Summary
여기에는 오직 사용중인 다른 프로토콜에 비해 100 개 이상의 배 이상에 의한 재조합 파르 보 바이러스 생산의 효율성을 향상시켜 세포 감염에 기반 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 파르 보 바이러스의 부사장의 전송 단위 (광고-VP)를 포함하는 5-기반 도우미 소설 아데노 바이러스의 사용에 의존하고 있습니다.
Abstract
같은 쥐 H-1PV 및 MVM 등 설치류의 parvoviruses은 (PV), 작은 icosahedral, 단일 좌초된, DNA 바이러스입니다. 그들의 게놈은 각각 한 비 구조 (NS1과 NS2)과 capsid 단백질 (VP1과 VP2)의 표현을 조절이 발기인 P4와 P38을 포함합니다. 그들은 oncolytic 및 oncosuppressive 능력에 대한 anticancer 대리인의 인간 2 비 병원성하면서로서 높은 관심을 끌. NS1 바이러스는 세포 독성의 3 대 이펙터입니다. 추가로 천연 antineoplastic 활동을 강화하기 위해서는 이러한 벡터로부터 파생은 치료 transgene (예 : 세포 독성 폴리펩티드, 시토킨, 케모카인, 종양 억제 유전자 등) 4 capsid 단백질에 대한 유전자 인코딩 교체에 의해 생성되었습니다. 재조합 parvoviruses (recPVs)는 벡터가 NS1 / 2 코딩 시퀀스 및 바이러스성 DNA의 증폭 및 패키징에 필요한 PV의 게놈 telomeres을 유지합니다. 생산recPVs 단지별로 생산 세포 (일반적으로 HEK293T)에서 발생하는 공동 transfecting 부사장 단백질에 대한 유전자 인코딩 (그림 1) 4을 표현 두 번째 벡터 (pCMV-VP)으로 세포를. 이렇게 생성된 recPV 벡터는 복제에 결함이 있습니다. recPVs 그들이 생성되어있는 부모의 바이러스에 대하여 강화된 oncotoxic 활동을 소유 입증했지만, 그들의 생산을 주요 과제 남아 강력하게 안티 - 암 임상 응용에 이러한 에이전트의 사용을 hampers.
우리가 사용하는 다른 프로토콜에 비해 이상 10 배 이상으로 recPVs의 생산을 향상 HEK293T로 E2a, E4 (orf6) 및 VA RNA의 유전자 (예 : pXX6 플라스미드)를 포함하는 광고-5 파생된 벡터의 도입을 발견. 이 연구 결과를 바탕으로, 우리는 recPVs 생산을 강화하는 데 필요한 게놈 adenoviral 요소뿐만 아니라 parvovir 포함되어 AD-VP-헬퍼 소설을 만들었저희 부사장 유전자 단위 5. AD-VP-헬퍼의 사용은, 레크 리에 - 베트남 후 증후군의 생산 ((예 NB324K) 가능 transfect하기 어려운 세포 라인의 활용, 바이러스성 감염 단계 (같은 플라스미드 transfection 반대)에 전적으로 의존 프로토콜을 사용하여 수 그림. 2). 우리는 크게 최종 제품 5 품질에 영향을 미치지 않고, 생산 시간 및 비용을 모두 절감, 생산 재조합 바이러스의 양을 향상 방법을 제시한다. 또한, recPV의 대규모 생산은 (현탁액 세포와 bioreactors에서) 지금 생각할 수있다.
Protocol
biosafety 레벨 2 연구실은 재조합 parvoviruses (recPV)의 생산을 위해 필요합니다.
프로토콜은 두 가지 부분으로 세분화됩니다. 첫 번째 부분은 (transfection 통해 recPV 생산) 프로토콜의 두 번째 부분 (감염을 통해 recPVs 생산)에 inoculum 역할 recPVs의 최소한의 금액을 생산하는 데 필요합니다. 일단 recPVs의 작은 금액은 프로토콜의 첫 번째 부분을 생략할 수 있고, 생산하고 있으며, 재조합 파르 보 바이러스는 아데노 바이러스 헬퍼를 통해 파르 보 바이러스 capsid 단백질 (아래)에 대한 유전자 인코딩을 제공 감염을 통해 증폭하실 수 있습니다.
1. Transfection 통해 recPVs 생산
1.1 바이러스성 DNA의 transfection
그것도 양이온 lipids 또는 인산 칼슘을 기반 프로토콜의이 섹션에있는 기존의 DNA transfection 방법을 사용할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 Fugene H를 사용차원 Transfection 시약. transfection 효율을 제어하려면, 우리는 플라스미드 표현 향상된 녹색 형광 단백질 (예 : pEGFP-N1, Clontech)를 추가로 플레이트 transfecting을 권장합니다. 세포 인구의 50 % 이상은 EGFP 양성 24시간 transfection 후 결과 때 Transfection은 효율 및 바이러스 생산을위한 최적 간주됩니다.
- transfection 당일 50 % 세포 confluency 구하는 10cm 접시에서 transfection, 씨앗 2,000,000 HEK293T 전지 전 일일. 10% 태아 소 혈청, 2 개의 MM L-글루타민, ML 페니실린 당 100 U 및 100 μg / ML의 스트렙토 마이신의 추가와 함께 Dulbecco의 수정일 독수리 중간 (DMEM)의 10 ML에서 세포를 성장.
- 1.5 ML 관에서 바이러스 제작 혼합물을 (1시 2분 1초 어금니 비율) 준비 :
- recPV 벡터 3 μg 관심의 transgene (전자 통합 phH-1-GFP 6) 숨겨주.
- 벡터 pCMV / 부사장 5 6 μg는 파르 보 바이러스의 capsid 유전자 단위를 숨겨주
- 8 μg OF 아데노 바이러스 파생 헬퍼 플라스미드 pXX6 7.
- 850 μl (20 μl / NG의 최종 농도)에 혈청이없는 배지 최대로 plasmids 믹스를 희석.
- 42.5 μl Fugene HD을 (μg의 DNA 2.5:1 비율 μl의 Fugene) 추가합니다. 매체에 Fugene을 추가할 때 튜브의 측면을 만지지 마십시오.
- 5-10초 대한 부드럽게 소용돌이.
- 30 분간 실온에서 혼합되어 알을 품다.
- transfection의 혼합물 셀에 드롭 지혜를 추가합니다. 균등에 걸쳐 혼합 배포 부드럽게 접시를 흔들어.
1.2 바이러스 생산
- 수확 전에 72 시간 92% 습도 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 품어. 이 기간 동안 자손의 파르 보 바이러스 입자는 파르 보 바이러스의 plasmids에서 형성된다.
1.3 바이러스 수확
- 조직 문화 후드에서 15로 접시에서 정학을, 그들의 매체 내의 세포를 밀고 대기음 및 전송ML 플라스틱 튜브.
- 상온에서 5 분 250 XG에 튜브를 원심 분리기.
- 뜨는의 95 %를 제거합니다.
- 와동 튜브 부드럽게 남은 뜨는 (0.5에 대한 ML)에 펠렛을 resuspend합니다.
- -80에서 튜브를 고정 ° C. 그것은이 단계에서 생산을 중단하거나 프로토콜을 계속하는 것이 가능합니다.
- 현탁액을 서리를 없애다하고 실온에서 가져옵니다.
- 37 따뜻한 물에 액체 질소 욕조, 해동에 서스펜션을 고정 ° C. 와동 노골적인 협상을 15 초 및 냉동 해동 사이클 추가로 두 번 반복 튜브.
- 4에서 15 분에 해당하는 16,000 XG에 튜브를 원심 ° C.
- 새로운 튜브로 뜨는 수집합니다. 이 단계에서 튜브 원유 바이러스 추출물 준비가 포함되어 있습니다.
- 바이러스 적정 (아래)을 진행합니다. GFP 유전자를 나르는 recPV 들어, 일반적인 생산은 약 1 ~ 대응 1-3 X 10 7 바이러스성 전염성 단위를 제공한다 -3 * 10 10 바이러스성 게놈은 입자를 포함하는.
1.4 바이러스 저장
- 장기 보관의 경우 -80에서 원유 바이러스 추출물이 들어있는 튜브를 고정 ° C. 이 프로토콜의 두 번째 부분에 inoculum 등 원유 바이러스 추출물을 사용할 수 있습니다.
2. 감염을 통해 recPVs 생산
감염을 통해 recPV 생산부터 시작하기 전에, 생산 및 아데노 표준 프로토콜 여덟에 따라 파르 보 바이러스 부사장 유전자 (AD-부사장 헬퍼, 5에서 설명)을 들고 5 정화. 또한 관심의 transgene을 (예를 들어, 위에서 설명한대로 transfection을 통해 생산) 휴대 recPVs의 최소한도 필요합니다.
아래, 우리는 175cm 두 플라스크 (T175) 형식으로 recPV 생산을 설명합니다. 이렇게 생산되는 바이러스 주식 더 증폭은 10 다층 CellSTACK 문화 챔버 (코닝)에 실시됩니다프로토콜의 사소한 조정 제안과 함께.
2.1 감염
- 감염의 날에 60~80% 세포 confluency 구하는 T175 플라스크에 감염, 플레이트 10,000,000 NB324K 전지 전 일일. 컨트롤과 같은 세포의 같은 수의 (비 감염된 세포를) 포함하는 두 번째 플라스크를 준비합니다. 각 T175은 5 % 태아 소 혈청, 2 개의 MM L-글루타민, ML Penicilin 당 100U과 100 μg / ML 스트렙토 마이신과 보완 최종 볼륨으로 최소 필수 중간 (MEM)의 20 ML이 있어야합니다.
- 다음날 아침 구성된 2 ML 플라스틱 튜브에 바이러스 혼합물을 준비 :
- 감염의 다수 (입니다만, 전염성 단위 / 셀)에서 AD-VP-헬퍼 5 = 10 (1 X 10 8 전염성 단위에 해당);
- 입니다만에서 recPVs = 0.5 (5 × 10 6 전염성 단위에 해당). MEM으로 1.5 ML을 완료합니다.
- T175 플라스크 중 하나에서 전체 바이러스 혼합물을 적용합니다.
- 을 품어37 2 시간 용 플라스크는 ° C, 92 %의 습도가 5 % CO 2 부드럽게 매 15 분 흔들어.
- 37 이상 20-24 시간 동안 품어 ° C, 92 %의 습도 5 % CO 2.
- 신선한 매체와 문화 매체를 교체합니다.
2.2 바이러스 생산
48 시간 동안 92% 습도와 5 % CO 2와 37 ° C에서 flasks을 품어. 효율적인 바이러스 생산은 표시대로, 세포 독성의 명확한 징후는 36~48시간 후 감염을 시작, 바이러스 감염된 세포가 들어있는 플라스크에서 관찰되어야한다.
2.3 바이러스 수확
- 조직 문화 후드에서 기음과 50 ML의 원심 관에 플라스크에서 배지 표면에 뜨는을 전송.
- 1.5 ML PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 0.25 % Trysin-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 1.5 ML과 세포 Trypsinize. 제거 매체에 세포 현탁액을 추가합니다.
- 객실 기질에서 5 분 5,000 XG의 세포 표면에 뜨는을 원심 분리기ature.
- 뜨는 폐기하십시오.
- 세포 펠렛과 부드럽게 소용돌이 세포 resuspend하는 튜브에 TE 버퍼 1 ML (1 MM 트리스-HCL, 0.1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.7) 추가합니다.
- 37 따뜻한 물에 액체 질소 욕조, 해동에 세포 현탁액을 고정 ° C. 15 초 용 튜브 적극적으로 소용돌이와 동결 - 해동주기를 세 번 반복합니다.
- 세포 게놈 및 비 포장 바이러스 DNAs을 소화하기 위해 37 30 분 50 U / ML Benzonase Nuclease ° C와 세포 현탁액을 취급합니다.
- 4에서 20 분 동안 5,000 XG에 튜브를 원심 ° C.
- 새로운 튜브로 뜨는 수집합니다. 이 단계에서 뜨는가 조강 바이러스 추출물 준비가 포함되어 있습니다. recPV-GFP의 일반적인 수율이 프로토콜 1-10 X 10 8 바이러스성 전염성 단위의 범위에 있어야 다음을 생산했다.
2.4 바이러스 저장
- 4 ° C.의 단기 저장을위한 (최대 2 개월), 상점 바이러스
- 경도의 경우-80에서 g 기간 스토리지 (이상 2 개월), 상점 바이러스 ° C.
3. RecPV 정화
- 원유 lysates에서 recPVs의 정화에 대해서는 Zolotukhin 외 따라 Iodixanol discontinous 기울기를 실행하는 것이 좋습니다. 9. 우리는 효율적인 바이러스 정화를위한 원유 바이러스성 추출물 (5 T175 flasks 생산에서 얻은) 5 ML 최소를 사용하는 것이 좋습니다.
4. 재조합 파르 보 바이러스 적정
- 엘 - Andaloussi 외에 설명된대로 recPV 적정 수행 5.
5. 품질 제어
- NB324K 표시기 세포에서 파르 보 바이러스 플라크 분석 수행 원치 않는 복제를 관할 바이러스 (RCV)의 존재를 확인하기 위해 엘 - Andaloussi 외 5.에 설명된 프로토콜을 사용합니다.
6. 대표 결과
recPVs productio의 예N 아데노 바이러스 게놈 요소의 유무에 transfection을 통해 그림 3에 표시됩니다. 세포 phH-1-GFP (recPV가 GFP 유전자를 숨겨주) 또는 phH-1-루시페라제 (recPV는 반딧불의 루시페라제 유전자를 숨겨주)와 함께 pCMV / 부사장 (VP의 파르 보 바이러스 capsid 단백질에 대한 유전자 인코딩을 나르는 플라스미드)로 transfected되었다 와 (+ pXX6) 또는없는 (-pXX6) pXX6 플라스미드 (아데노 바이러스를 운반 E2A, E4 (orf6) 및 VA RNA의 유전자). 원유 세포 추출물의 평등 볼륨은 엘 - Andaloussi 외에 보도된대로 셀 및 GFP를 형질 도입이나 루시페라제 assays이 수행되었다. 5 NB324K 적용되었습니다. recPVs 생산 명확 증가는 우리의 방법 (그림 3A, B)에 따라 얻은 약 5 튜브 / 감방으로 기존의 프로토콜에 따라 생산 0.3 GFP transductional 단위 (TU) / 세포에서 증가로 pXX6의 면전에서 얻은 얻은 것입니다. recPV producti의 상당한 증가 (24 배 정도)에서 또한 phH-1-루시페라제 (그림 3C)의 경우에서 관찰되었다. 이러한 결과는 pXX6에 포함된 유전 물질이 파르 보 바이러스 생산을 증대 수 있음을 나타냅니다.
감염을 통해 recPVs 생산의 대표적인 예제는 그림 4에 표시됩니다. NB324K 전지는 다양한 recPVs (같은 그림에 표시된)와 AD-VP-헬퍼 (PV 부사장 capsid 단백질에 대한 유전자 인코딩을 품고)와 함께 공동 감염되었다. 최대 AD-부사장 도우미 더욱 향상된 recPV 생산에> 바람직하지 복제 능력이 바이러스성 입자 (그림 4B)의 발생을 증가하지 않고 씨앗을 품고 세포 당 70 TU (그림 4A).
1 그림. 벡터는 자율 parvoviruses에 기초. () 홈 : transgene은 부사장 코딩하는 유전자의 일부를 대체하고 바이러스 발기인 P38의 통제하에있다. NS1 / 2 유전자가 다시있다tained과 그 표현은 바이러스성 발기인 P4에 의해 제어됩니다. 벡터 게놈은 복제와 재조합 게놈의 패키징에 필요한 CIS-연기 요소를 포함 parvoviral ITRs, 어귀 있습니다. 하단 : 플라스미드 (예 CMV.) 중 heterologous 또는 autologous (예 : P38.) 발기인 (PX)에서 VP-유전자를 나르는 구조 유전자의 장애 보상하기 위해 재조합 파르 보 바이러스 제작 중에 트랜스에 공급됩니다 재조합 게놈 인치 ITR, 거꾸로 터미널 반복. 그림 4에서 적응. recPVs의 생산에 사용되는 고전적인 프로토콜의 (B) 도식보기. HEK293T 세포 transiently 바이러스성 DNA (벡터 및 헬퍼 plasmids)와 함께 3 일 후에 transfected하고 세포를 모으고 바이러스가 수확됩니다.
그림 2. 함께 recPVs 생산광고 - 부사장의 도움이됩니다. recPV 및 광고 - 부사장 genomes의 () 도식지도. recPV은 부사장 지방의 일부를 대체 heterologous transgene이 포함되어 있습니다. AD-부사장은 파르 보 바이러스 부사장 유전자을 비호.이 원고에 기술된 프로토콜의 (B) 도식보기. NB324K 전지는 recPV 및 광고 - 부사장 바이러스와 공동 감염됩니다. 삼일 전지는 수확 및 recPV 입자는 세포 lysate로부터 복구 후.
그림 3. 아데노 바이러스 기반 plasmids pXX6 의한 recPV 생산의 자극. 10cm 접시에 놓는 HEK293T 세포는, recPVs을 생산 phH-1-GFP (A와 B) 또는 phH-1-루시페라제 (C)와 함께 pCMV / 부사장으로 transfected되었다. 동시에 세포가 아데노 파생 헬퍼 plasmids pXX6 말거나 같은 지적과 함께 공동 transfected되었다. 사흘 후 transfection, 세포의 세 동결과 해동 사이클에 의해 수확 및 lysed되었습니다. crud의 균등 권전자 바이러스 추출물이 표시등 세포를 NBK 적용되었으며, 형질 도입의 assays가 실시되었다. () 합류 NB324K의 monolayers 내에서 GFP 양성 세포를 보여주는 대표 micrographs 있습니다. (B) GFP를 형질 도입의 assays의 부량는 씨앗을 품고 세포 당 형질 도입 단위 (TU)로 표시 . (C) 루시페라제 활동의 부량 상대 루시페라제 단위 (RLU)로 표현. 엘 - Andaloussi 외에 설명된대로 루시페라제 분석이 수행되었다. 5. 열 세의 평균 값은 표준 편차 바와 복제 나타냅니다. + pXX6 칼럼의 맨 위에 숫자에서는 (B 및 C)없이 적어 넣은 pXX6의 면전에서 얻은 recPV 바이러스 titers의 배 증가를 나타냅니다.
4 그림. 재조합 AD-부사장 도우미 바이러스에 의한 recPV 생산의 자극. () NB324K 세포가 infec 있었다다음 입니다만 10시 정화 AD-부사장 도우미 바이러스 (광고-X 단위 / 셀, Adeno-X 신속한 Titer Kit에 titrated)와 테드, 다음과 같은 재조합 파르 보 바이러스 치 HH-1-EGFP 11 (0.1 자중 superinfected TU는 / 휴대폰) 또는 H-1-GFP (0.5 TU / 셀) 5. 어느 날 이후의 감염, 매체가 변경되었고 이틀 후, 세포가 수집되었다 세 냉동 및 해동 사이클을 통해 lysed. 원유 세포 추출물은 엘 - Andaloussi 외에 따른 도입 분석하여 바이러스 titers를 결정하는 데 사용되었다. 5. TU, 형질 도입 단위. (B) AD-부사장 부재의 면전에서 생산되는 바이러스성 배치는 NB324K 표시등 세포에 플라크 분석하여 복제 능력이 바이러스성 입자 (RCV) 자신의 콘텐츠를 분석했다.
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Discussion
우리는 recPV 생산은 adenoviral 게놈 요소의 존재에 의해 향상될 수있는 것으로 나타났습니다. 우리는 transfection 통해 아데노 바이러스 게놈 요소를 제공함으로써 관련 recPV와 함께 광고 - 부사장 - 도우미와 100 개 이상의 접이식 공동 감염 세포에 의해 10 개 이상의 배 (0.3-5 TU / 셀)에 의해 recPV 수율을 증가 기존의 프로토콜에 비해. 프로토콜은 더욱 아데노 바이러스 게놈 요소의 전달 및 감염에 사용하도록 AD-부사장 도우미의 최적 농도에 가장 적합한 타이밍을 결정함으로써 최적화할 수 있습니다 여기에서 설명한.
큰 transgenes (이상 1600 기지)와 RecPVs은 덜 효율적으로 생산됩니다. 이것은 아마도 transgene을 삽입하여, PV 적절한 바이러스성 DNA의 포장에 필요한 CIS-연기 요소가 제거됩니다 사실 때문입니다. 생산에 영향을주지 않고 PV의 게놈에 삽입하실 수 있습니다 transgene의 최적 크기는 700 기지에 달려있다의 6. 또한 삽입된 transgene의 종류 recPV 생산 (예. 세포 독성 단백질에 대한 인코딩 유전자의 삽입은 낮은 recPV의 수율을 초래할 수)에 영향을 줄 수 있습니다.
recPVs 생산시 고려 되려면 또 다른 중요한 측면은 자발적 재조합 파르 보 바이러스 및 VP-함유 plasmids 간의 동종 재조합을 통해 형성 수 복제를 관할 바이러스의 가능한 발생 (RCV)입니다. 현재 프로토콜은 재조합 위험을 향상되지 않습니다. 그럼에도 불구하고 RCV 품질 관리는 정기적으로 그 바이러스성 주식에만 RCVs의 무시할 금액을 포함하는 보장하기 위해 생산의 끝에 (예. 상패 분석 NB324K 표시기 전지 5) 수행하여야한다.
그것이 (그리고 transfect하기 어렵습 세포 라인의 사용을 가능한 렌더링으로 기술된 프로토콜은, 사용된 패키징 세포주의 선택은 이전의 한계를 극복따라서 transfection을 기반 프로토콜로 적합)하지만이 베트남 후 증후군의 좋은 생산자입니다. 예. 우리 손에 HEK293T (데이터가 표시되지 않음) 이상의 recPVs 생산에 더 효율적이라고 NB324K 세포 10. 다른 세포 라인의 심사는 새로운 프로토콜을 적용 이제 가능하고 recPV 생산을 위해보다 효율적인 세포를 식별할 수 있습니다. 이것은 또한 재조합 파르 보 바이러스 등과의 대규모 생산을위한 시스템의 추가 탐사로가는 길을 불법 체류자. 현탁액의 세포와 bioreactors 인치
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
우리는 특히 마커스 뮐러, 실비아 Münstermann, 바바라 Liebetrau와 맨디 Roscher에서 DKFZ 바이러스 생산과 개발 단위의 팀을 감사드립니다. 이 연구는 부분적으로 교육과 연구 (BMBF)와 Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle 뒤 그랜드 - 예상 응용 Tumour 바이러스학의 공동 프로그램의 프레임 워크의 Helmholtz 협회의 연방 교육부에서 교부금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M4655 | |
| F–tal Bovine Serum | PAA Laboratories | A15-101 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030-024 | |
| Fugene | Roche Group | 047097050001 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E8263 | |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech Laboratories | 632250 |
References
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