Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll nur auf Zellinfektion, was die Effizienz von rekombinanten Parvovirus-Produktion um mehr als 100-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet verbessert bezogen. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung einer neuartigen Adenovirus-5-basiertes Hilfsprogramm mit dem Parvovirus VP Transkriptionseinheit (Ad-VP).

Abstract

Nagetier-Parvoviren (PV) wie Ratten H-1PV und MVM, sind kleine ikosaedrische, einzelsträngige, DNA-Viren. Das Genom enthält zwei Promotoren P4 und P38, die die Expression von nicht-strukturellen (NS1 und NS2) und Kapsid-Proteine ​​(VP1 und VP2), die jeweils ^{1 zu} regulieren. Sie ziehen hohe Zinsen als Antikrebsmittel für ihre onkolytischen und oncosuppressive Fähigkeiten, aber dabei nicht-pathogen für den Menschen ^2. NS1 ist das zentrale viraler Cytotoxizität ^3. Zur weiteren Verbesserung ihrer natürlichen antineoplastischen Aktivitäten wurden Derivate von diesen Vektoren durch Ersetzen des Gens, das für die Kapsidproteine ​​mit einem therapeutischen Transgens (zB ein zytotoxisches Polypeptid, Cytokin, Chemokin, Tumorsuppressor-Gen usw.) ⁴ erzeugt wurde. Die rekombinanten Parvoviren (recPVs) Vektor behält die NS1 / 2 kodierenden Sequenzen und die PV-Genom Telomere, die notwendig für die virale DNA-Amplifikation und Verpackung sind. Herstellung vonrecPVs nur, wenn die Produzentenzellen (in der Regel HEK293T), durch Co-Transfektion der Zellen mit einem zweiten Vektor (pCMV-VP) Exprimieren des Gens, das für die VP-Proteine ​​(Abb. 1) ^4. Die recPV Vektoren auf diese Weise erzeugt werden, sind Replikation defekt. Obwohl recPVs erwies sich verbesserte oncotoxic Aktivitäten in Bezug auf die elterliche Viren, von denen sie erzeugt worden sein besitzen, bleibt ihre Produktion eine große Herausforderung und stark behindert die Verwendung dieser Mittel im Anti-Krebs-klinische Anwendungen.

Wir fanden, dass die Einführung eines Ad-5-abgeleiteten Vektor, der das E2a, E4 (orf6) und die VA-RNA-Gene (zB pXX6 Plasmid) in HEK293T verbessert die Herstellung von recPVs um mehr als 10-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet. Basierend auf dieser Erkenntnis, haben wir eine neue Ad-VP-Helfer, dass die genomische adenoviralen Elemente notwendig, recPVs Produktion zu verbessern sowie die parvovir enthält gebautuns VP-Einheit ^5-Gen. Die Verwendung von Ad-VP-Helfer-, ermöglicht die Herstellung von rec-PV unter Verwendung eines Protokolls, die vollständig von den viralen Infektion Schritte (im Gegensatz zu Plasmid-Transfektion gegenüberliegenden), die Ermöglichung der Verwendung von Zelllinien, die schwer zu transfizieren (zB NB324K) ( Abb.. 2). Wir stellen eine Methode verbessert das groß die Menge des produzierten rekombinanten Virus, wodurch sowohl die Produktionszeiten und-kosten, ohne dass die Qualität des Endproduktes ^5. Darüber hinaus ist die großtechnische Herstellung von recPV (in Suspension Zellen und Bioreaktoren) nun denkbar.

Protocol

Beachten Sie, dass ein Labor mit Sicherheitsstufe 2 für die Produktion rekombinanter Parvoviren (recPV) ist erforderlich.

Das Protokoll ist in zwei Hauptteile gegliedert. Der erste Teil (Herstellung von recPV durch Transfektion) benötigt, um die minimale Menge an recPVs, die als Inokulum dient im zweiten Teil des Protokolls (Herstellung von recPVs durch Infektion) zu erzeugen. Sobald eine kleine Menge von recPVs erzeugt wird, der erste Teil des Protokolls weggelassen werden kann, und die rekombinanten Parvovirus kann nur durch Infektion Bereitstellen des Gens, das für die Parvovirus-Kapsidproteine ​​durch die Adenovirus-Helferfunktionen (siehe unten) amplifiziert werden.

1. Herstellung von recPVs über Transfektion

1,1 Virale DNA-Transfektion

Es ist möglich, jede produzierte DNA-Transfektionsverfahren in diesem Abschnitt des Protokolls entweder auf kationischen Lipiden oder Calciumphosphat basieren. Wir verwenden in der Regel Fugene HD Transfektionsreagenz. Um die Transfektionseffizienz kontrollieren, empfehlen wir die zusätzliche Transfektion Platte mit einem Plasmid, das Enhanced Green Fluorescent Protein (zB pEGFP-N1, Clontech). Die Transfektion wird als effizient und optimal für Virusproduktion, wenn mindestens 50% der Zellpopulation führt EGFP-positive 24 Stunden nach der Transfektion.

1. 1 Tag vor der Transfektion Saatgut 2.000.000 HEK293T-Zellen in einer 10 cm-Platte, zu 50% Konfluenz zellulären am Tag der Transfektion erhalten. Kultivieren von Zellen in 10 ml Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit Zusatz von 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U pro ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
2. Bereiten Sie Virus-Making-Gemisch (Molverhältnis 01.02.01) in einem 1,5 ml-Tube:
   1. 3 ug recPV Vektor, der das Transgen von Interesse (ei ^{PhH-1-GFP-6).}
   2. 6 ug Vektor pCMV / VP ⁵ beherbergt die Parvoviruskapsid Gen-Einheit
   3. 8 ug of Adenovirus-Helferplasmid abgeleiteten pXX6 ^7.
3. Verdünnen Sie die Plasmide Mix mit serumfreiem Medium bis zu 850 ul (Endkonzentration von 20 ng / ul).
4. In 42,5 ul Fugene HD (2,5:1 Verhältnis ul Fugene: ug DNA). Berühren Sie nicht die Seite der Röhre beim Hinzufügen Fugene auf das Medium.
5. Vorsichtig vortexen für 5-10 Sekunden.
6. Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
7. Fügen Sie die Transfektion Mischungen zu den Zellen tropfenweise. Schütteln Sie die Platte vorsichtig zur gleichmäßigen Verteilung der gesamten Mischung.

1,2 Virusproduktion

1. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C mit 92% Luftfeuchtigkeit und 5% CO ₂ für 72 Stunden vor der Ernte. Während dieser Zeit Nachkommen Parvovirus Teilchen von den Parvovirus Plasmide gebildet ist.

1,3 Virusernte

1. In einer Gewebekultur Kapuze, kratzen die Zellen in ihrem Medium absaugen und überführt die Suspension von der Platte in einen 15ml Kunststoffröhrchen.
2. Das Röhrchen bei 250 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Entfernen 95% des Überstandes.
4. Vortex das Rohr leicht, um das Pellet in dem verbleibenden Überstand (etwa 0,5 ml) resuspendiert.
5. Frieren Sie das Rohr bei -80 ° C Es ist möglich, die Produktionskosten zu diesem Zeitpunkt zu stoppen oder mit dem Protokoll weiter.
6. Tauen Sie das Fahrwerk und bringen Sie es bei Raumtemperatur.
7. Frieren Sie die Suspension in einem Bad aus flüssigem Stickstoff und Auftauen in warmes Wasser bei 37 ° C Beide Röhrchen kräftig für 15 Sekunden und wiederholen Sie die Frost-Tau-Zyklus noch zweimal.
8. Zentrifugieren bei 16.000 × g für 15 min bei 4 ° C
9. Sammeln Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. Das Rohr in diesem Stadium enthält das rohe Virus-Präparat.
10. Fahren Sie mit dem Virus-Titration (siehe unten). Für die Durchführung recPV das GFP-Gen, sollte eine typische Produktion zu geben 1-3 × 10 ⁷ viralen infektiösen Einheiten entsprechend etwa 1 -3 x ¹⁰ 10 viralen Genoms, die Teilchen.

1,4 Virus Lagerung

1. Für eine langfristige Lagerung einfrieren das Röhrchen mit dem rohen Extrakt Virus bei -80 ° C Es ist möglich, rohen Viruspräparation Extrakte als Inokulum in den zweiten Teil des Protokolls verwendet.

2. Herstellung von recPVs über Infektion

Vor Beginn der Produktion über recPV Infektion, zu produzieren und zu reinigen Adenovirus 5 Tragen des Parvovirus VP-Gen (Ad-VP-Helfer, beschrieben in ⁵⁾ nach Standard-Protokoll ^8. Es ist auch notwendig, eine minimale Menge an recPVs das Transgen trägt von Interesse (zB, hergestellt durch Transfektion wie oben beschrieben) aufweisen.

Im Folgenden beschreiben wir die Produktion in recPV 175 cm ^2-Kolben (T175)-Format. Die weitere Verstärkung des Virusstocks auf diese Weise hergestellt werden in 10 mehrschichtigen CellSTACK Kulturkammern (Corning) durchgeführt werdenmit geringfügigen Anpassungen des Protokolls vorgeschlagen.

2,1 Infektion

1. 1 Tag vor der Infektion, Platte 10 Millionen Zellen in einem NB324K T175-Kolben auf 60-80% Konfluenz zellulären am Tag der Infektion erhalten. Planen einen zweiten Kolben mit der gleichen Anzahl von Zellen als Kontrolle (nicht-infizierten Zellen). Jede T175 sollte 20 ml Minimum Essential Medium (MEM) als Endvolumen, mit 5% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100U pro ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin ergänzt wurden.
2. Am nächsten Morgen vorzubereiten Virus Gemisch in einem 2 ml-Kunststoffröhrchen Röhre, bestehend aus:
   1. ^{Ad-VP-Helfer-5} bei Multiplizität der Infektion (MOI, infektiösen Einheiten / Zelle) = 10 (entsprechend 1 × 10 ⁸ infektiösen Einheiten);
   2. recPVs bei MOI = 0,5 (entsprechend 5 x 10 ⁶ infektiösen Einheiten). Füllen bis 1,5 ml mit MEM.
3. Wenden Sie das gesamte Virus Mischung in einem der T175 Kolben.
4. Inkubieren Sie dieKolben für 2 Stunden bei 37 ° C, 92% Luftfeuchtigkeit, 5% CO ₂ leichtem Schütteln alle 15 min.
5. Inkubieren für weitere 20-24 Stunden bei 37 ° C, 92% Luftfeuchtigkeit, 5% CO _2.
6. Ersetzen Sie das kulturelle Medium durch frisches Medium.

2,2 Virusproduktion

Inkubieren Sie die Kolben bei 37 ° C bei 92% Luftfeuchtigkeit und 5% CO ₂ für 48 Stunden. Als Hinweis auf eine effiziente virale Produktion, klare Anzeichen von Zytotoxizität in den Kolben mit viral infizierte Zellen beobachtet werden, beginnend von 36-48 Stunden nach der Infektion.

2,3 Virusernte

1. In einer Gewebekultur Kapuze, absaugen und überweisen Sie den Mediumüberstand aus dem Kolben in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen.
2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1,5 ml PBS.
3. Trypsinieren die Zellen mit 1,5 ml 0,25% EDTA-Trysin. Fügen Sie die Zellsuspension zum Medium entfernt.
4. Zentrifugation der Zellen und der Überstand bei 5.000 × g für 5 min bei Raumtemperaturtur.
5. Überstand verwerfen.
6. 1 ml TE-Puffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) auf das Zellpellet und vorsichtig vortexen das Rohr, um die Zellen zu resuspendieren.
7. Frieren Sie die Zellsuspension in einem Bad aus flüssigem Stickstoff und Auftauen in warmes Wasser bei 37 ° C Vortex das Rohr kräftig für 15 Sekunden und wiederholen Sie den Frost-Tau-Zyklus dreimal.
8. Behandeln der Zellsuspension mit 50 U / ml Benzonase Nuclease für 30 min bei 37 ° C, um die Zelle genomische und nicht-viraler DNAs verpackten verdauen.
9. Das Röhrchen bei 5.000 × g für 20 min bei 4 ° C
10. Sammeln Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. Der Überstand auf dieser Stufe enthält das rohe Virus-Präparat. Typische Ausbeuten von recPV-GFP hergestellt nach diesem Protokoll sollte im Bereich von 1-10 x 10 ⁸ viralen infektiösen Einheiten sein.

2,4 Virus Lagerung

1. Bei kurzfristiger Lagerung (maximal 2 Monate), Store-Virus bei 4 ° C
2. Für LONg Langzeitlagerung (länger als 2 Monate), Filiale Virus bei -80 ° C

3. RecPV Reinigung

1. Für die Reinigung von recPVs aus den Rohlysaten, empfehlen wir, einen diskontinuierlichen Gradienten Iodixanol nach Zolotukhin et al laufen. ^9. Wir empfehlen die Verwendung von mindestens 5 ml rohe virale Extrakt (gewonnen aus der Produktion in fünf T175-Flaschen) für eine effiziente Reinigung Virus.

4. Rekombinanten Parvovirus-Titration

1. Führen recPV Titration wie in El-Andaloussi et al. ⁵

5. Qualitätskontrollen

1. Verwendung des Protokolls in El-Andaloussi et al. ⁵ beschrieben auf das Vorhandensein von unerwünschten replikationskompetenten Viren (NA) für die Durchführung Parvovirus Plaque-Assay in NB324K Indikator-Zellen zu überprüfen.

6. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel für recPVs production durch Transfektion in Gegenwart oder Abwesenheit von Adenovirus genomische Elemente in 3 gezeigt. Die Zellen wurden mit pCMV / VP (Plasmid, welches das Gen für den VP-Parvovirus-Kapsidproteine) zusammen mit PhH-1-GFP (a recPV beherbergen das GFP-Gen) oder PHH-1-Luciferase (a recPV beherbergen die Glühwürmchen-Luciferase-Gen) transfiziert , mit (+ pXX6) oder ohne (-pXX6) die pXX6 Plasmid (welche das Adenovirus-E2A-, E4 (orf6) und VA-RNA-Gene). Gleiche Volumen von Zellextrakten wurden verwendet, um Zellen und NB324K GFP-Transduktion oder Luciferase-Assays durchgeführt wurden wie in El-Andaloussi et al. ^5. Eine deutliche Zunahme der recPVs Produktion wurde in Gegenwart von pXX6 mit zunehmender Produktion von 0,3 GFP transductional Einheiten (TU) / Zelle, erhalten nach herkömmlichen Protokollen auf ca. 5 TU / Zelle erhalten nach unserer Methode (Abb. 3a, b). Ein signifikanter Anstieg (etwa 24-fach) recPV Produktiam wurde auch im Falle von PHH-1-Luciferase (3C) beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass das genetische Material in pXX6 enthalten können Parvovirus Produktion zu steigern ist.

Ein repräsentatives Beispiel für recPVs Produktion über Infektion wird in Abbildung 4 dargestellt. NB324K Zellen wurden mit verschiedenen recPVs (wie in der Abbildung angegeben) und Ad-VP-Helfer (beherbergt das Gen, das für die PV-VP Kapsidproteine) co-infiziert. Ad-VP-Helfer weiter verbessert recPV Erzeugung bis zu> 70 TU pro ausgesäte Zelle (4A), ohne das Auftreten von unerwünschten replikationsfähige virale Partikel (4B).

Abbildung 1. Vektoren auf Basis von autonomen Parvoviren. (A) Oben: Das Transgen ersetzt einen Teil der VP-kodierenden Gene und steht unter der Kontrolle der viralen Promotor P38. Die Gene für NS1 / 2 sind neugewartet und die Expression durch den viralen Promotor gesteuert P4. Die Vektor-Genom durch die parvoviralen ITRs, die cis-wirkende Elemente, die für die Replikation und Verpackung des rekombinanten Genom benötigt werden, enthalten flankiert. Unten: Ein Plasmid, das die VP-Gen unter entweder einem heterologen (zB CMV.) Oder autologe (zB P38.) Promotor (Px), wird in trans während der rekombinanten Produktion Parvovirus zugeführt, um für die Unterbrechung der strukturellen Gene ausgleichen in dem rekombinanten Genom. ITR, Inverted Terminal Repeat. Abbildung aus ⁴ angepasst. (B) Schematische Darstellung des klassischen Protokoll für die Herstellung von recPVs verwendet. HEK293T-Zellen transient mit viraler DNA (Vektor und Helferplasmiden) und nach drei Tagen transfiziert werden die Zellen gesammelt und Viren geerntet.

Abbildung 2. Herstellung von mit der recPVsHilfe des Ad-VP. (A) Schematische Karten von recPV und Ad-VP Genome. Die recPV enthält eine heterologe Transgen, die in der VP Region ersetzt. Die Ad-VP birgt das Parvovirus VP-Gen. (B) Schematische Darstellung des Protokolls in diesem Manuskript beschrieben. NB324K Zellen werden mit recPV und Ad-VP-Viren infiziert. Nach drei Tagen werden die Zellen geerntet und recPV Teilchen aus dem Zellysat gewonnen.

Abbildung 3. Die Stimulation der Produktion von recPV Adenovirus-basierte Plasmide pXX6. HEK293T-Zellen in 10-cm-Schalen ausgesät wurden mit pCMV / VP in Kombination mit PhH-1-GFP (A und B) oder PHH-1-Luciferase (C) transfiziert, um recPVs erzeugen. Gleichzeitig wurden die Zellen mit den Adenovirus-abgeleiteten Helferplasmiden pXX6 oder nicht, wie angegeben co-transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und durch drei Gefrier-und Auftau-Zyklen lysiert. Gleiche Volumina von CRUDE-Virus Extrakte wurden angewandt, um Indikatorzellen NBK, und Transduktion Assays wurden durchgeführt. (A) Repräsentative Aufnahmen, welche GFP-positiven Zellen im konfluenten Monolayer NB324K. (B) Quantifizierung der GFP-Transduktion Transduktion in Assays (TE) pro seeded Zelle exprimiert . (C) Quantifizierung der Luciferase-Aktivität als die relativen Luciferase-Einheiten (RLU) ausgedrückt. Die Luciferase-Assay wurde wie in El-Andaloussi et al. ^5. Säulen repräsentieren Mittelwerte aus drei Wiederholungen mit Standardabweichung Bars. Anzahl auf der + pXX6 Spalte in (B und C) zeigt die fachen Anstieg der recPV Virustiter, in Gegenwart von pXX6 versus ohne erhalten.

Abbildung 4. Die Stimulation der Produktion recPV mittels rekombinanter Ad-VP Helfervirus. (A) NB324K Zellen waren InfektionenTed mit gereinigtem Ad-VP Helfer-Virus bei einer MOI von 10 (Ad-X-Einheit / Zelle, titriert mit Adeno-X Rapid-Titer Kit), und dann Superinfektion mit einer der folgenden rekombinanten Parvovirus-Chi-HH-1-EGFP ¹¹ (0,1 TU / cell) oder H-1-GFP (0,5 TU / cell) ^5. Einen Tag nach der Infektion wurde das Medium gewechselt und zwei Tage später wurden die Zellen gesammelt und lysiert über drei Gefrier-und-Tau-Zyklen. Rohzellextrakte wurden verwendet, um Virustiter durch Transduktion Assay zu bestimmen nach El-Andaloussi et al. ^5. TU, Transduktion Einheit. (B) virale Chargen in der Gegenwart oder Abwesenheit von Ad-VP hergestellt wurden auf ihren Gehalt von Replikations-kompetenten Viruspartikel (NA) durch Plaque-Assay auf NB324K Indikator-Zellen analysiert.

Discussion

Wir haben gezeigt, dass recPV Produktion durch die Anwesenheit von adenoviralen Genom-Elemente erhöht werden kann. Wir haben die recPV Ausbeuten von mehr als 10-fach (0,3 bis 5 TU / Zelle) erhöht, indem Adenovirus genomische Element über Transfektion und durch mehr als 100-fach Co-Infizieren der Zellen mit Ad-VP-Helfer in Kombination mit dem in recPV Vergleich zu herkömmlichen Protokollen. Die hier beschriebene Protokoll kann durch die Bestimmung der am besten geeigneten Zeitpunkt für die Lieferung der Adenovirus-Genom-Elemente und die optimale Konzentration von Ad-VP Helfer für die Infektion verwendet werden optimiert werden.

RecPVs mit größeren Transgene (mehr als 1.600 Basen) sind weniger effizient produziert. Dies ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass durch Einfügen des Transgens, cis-wirkende Elemente, die für PV richtigen viralen DNA-Verpackung entfernt werden. Die optimale Größe des Transgens, die in der PV-Genom, ohne dabei die Produktion eingesetzt werden kann bis zu 700 Basiss ^6. Auch die Art des Transgens eingefügt beeinflussen können recPV Produktion (z. B.. Einfügen von Genen, die für zytotoxische Proteine ​​kann zu niedrigeren Erträgen führen recPV).

Ein weiterer wichtiger Aspekt in Betracht während recPVs Produktion zu nehmen ist das mögliche Auftreten von Replikations-kompetenten Viren (RCV), die spontan durch homologe Rekombination zwischen dem rekombinanten Parvovirus-und VP-haltigen Plasmide gebildet werden könnten. Die vorliegende Protokoll nicht verbessern die Rekombination Risiko. Dennoch ist eine NA Qualitätskontrolle routinemäßig durchgeführt werden sollte (zB. Plaque-Assay in NB324K Indikator Zellen ⁵⁾ am Ende der Produktionskette, um sicherzustellen, dass virale Bestände enthalten nur eine vernachlässigbare Menge an namentlichen Abstimmungen.

Die beschriebenen Protokoll überwindet früheren Beschränkungen in der Wahl der Verpackungs-Zelllinie verwendet, da es möglich macht die Verwendung von Zelllinien, die schwer zu transfizieren (unddaher nicht geeignet mit Protokollen auf der Basis der Transfektion), sondern sind gute Produzenten von PVs. zB. NB324K Zellen ^10, die in unseren Händen effizienter als bei der Herstellung recPVs HEK293T (Daten nicht gezeigt). Ein Screening von verschiedenen Zelllinien ist nun möglich, die Anwendung des neuen Protokolls, und könnte eine effizientere Zellen für recPV Produktion zu identifizieren. Dies ebnet auch den Weg zur weiteren Erforschung des Systems für die großtechnische Produktion von rekombinanten Parvovirus zB. in Bioreaktoren mit Zellen in Suspension.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
MEM	Sigma-Aldrich	M4655
F–tal Bovine Serum	PAA Laboratories	A15-101
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030-024
Fugene	Roche Group	047097050001
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300062
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E8263
Adeno-X Rapid Titer Kit	Clontech Laboratories	632250