Summary
यहाँ हम एक ही सेल संक्रमण है, जो उपयोग में अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में 100 से अधिक गुना से पुनः संयोजक parvovirus उत्पादन की दक्षता में सुधार पर आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन. यह प्रोटोकॉल का एक उपन्यास 5 - आधारित सहायक adenovirus में parvovirus उपाध्यक्ष प्रतिलेखन इकाई विज्ञापन (उपाध्यक्ष) युक्त का उपयोग पर निर्भर करता है.
Protocol
ध्यान दें कि एक जैव सुरक्षा स्तर 2 के साथ एक प्रयोगशाला पुनः संयोजक parvoviruses (recPV) के उत्पादन के लिए आवश्यक है.
प्रोटोकॉल दो मुख्य भागों में subdivided है. पहले भाग (recPV अभिकर्मक के माध्यम से उत्पादन) recPVs की न्यूनतम राशि है कि प्रोटोकॉल (संक्रमण के माध्यम से recPVs का उत्पादन) के दूसरे भाग में inoculum के रूप में कार्य करता है उत्पादन के लिए आवश्यक है. एक बार recPVs की एक छोटी राशि का उत्पादन है, प्रोटोकॉल के पहले भाग छोड़े गए किया जा सकता है, और पुनः संयोजक parvovirus केवल लिए adenovirus सहायक के माध्यम से parvovirus capsid प्रोटीन (देखें नीचे) के लिए जीन एन्कोडिंग उपलब्ध कराने के संक्रमण के माध्यम से परिलक्षित किया जा सकता है.
1. प्रोटोकॉल के माध्यम से recPVs का उत्पादन
1.1 वायरल डीएनए अभिकर्मक
यह संभव है या तो cationic लिपिड या कैल्शियम फॉस्फेट पर आधारित प्रोटोकॉल के इस अनुभाग में किसी भी स्थापित डीएनए अभिकर्मक विधि का उपयोग करें. हम आम तौर पर Fugene एचडी प्रोटोकॉल अभिकर्मक. अभिकर्मक क्षमता पर नियंत्रण करने के लिए, हम एक प्लाज्मिड व्यक्त बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे pEGFP-N1, Clontech) के साथ अतिरिक्त प्लेट transfecting करने के लिए सलाह देते हैं. अभिकर्मक कुशल और वायरस के उत्पादन के लिए इष्टतम माना जाता है जब सेल की आबादी का कम से कम 50% अभिकर्मक के बाद EGFP पॉजिटिव 24 घंटे परिणाम है.
- 1 दिन पहले अभिकर्मक, बीज एक 10 सेमी की थाली, अभिकर्मक के दिन पर 50% सेलुलर confluency के प्राप्त करने में 2 मिलियन HEK293T कोशिकाओं. है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 10 मिलीलीटर में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी एल glutamine, प्रति 100 मिलीलीटर पेनिसिलीन यू और 100 / μg मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन के अलावा के साथ कोशिकाओं के विकास.
- एक 1.5 मिलीग्राम ट्यूब में वायरस बनाने (01:02:01 दाढ़ अनुपात) मिश्रण तैयार:
- 3 recPV वेक्टर μg ब्याज की transgene (ईआइ phH 6-1-GFP) शरण.
- वेक्टर pCMV / 5 उपाध्यक्ष के 6 μg parvovirus capsid जीन इकाई शरण
- 8 μg ओच adenovirus व्युत्पन्न सहायक प्लाज्मिड 7 pXX6.
- Plasmids सीरम मुक्त करने के लिए 850 μl (20 एनजी / μl के अंतिम एकाग्रता) मध्यम के साथ मिश्रण पतला.
- 42.5 μl Fugene HD (: μg डीएनए 2.5:1 अनुपात μl Fugene के) जोड़ें. ट्यूब की ओर मत छूना जब मध्यम Fugene जोड़ने.
- 5-10 सेकंड के लिए धीरे भंवर.
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं.
- अभिकर्मक कोशिकाओं के लिए ड्रॉप के लिहाज से मिश्रण जोड़ें. समान रूप से भर मिश्रण वितरित थाली धीरे हिलाएँ.
1.2 वायरस उत्पादन
- 37 ° C पर 92% नमी और फसल से पहले 72 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ थाली सेते हैं. इस अवधि के दौरान संतान parvovirus कणों parvovirus प्लास्मिड से बनते हैं.
1.3 वायरस फसल
- एक ऊतक संस्कृति हुड में, उनके माध्यम के भीतर कोशिकाओं परिमार्जन, महाप्राण (व्यंजन) और एक 15 में निलंबन हस्तांतरण थाली सेमिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला के 95% निकालें.
- भंवर ट्यूब धीरे शेष सतह पर तैरनेवाला (लगभग 0.5 मिलीग्राम) में गोली resuspend.
- -80 में ट्यूब रुक डिग्री सेल्सियस यह संभव है इस स्तर पर उत्पादन बंद करने या प्रोटोकॉल के साथ जारी है.
- निलंबन defrost करने के लिए और यह कमरे के तापमान पर लाने के.
- निलंबन रुक एक तरल नाइट्रोजन और गर्म पानी में स्नान पिघलना में 37 डिग्री सेल्सियस भंवर 15 सेकंड के लिए सख्ती और फ्रीज पिघलना चक्र और दो बार दोहराना ट्यूबों.
- 4 में 15 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों डिग्री सेल्सियस
- एक ताजा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला लीजिए. इस स्तर पर ट्यूब कच्चे वायरस निकालने की तैयारी में शामिल है.
- वायरस अनुमापन (देखें नीचे) के साथ आगे बढ़ें. GFP जीन ले recPV के लिए, एक ठेठ उत्पादन 1-3 x 7 10 वायरल संक्रामक बारे में 1 से इसी इकाइयों देना चाहिए3 एक्स 10 10 वायरल जीनोम कणों से युक्त.
1.4 वायरस भंडारण
- लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 में कच्चे वायरस निकालने वाले ट्यूब स्थिर डिग्री सेल्सियस यह प्रोटोकॉल के दूसरे भाग में inoculum के रूप में कच्चे तेल की वायरल अर्क का उपयोग करने के लिए संभव है.
2. संक्रमण के माध्यम से recPVs का उत्पादन
संक्रमण के माध्यम से recPV उत्पादन के साथ शुरू करने से पहले उत्पादन, और 5 parvovirus उपाध्यक्ष मानक 8 प्रोटोकॉल के अनुसार जीन (सहायक विज्ञापन - उपाध्यक्ष, 5 में वर्णित) को लेकर Adenovirus शुद्ध. यह भी ब्याज की transgene (जैसे, अभिकर्मक के रूप में ऊपर वर्णित के माध्यम से उत्पादित) ले recPVs की एक न्यूनतम राशि के लिए आवश्यक है.
नीचे, हम 175 cm 2 (T175) कुप्पी प्रारूप में recPV उत्पादन का वर्णन. वायरस इस तरह से उत्पादित स्टॉक की आगे प्रवर्धन 10 बहुपरत CellSTACK संस्कृति कक्षों (Corning है) में आयोजित किया जा सकता हैसाथ प्रोटोकॉल के मामूली समायोजन का प्रस्ताव रखा.
2.1 संक्रमण
- 1 दिन पहले संक्रमण, प्लेट 10 लाख एक T175 कुप्पी में संक्रमण के दिन में 60-80% सेलुलर confluency प्राप्त NB324K कोशिकाओं. एक दूसरा एक नियंत्रण के रूप में कक्षों की एक ही नंबर (गैर संक्रमित कोशिकाओं) से युक्त कुप्पी तैयार करते हैं. प्रत्येक T175 एक अंतिम मात्रा, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी एल glutamine, प्रति मिलीलीटर Penicilin पर 100U और में स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 / μg मिलीलीटर के साथ पूरक के रूप में न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) के 20 मिलीग्राम होना चाहिए.
- अगली सुबह एक 2 मिलीलीटर प्लास्टिक मिलकर ट्यूब में वायरस मिश्रण तैयार:
- संक्रमण की बहुलता (MOI, संक्रामक इकाइयों / सेल) में 5 विज्ञापन VP-सहायक = 10 (1 x 10 8 संक्रामक इकाइयों के लिए इसी);
- MOI में recPVs = 0.5 (5 एक्स 10 6 संक्रामक इकाइयों के लिए इसी). सदस्य के साथ 1.5 मिलीग्राम के लिए पूरा करें.
- T175 कुप्पी में पूरे वायरस मिश्रण लागू करें.
- सेना2 घंटे के लिए 37 में कुप्पी डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता 92%, 5% सीओ 2 धीरे हर 15 मिनट मिलाते हुए.
- 37 पर आगे 20-24 घंटे के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता 92%, 5% सीओ 2.
- ताजा माध्यम के साथ सांस्कृतिक मध्यम बदलें.
2.2 वायरस उत्पादन
37 ° C पर 92% और 48 घंटे के लिए 5% सीओ 2 नमी के साथ बोतल सेते हैं. कुशल वायरल उत्पादन के संकेत के रूप में, cytotoxicity का स्पष्ट संकेत वायरल संक्रमित कोशिकाओं से युक्त कुप्पी में मनाया जाना चाहिए, 36-48 घंटे के बाद संक्रमण शुरू.
2.3 वायरस फसल
- एक ऊतक संस्कृति हुड में महाप्राण (व्यंजन), और एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में कुप्पी से मध्यम सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण.
- 1.5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो.
- 0.25% Trysin - EDTA के 1.5 मिलीग्राम के साथ कोशिकाओं Trypsinize. हटा मध्यम सेल निलंबन जोड़ें.
- कमरे गुस्सा कम 5 मिनट के लिए 5000 XG पर और सतह पर तैरनेवाला कोशिकाओं अपकेंद्रित्रature.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- सेल गोली और धीरे भंवर कोशिकाओं resuspend ट्यूब ते बफर के 1 मिलीग्राम (1 मिमी Tris - एचसीएल, 0.1 मिमी EDTA, 8.7 पीएच) जोड़ें.
- सेल निलंबन रुक एक तरल नाइट्रोजन और गर्म पानी में स्नान पिघलना में 37 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड के लिए ट्यूब सख्ती भंवर और फ्रीज पिघलना चक्र तीन बार दोहराएँ.
- 37 50 यू / एमएल 30 मिनट के लिए Benzonase Nuclease डिग्री सेल्सियस के साथ सेल निलंबन समझो क्रम में सेल जीनोमिक और गैर - पैक वायरल DNAs को पचाने के लिए.
- पर 5,000 XG पर 20 मिनट के लिए 4 बजे ट्यूब केंद्रापसारी डिग्री सेल्सियस
- एक ताजा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला लीजिए. इस स्तर पर कच्चे तेल की सतह पर तैरनेवाला वायरस निकालने की तैयारी में शामिल है. RecPV GFP की ठेठ पैदावार के बाद इस प्रोटोकॉल 1-10 x 10 8 वायरल संक्रामक इकाइयों की श्रेणी में होना चाहिए का उत्पादन किया.
2.4 वायरस भंडारण
- अल्पकालिक भंडारण के लिए (2 महीने अधिकतम), 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान वायरस
- लंदन के लिएजी अवधि भंडारण (2 माह से अधिक समय) -80 में दुकान वायरस डिग्री सेल्सियस
3. RecPV शोधन
- कच्चे lysates से recPVs की शुद्धि के लिए, हम करने के लिए एट अल के लिए अनुसार Zolotukhin एक Iodixanol discontinous ढाल चलाने की सलाह देते हैं 9. हम कुशल वायरस शुद्धि के लिए कच्चे वायरल निकालने (पांच T175 बोतल में उत्पादन से प्राप्त) के 5 मिलीलीटर की एक न्यूनतम का उपयोग करने की सलाह देते हैं.
4. पुनः संयोजक Parvovirus अनुमापन
- RecPV टाइट्रेट करना प्रदर्शन अल Andaloussi एट अल में वर्णित के रूप में 5.
5. गुणवत्ता नियंत्रण
- अल Andaloussi एट अल. 5 में वर्णित अवांछित सक्षम प्रतिकृति (RCV) NB324K सूचक कोशिकाओं में वायरस parvovirus पट्टिका परख बाहर ले जाने की उपस्थिति की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल का प्रयोग करें.
6. प्रतिनिधि परिणाम
RecPVs productio की एक उदाहरणn के के adenovirus जीनोमिक तत्वों की उपस्थिति या अनुपस्थिति में अभिकर्मक के माध्यम से 3 चित्र में दिखाया जाता है. सेल / pCMV उपाध्यक्ष (उपाध्यक्ष parvovirus capsid प्रोटीन के लिए जीन एन्कोडिंग ले जाने प्लाज्मिड) के साथ एक साथ ट्रांसफ़ेक्ट गया (एक recPV GFP जीन शरण) phH 1 GFP phH-1-luciferase या (एक recPV जुगनू luciferase जीन शरण) के साथ , (pXX6) के साथ या बिना (pXX6) pXX6 प्लाज्मिड (adenovirus ले जाने के E2A, E4 (orf6) और VA आरएनए जीन). कच्चे तेल की सेल के अर्क के बराबर मात्रा NB324K कोशिकाओं और GFP पारगमन या luciferase assays के रूप में अल Andaloussi एट अल की रिपोर्ट में प्रदर्शन किया गया 5. लागू किया गया. RecPVs उत्पादन में एक स्पष्ट वृद्धि pXX6 की उपस्थिति में 0.3 GFP transductional इकाइयों (टीयू) / सेल से उत्पादन में वृद्धि के साथ प्राप्त किया गया था लगभग 5 टीयू / सेल हमारे विधि (छवि 3 ए, बी) के बाद प्राप्त करने के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल के अनुसार प्राप्त की. RecPV producti के एक उल्लेखनीय वृद्धि (24 गुना के बारे में)पर phH-1 luciferase (छवि 3C) के मामले में भी मनाया गया इन परिणामों से संकेत मिलता है कि आनुवंशिक pXX6 में निहित सामग्री parvovirus उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए सक्षम है.
संक्रमण के माध्यम recPVs उत्पादन का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया जाता है. गया NB324K कोशिकाओं विभिन्न (के रूप में आकृति में संकेत) recPVs और विज्ञापन VP-सहायक (पीवी उपाध्यक्ष capsid प्रोटीन के लिए जीन एन्कोडिंग शरण) के साथ सह संक्रमित. विज्ञापन उपाध्यक्ष सहायक आगे बढ़ाया recPV उत्पादन के लिए> 70 वरीयता प्राप्त कोशिका प्रति अवांछनीय प्रतिकृति सक्षम वायरल कणों (4B छवि) की घटना में वृद्धि के बिना (4A छवि) टीयू.
आकृति 1. स्वायत्त parvoviruses पर आधारित वैक्टर. (ए): transgene उपाध्यक्ष कोडिंग जीन का हिस्सा की जगह और वायरल प्रमोटर p38 के नियंत्रण के अधीन है. / 2 NS1 के लिए जीन फिर से कर रहे हैंtained और उनकी अभिव्यक्ति वायरल प्रमोटर पी 4 के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. वेक्टर जीनोम parvoviral ITRS, जो सीआईएस से अभिनय तत्व है कि प्रतिकृति और पुनर्योगज जीनोम की पैकेजिंग के लिए आवश्यक हैं शामिल द्वारा flanked है. नीचे: एक प्लाज्मिड या तो एक (जैसे सीएमवी.) Heterologous, या ऑटोलॉगस (जैसे p38 है.) प्रमोटर (px) के तहत उपाध्यक्ष जीन ले जाने, पुनः संयोजक parvovirus उत्पादन के दौरान ट्रांस में आपूर्ति आदेश में संरचनात्मक जीनों के विघटन के लिए क्षतिपूर्ति पुनः संयोजक जीनोम में. आईटीआर, औंधा टर्मिनल दोहराने. चित्रा 4 से (बी) शास्त्रीय recPVs के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध दृश्य अनुकूलित. HEK293T कोशिकाओं transiently वायरल डीएनए (वेक्टर और सहायक प्लास्मिड) और तीन दिन के बाद के साथ में ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं, कोशिकाओं और एकत्र कर रहे हैं वायरस काटा.
चित्रा 2. RecPVs के साथ उत्पादनविज्ञापन उपाध्यक्ष की मदद. (ए) recPV और विज्ञापन उपाध्यक्ष जीनोम की योजनाबद्ध नक्शे. recPV heterologous transgene जो वीपी क्षेत्र का हिस्सा की जगह शामिल हैं. विज्ञापन उपाध्यक्ष है parvovirus उपाध्यक्ष जीन (बी) इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध दृश्य बंदरगाहों. NB324K कोशिकाओं recPV और विज्ञापन उपाध्यक्ष वायरस के साथ सह संक्रमित. के बाद तीन दिनों कोशिकाओं काटा और recPV कणों सेल lysate से बरामद.
चित्रा 3. Adenovirus आधारित pXX6 के प्लास्मिड द्वारा recPV उत्पादन की उत्तेजना. HEK293T कोशिकाओं, 10 सेमी बर्तन में वरीयता प्राप्त, / pCMV उपाध्यक्ष के साथ संयोजन में ट्रांसफ़ेक्ट गया है (ए और बी) phH 1 GFP phH-1-luciferase या (सी) के साथ recPVs उत्पादन. इसके साथ ही, कोशिकाओं adenovirus - व्युत्पन्न सहायक pXX6 प्लास्मिड या नहीं, के रूप में संकेत के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट. तीन दिन बाद अभिकर्मक, कोशिकाओं और काटा गया तीन स्थिर और पिघलना चक्र द्वारा lysed. Crud की बराबर मात्रासूचक कोशिकाओं एन बी ई वायरस के अर्क के लिए लागू किया गया, और पारगमन assays के बाहर किया गया (ए) प्रतिनिधि भीतर सहधारा NB324K monolayers GFP सकारात्मक कोशिकाओं दिखा micrographs (बी) GFP पारगमन assays की मात्रा प्रति वरीयता प्राप्त सेल पारगमन इकाई (टीयू) में व्यक्त किया. (सी) luciferase गतिविधि की मात्रा के सापेक्ष luciferase इकाइयों (RLU) के रूप में व्यक्त की है. luciferase परख के रूप में अल Andaloussi एट अल में वर्णित किया गया था 5. स्तंभ का प्रतिनिधित्व करते हैं तीन से औसत मूल्यों मानक विचलन सलाखों के साथ प्रतिकृति. + PXX6 स्तंभ के शीर्ष पर, (बी और सी), recPV वायरस titers में गुना वृद्धि हुई है, बिना बनाम pXX6 की उपस्थिति में प्राप्त इंगित करता है.
चित्रा 4. RecPV उत्पादन की पुनः संयोजक सहायक विज्ञापन उपाध्यक्ष वायरस के माध्यम से उत्तेजना. (ए) NB324K कोशिकाओं है, infec थेशुद्ध विज्ञापन वीपी 10 के MOI में सहायक वायरस (एक्स विज्ञापन इकाई / सेल, एडिनो एक्स तेज titer किट के साथ titrated) के साथ टेड, और तब या तो निम्नलिखित पुनः संयोजक parvovirus 11 ची HH-1-EGFP (0.1 के साथ superinfected टीयू /) या सेल (0.5 टीयू सेल /) एच 1 - GFP 5. एक दिन के बाद संक्रमण, मध्यम बदल गया था और दो दिन बाद, कोशिकाओं एकत्र किए गए थे और तीन फ्रीज पिघलना चक्र के माध्यम से lysed. क्रूड सेल के अर्क पारगमन परख वायरस titers निर्धारित अल Andaloussi एट अल के अनुसार इस्तेमाल किया गया 5. टीयू, पारगमन इकाई (बी) वायरल विज्ञापन उपाध्यक्ष की अनुपस्थिति की उपस्थिति में उत्पादन के बैचों प्रतिकृति पट्टिका परख द्वारा सक्षम वायरल (RCV) NB324K सूचक कोशिकाओं पर कणों की अपनी सामग्री के लिए विश्लेषण किया गया.
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Discussion
हम पता चला है कि recPV उत्पादन adenoviral जीनोमिक तत्वों की उपस्थिति से बढ़ाया जा सकता है. हम अभिकर्मक के माध्यम से adenovirus जीनोमिक तत्व प्रदान करते हैं और 100 से अधिक गुना सह संक्रमण में recPV साथ संयोजन में विज्ञापन उपाध्यक्ष सहायक के साथ कोशिकाओं से 10 गुना से अधिक (0.3 करने के लिए 5 टीयू / सेल से) द्वारा recPV पैदावार में वृद्धि हुई है पारंपरिक प्रोटोकॉल की तुलना. प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित आगे से adenovirus जीनोमिक तत्वों के वितरण और विज्ञापन उपाध्यक्ष सहायक का इष्टतम एकाग्रता के लिए संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा के लिए सबसे उपयुक्त समय का निर्धारण करने के द्वारा किया जा अनुकूलित कर सकते हैं.
बड़ा transgenes (1600 से अधिक कुर्सियां) के साथ RecPVs कम कुशलता से उत्पादित कर रहे हैं. यह शायद इस तथ्य यह है कि transgene डालने से, सीआईएस से अभिनय पी.वी. उचित वायरल डीएनए पैकेजिंग के लिए आवश्यक तत्वों को हटा रहे हैं के कारण है. transgene की अधिकतम आकार है कि इसके उत्पादन को प्रभावित किए बिना PV जीनोम में डाला जा सकता है 700 आधार करने के लिए है6 है. भी डाला transgene की तरह recPV उत्पादन (जैसे साइटोटोक्सिक प्रोटीन के लिए जीन एन्कोडिंग की प्रविष्टि कम recPV पैदावार में परिणाम हो सकते हैं) को प्रभावित कर सकता है.
एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू के लिए recPVs उत्पादन के दौरान ध्यान में ले है प्रतिकृति सक्षम वायरस के संभावित घटना (RCV) कि अनायास पुनः संयोजक parvovirus और वीपी युक्त plasmids के बीच मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से गठन किया जा सकता है. वर्तमान प्रोटोकॉल में पुनर्संयोजन जोखिम में वृद्धि नहीं करता है. फिर भी एक RCV गुणवत्ता नियंत्रण नियमित रूप से उत्पादन के अंत में किया जाना चाहिए (जैसे पट्टिका परख NB324K सूचक कोशिकाओं में 5) प्रदर्शन के क्रम में करने के लिए विश्वास दिलाता हूं कि वायरल स्टॉक केवल RCVs की एक नगण्य मात्रा में होते हैं.
वर्णित प्रोटोकॉल पैकेजिंग सेल लाइन प्रयोग किया जाता के चुनाव में पिछले सीमाओं पर काबू पा, के रूप में यह संभव है कि मुश्किल transfect करने के लिए कर रहे हैं (और सेल लाइनों का उपयोग प्रदानइसलिए से अभिकर्मक पर आधारित प्रोटोकॉल के साथ उपयुक्त नहीं), लेकिन पीवी के अच्छे निर्माता हैं. जैसे. NB324K 10 कोशिकाओं है कि हमारे हाथ में HEK293T से recPVs (नहीं दिखाया डेटा) के उत्पादन में और अधिक कुशल थे. विभिन्न सेल लाइनों की एक स्क्रीनिंग है अब संभव है नया प्रोटोकॉल लागू करने, और recPV उत्पादन के लिए और अधिक कुशल कोशिकाओं को पहचान सकता है. यह भी पुनः संयोजक parvovirus जैसे की बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए प्रणाली की आगे की खोज के लिए मार्ग प्रशस्त. निलंबन में कोशिकाओं के साथ बायोरिएक्टर में.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम विशेष मार्कस मुलर, सिल्विया Münstermann, बारबरा Liebetrau, और मैंडी Roscher के में DKFZ वायरस उत्पादन और विकास इकाई की टीम, धन्यवाद. इस अध्ययन में आंशिक रूप से शिक्षा और अनुसंधान (BMBF) और Helmholtz, Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle ग्रैंड स्था एप्लाइड ट्यूमर विषाणु विज्ञान में संयुक्त कार्यक्रम du के ढांचे में एसोसिएशन के संघीय मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M4655 | |
| F–tal Bovine Serum | PAA Laboratories | A15-101 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030-024 | |
| Fugene | Roche Group | 047097050001 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E8263 | |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech Laboratories | 632250 |
References
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