler från inhemska fagocyter såsom makrofager, som kan ha fagocyteras släppt kontrastmedel från ursprungligen märkt, döda celler 4. Vår grupp har identifierat skillnader i långsiktig signal kinetik av livskraftiga och apoptotiska stamcellstransplantation, som varit märkta med nanopartiklar järnoxid än ferumoxytol 9-11. Framtida studier behövs för att avgöra om dessa principer också tillämpas på ferumoxytol-märkta cell transplantationer.
Även i denna studie de potentiella effekterna ferumoxytol märkning skulle kunna ställa ut på differentiering kapacitet stamceller har inte undersökts, har tidigare studier visat en SPIO dosberoende effekt på skilldifferentiering kapacitet och doser SPIO som inte försämrar differentiering potential, vilket tyder på en ferumoxtyol dos som inte försämrar differentiering förmåga av stamceller kan också bestämmas 12, 13.
Stora SPIOs (hydrodynamiska diameter> 50 nm) har tillämpats tidigare för ändamål cell spåra efter stamcellstransplantation märkning via olika märkning tekniker inklusive enkel inkubation och transfektion med elektroporation eller transfektion medel såsom protamin, lipofectin och poly-L-lysin (PLL) 3 , 13-16., men inte alltid nödvändigt för cell märkning med SPIOs, transfektion metoder för cell-märkning har visat sig vara fördelaktig för att underlätta märkning och ökad märkning effektivitet 15. SPIOs som har använts för cell märkning, dock inte längre produceras av kommersiella skäl. Ultrasmall SPIO (USPIO, hydrodynamiska diameter <50 nm) som ferumoxytol, är däremot fortfarande producerasmen kräver hjälp av en transfektion agent för att uppnå en effektiv cellulärt upptag 8. Protaminsulfat är en kliniskt tillämplig transfektion agent som bildar komplex med USPIOs att underlätta fagocytiska upptag av kontrastmedlet av stamceller 17. Kombinationen av FDA-godkända protaminsulfat med FDA-godkända USPIO, ferumoxytol ger potential för klinisk översättning av stamceller spåra tekniker via off-label användning av detta medel. Notera har ferumoxytol visat en mycket god säkerhetsprofil i kliniska prövningar 18. Direkt visualisering av de transplanterade cellerna via en teknik som visat en skulle möjliggöra en bättre förståelse av de faktorer som främjar eller försämrar framgångsrika transplantationer stamceller och bidra till att identifiera de mest lovande teknikerna för kliniska tillämpningar. Med hjälp av kliniskt tillämpliga cell markörer och bildutrustning, detta är bildteknik i princip, lättillgängligatill patienter som genomgår stamcellstransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla som bidragit till denna studie ger inga upplysningar.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett bidrag från National Institute of Arthritis och muskuloskeletala och hudsjukdomar: 3R01AR054458-02S2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | Or other base medium for desired stem cell line to be used |
| D-PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25300-120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Ferumoxytol (Feraheme) |
AMAG | 59338-0775-01 | |
| Protamine Sulfate | APP Pharmaceuticals | 22930 |
References
- Narsinh, K. H., Plews, J., Wu, J. C. Comparison of human induced pluripotent and embryonic stem cells: fraternal or identical twins? Mol Ther. 19, 635-638 (2011).
- Bulte, J. W. In vivo MRI cell tracking: clinical studies. AJR. Am. J. Roentgenol. 193, 314-325 (2009).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging. J. Vis. Exp. (13), e685-e685 (2008).
- Tallheden, T., Nannmark, U., Lorentzon, M. In vivo MR imaging of magnetically labeled human embryonic stem cells. Life. Sci. 79, 999-1006 (2006).
- Jung, C. W., Jacobs, P. Physical and chemical properties of superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil. Magn. Reson. Imaging. 13, 661-674 (1995).
- Coyne, D. W. Ferumoxytol for treatment of iron deficiency anemia in patients with chronic kidney disease. Expert. Opin. Pharmacother. 10, 2563-2568 (2009).
- Li, Z., Suzuki, Y., Huang, M. Comparison of reporter gene and iron particle labeling for tracking fate of human embryonic stem cells and differentiated endothelial cells in living subjects. Stem Cells. 26, 864-873 (2008).
- Metz, S., Bonaterra, G., Rudelius, M. Capacity of human monocytes to phagocytose approved iron oxide MR contrast agents in vitro. Eur. Radiol. 14, 1851-1858 (2004).
- Nedopil, A., Klenk, C., Kim, C. MR signal characteristics of viable and apoptotic human mesenchymal stem cells in matrix-associated stem cell implants for treatment of osteoarthritis. Invest. Radiol. 45, 634-640 (2010).
- Kraitchman, D. L., Heldman, A. W., Atalar, E. In vivo magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells in myocardial infarction. Circulation. 107, 2290-2293 (2003).
- Stuckey, D. J., Carr, C. A., Martin-Rendon, E. Iron particles for noninvasive monitoring of bone marrow stromal cell engraftment into, and isolation of viable engrafted donor cells from, the heart. Stem Cells. 24, 1968-1975 (2006).
- Henning, T. D., Sutton, E. J., Kim, A. The influence of ferucarbotran on the chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Contrast. Media. Mol. Imaging. 4, 165-173 (2009).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Kalish, H. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Nedopil, A. J., Mandrussow, L. G., Daldrup-Link, H. E. Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (38), e1793-e1793 (2010).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Wilson, L. B. Comparison of transfection agents in forming complexes with ferumoxides, cell labeling efficiency, and cellular viability. Mol Imaging. 3, 24-32 (2004).
- Babic, M., Horak, D., Trchova, M. Poly(L-lysine)-modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling. Bioconjug Chem. 19, 740-750 (2008).
- Golovko, D. M., T, H. enning, Bauer, J. S. Accelerated stem cell labeling with ferucarbotran and protamine. Eur. Radiol. 20, 640-648 (2010).
- Lu, M., Cohen, M. H., Rieves, D. FDA report: Ferumoxytol for intravenous iron therapy in adult patients with chronic kidney disease. Am. J. Hematol. 85, 315-319 (2010).
