Pull-down des protéines se liant à la calmoduline

Summary

Calmoduline (CaM) pull-down test est un moyen efficace pour étudier l'interaction de la CAM avec diverses protéines. Cette méthode utilise la CaM-sépharose perles pour une analyse efficace et spécifique des protéines liant la CaM. Cela fournit un outil important d'explorer de signalisation CAM dans la fonction cellulaire.

Abstract

Le calcium (Ca ^{2 +)} est un ion essentiel dans la régulation de la fonction cellulaire à travers une variété de mécanismes. Beaucoup de Ca ^{2 +} de signalisation est médiée par la protéine liant le calcium connu comme la calmoduline (CaM) ^1,2. Cam est impliqué à plusieurs niveaux dans presque tous les processus cellulaires, y compris l'apoptose, le métabolisme, la contraction des muscles lisses, la plasticité synaptique, la croissance des nerfs, l'inflammation et la réponse immunitaire. Un certain nombre de protéines aident à réguler ces voies grâce à leur interaction avec la CaM. Beaucoup de ces interactions dépendent de la conformation de came, qui est nettement différente lorsqu'il est lié à Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +-CaM)} par opposition à sa Ca ^{2 +} sans état ​​(ApoCaM) ^3.

Alors que la plupart des protéines cibles se lient Ca ^{2 +-CaM,} certaines protéines ne se lient à ApoCaM. Certains CaM lient par leur QI-domaine, y compris neuromodulin ^4, neurogranine (Ng) ^5, et certaines myosines <sup> 6. Ces protéines ont été montré à jouer un rôle important dans la fonction présynaptique ^7, fonction postsynaptique ⁸ et ⁹ contraction des muscles, respectivement. Leur capacité à se lier et libérer Cam en l'absence ou la présence de Ca ^{2 +} est le pivot de leur fonction. En revanche, de nombreuses protéines ne se lient Ca ^{2 +-CaM} et nécessitent cette liaison pour leur activation. Les exemples incluent la myosine kinase à chaîne légère ^10, Ca ^{2 +} / CaM-kinases dépendantes (CaMKs) ¹¹ et les phosphatases (par exemple la calcineurine) ^12, et la spectrine kinase ^13, qui ont une variété d'effets directs et aval ^14.

Les effets de ces protéines sur la fonction cellulaire sont souvent dépendants de leur capacité à se lier à Cam dans un Ca ^{2 +-dépendante.} Par exemple, nous avons testé la pertinence de Ng-CAM obligatoire dans la fonction synaptique et la façon dont les mutations affectent différentes cette liaison. Nous avons généré une con-GFP taggés Ngstruct avec des mutations spécifiques dans le IQ-domaine qui allait changer la capacité de se lier Ng CAM dans une Ca ^{2 +-dépendante.} L'étude de ces différentes mutations nous a donné une grande perspicacité dans les processus importants impliqués dans la fonction synaptique ^8,15. Cependant, dans de telles études, il est essentiel de démontrer que les protéines mutées ont altéré la liaison prévue à Cam.

Ici, nous présentons une méthode pour tester la capacité des protéines à se lier à Cam en présence ou en absence de Ca ^{2 +,} en utilisant CaMKII et Ng comme exemples. Cette méthode est une forme de chromatographie d'affinité appelé CaM déroulant dosage. Il utilise la CaM-Sépharose perles de tester les protéines qui se lient à came et l'influence de Ca ^{2 +} sur cette liaison. Il est temps considérablement plus efficace et nécessite moins de protéine par rapport à la chromatographie colonne et d'autres épreuves. Au total, cela donne un outil précieux pour explorer Ca ^{2 +} de signalisation Cam / et de protéines que dansteract avec Cam.

Protocol

Reportez-vous à la Figure 1 pour un schéma de base de la procédure depuis le broyat. Estimation du temps de la préparation d'extraits cellulaires à élution de protéines liées CaM est d'environ six à sept heures. 1. Préparation des tissus Injecter organotypiques coupes d'hippocampe par un virus contenant un plasmide exprimant la protéine recombinante d'intérêt (dans cet exemple, la protéine fluorescente verte (GFP)-taggés Ng) et permettent d'expri…

Discussion

Le protocole fourni utilise CaM-sépharose perles pour enquêter sur le Ca ^{2 +-dépendance} de la CaM des protéines de liaison. De nombreuses protéines se lient dans une CaM Ca ^{2 +-dépendante.} Ces interactions sont d'une grande importance étant donné le nombre de CaM des protéines de liaison et leur rôle crucial dans de nombreuses voies de signalisation. Dans ce protocole, Cam-sépharose perles sont utilisées pour séparer des protéines de liaison de la CaM d'homogénat de tissu en …

Materials

Product	Company	Catalogue number	Notes
Calmodulin-Sepharose beads	GE Healthcare	17-0529-01
Anti-CamKII alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Anti-neurogranin	Millipore	07-425
Gel Loading Pipet Tips	Fisher	02-707-138	Use for aspiration of supernatants
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)	Fisher	05-408-146	Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads