Summary
ここでは、使用中の他のプロトコルに比べて100倍以上の組換えパルボウイルスの生産効率を向上させる細胞の感染に基づいて、プロトコルを記述します。このプロトコルは、パルボウイルスのVP転写ユニット（AD-VP）を含む新規のアデノウイルス5ベースのヘルパーの使用に依存しています。
Abstract
例えばラットH-1PVとMVMなどの齧歯類パルボウイルスは、（PV）、小さな正二十面体、一本鎖のDNAウイルスである。それらのゲノムは、それぞれ1非構造（NS1とNS2）とカプシド蛋白（VP1およびVP2）の発現を調節する2つのプロモーターP4とP38が含まれています。人間の2の非病原性でありながら、彼らは腫瘍溶解性とoncosuppressive能力のための抗癌剤として高い関心を集めている。 NS1は、ウイルスの細胞毒性3の主要なエフェクターである。さらに彼らの自然な抗腫瘍活性を高めるために、これらのベクトルからの誘導体は、治療遺伝子（ 例えば、細胞毒性ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、腫瘍抑制遺伝子等）4とキャプシド蛋白質をコードする遺伝子を置換することによって生成されました。組換えパルボウイルス（recPVs）ベクターはウイルスDNAの増幅およびパッケージングするために必要なNS1 / 2コード配列とPVゲノムのテロメアを維持します。の生産recPVsはVPタンパク質（ 図1）4をコードする遺伝子を発現する第二のベクター（のpCMV-VP）で細胞を共トランスフェクトすることにより、プロデューサー細胞（一般にHEK293T）でのみ発生します。この方法で生成されたrecPVベクターは、複製欠損である。 recPVsは、それらが生成された元の親ウイルスに対する強化されたoncotoxic活性を有することがわかっていますが、それらの生産が主要な課題であると強く抗がん剤の臨床応用におけるこれらの薬剤の使用を妨げます。
我々は、使用中の他のプロトコルと比較してより10倍recPVsの生産を向上させたHEK293TにE2A、E4（ORF6）とVA RNA遺伝子（ 例えば pXX6プラスミド）を含むAD-5由来ベクターの導入は見つかりました。この知見に基づいて、我々はrecPVs生産などparvovirを強化するために必要なゲノムのアデノウイルスの要素を含む小説広告-VP-ヘルパーを構築した私達VP遺伝子ユニット5。広告-VP-ヘルパーの使用は、可能な限り（ 例えば NB324K）トランスフェクションが困難な細胞株を利用して、ウイルス感染の手順（のようなプラスミドトランスフェクションとは対照的に）に完全に依存するプロトコルを使用して、REC-PVの生産を可能にする（ 図2）。我々は非常に最終製品の5の品質に影響を与えることなく、生産時間とコストの両方を削減し、産生された組換えウイルスの量を向上させる手法を提案する。さらに、recPVの大規模生産は（浮遊細胞とバイオリアクター）で現在考えられる。
Protocol
バイオセーフティーレベル2実験室、組換えパルボウイルス（recPV）の生産に必要とされることに注意してください。
プロトコルは、主に2つの部分に分割されます。最初の部分（トランスフェクションを介してrecPVの生産）プロトコルの2番目の部分（感染症を介してrecPVsの生産）に接種としてrecPVs最小限の量を生成する必要があります。一度recPVs少量のプロトコルの最初の部分は省略することができ、生成され、組換えパルボウイルスは、アデノウイルスヘルパーを介してパルボウイルスキャプシドタンパク質（下記参照）をコードする遺伝子を提供する感染症を介して増幅することができます。
1。トランスフェクションを介したrecPVsの生産
1.1ウイルスDNAトランスフェクション
これは、いずれかのカチオン性脂質またはリン酸カルシウムに基づくプロトコルのこのセクション内の任意の確立されたDNAトランスフェクション法を使用することが可能です。我々は一般的にトランスフェクションHを使用Dトランスフェクション試薬。トランスフェクション効率を制御するために、我々は、発現プラスミド強化緑色蛍光タンパク質（ 例えば、pEGFPを-N1、Clontech社製）で追加のプレートをトランスフェクトすることをお勧めします。細胞集団の少なくとも50％がEGFP陽性トランスフェクション24時間後の結果時にトランスフェクション効率とウイルス産生のための最適と考えられている。
- トランスフェクションの前に1日、10 cmのプレートでシード200万HEK293T細胞、トランスフェクションの日で50％コンフルエントの細胞を取得する。 10％ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、mlペニシリン100 Uおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）10mlの細胞を成長させる。
- 1.5 mlチューブでウイルス意思混合物（モル比1時02分01秒）を準備
- recPVベクトル3μgのは、関心のある遺伝子（EI PHH-1-GFP 6）を保有する。
- ベクターpCMV / VP 5保有するパルボウイルスキャプシド遺伝子単位の6μgの
- 8μgのOFアデノウイルス由来のヘルパープラスミドpXX6 7。
- 850μL（20 ng /μlに最終濃度）の無血清培地を有するプラスミドミックスを希釈する。
- 42.5μlのトランスフェクションのHD（：μgのDNA 2.5:1の比率添加トランスフェクション）を追加します。媒体へのトランスフェクションを追加するときにチューブの側面に触れないでください。
- 5〜10秒間静かに渦。
- 室温で30分間混合物をインキュベートします。
- 細胞にトランスフェクション混合物の滴下を追加します。均等に全体に混合物を配布するために静かにプレートを横に振る。
1.2ウイルス産生
- 収穫前に72時間、92％湿度、5％CO 2で37℃でプレートをインキュベートします。この期間の間に子孫パルボウイルス粒子は、パルボウイルスプラスミドから形成される。
1.3ウイルスの収穫
- 組織培養フードには、それらの培地内で細胞をこすり、15にプレートから懸濁液を吸引し、転送mlのプラスチックチューブ。
- 室温で5分間250×gでチューブを遠心します。
- 上清の95％を削除します。
- ボルテックスチューブは穏やかに残りの上清（約0.5 ml）にペレットを再懸濁します。
- -80チューブを凍結℃にこの段階では生産を停止するか、またはプロトコルを続行することが可能です。
- 懸濁液を解凍し、室温でそれを持って来る。
- 37℃温水で液体窒素浴融解℃で懸濁液を凍結ボルテックス15秒精力的にチューブとさらに2回の凍結融解サイクルを繰り返します。
- 4℃で15分間16,000 xgでチューブを遠心℃、
- 新しいチューブに上清を収集します。この段階では、チューブは、粗製ウイルス抽出の準備を含んでいます。
- ウイルス滴定（下記参照）に進みます。 GFP遺伝子を運ぶrecPVについては、典型的な生産量は約1に対応する1から3×10 7のウイルス感染単位を与えるべきである-3×10 10ウイルスゲノムは、粒子を含有する。
1.4ウイルスストレージ
- 長期保存のために-80℃で原油ウイルス抽出物を含有するチューブを凍結℃にプロトコルの第二部に接種として粗ウイルスの抽出物を使用することが可能です。
2。感染経由recPVsの生産
感染症を介してrecPVの生産を開始する前に、標準プロトコル8に従ってパルボウイルスVP遺伝子（AD-VPヘルパー、5で説明）を運ぶアデノウイルス5を生産し、精製する。それはまた、興味のある遺伝子（ 例えば 、上述したようにトランスフェクションを介して生成）を運ぶrecPVsの最小量を持っていることが必要である。
以下では、175cm 2のフラスコ（T175）形式でrecPV生産を説明します。この方法で産生されたウイルス株のさらに増幅は10多層CellSTACK培養室（コーニング）で行うことができる提案プロトコルのマイナー調整を加えたものである。
2.1感染症
- 感染症の日に60から80パーセントの細胞密集度を得るためのT175フラスコ内の感染症、プレート千万NB324K細胞の前に1日。コントロール（非感染細胞）と同じ数のセルを含む第2のフラスコを準備します。各T175は5％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、ML Penicilin当たり100U、100μg/ mlのストレプトマイシンを補充し、最終容量として最小必須培地（MEM）20 mlを持っている必要があります。
- 翌朝は、以下から構成される2 mlのプラスチックチューブでウイルス混合物を準備します。
- 感染多重度（MOI、感染単位/細胞）で広告-VP-ヘルパー5 = 10（1×10 8感染単位に相当する）。
- MOI = 0.5（5×10 6感染単位に相当）でrecPVs。 MEMで1.5ミリリットルに完了します。
- T175フラスコのいずれかで、全体のウイルスの混合物を適用します。
- インキュベート37℃で2時間フラスコ°C、92％湿度、5％CO 2静かに15分毎に揺れ。
- 37℃でさらに20〜24時間インキュベート°C、92％湿度、5％CO 2。
- 新鮮な培地で文化的な培地を交換してください。
2.2ウイルス産生
48時間92％湿度、5％CO 2で37℃でフラスコをインキュベートします。効率的なウイルス産生の指標として、細胞毒性の明確な兆候は36から48時間後に感染を開始し、ウイルス感染細胞を含むフラスコに観察する必要があります。
2.3ウイルスの収穫
- 組織培養フード内で、50 mlの遠心チューブにフラスコから培地上清を吸引し、転送します。
- 1.5ミリリットルをPBSで2回細胞を洗浄します。
- 0.25パーセントTrysin-EDTA 1.5 mlで細胞をトリプシン処理。除去培地に細胞懸濁液を追加します。
- 部屋の温度で5分間5000×gで細胞と上清を遠心分離ature。
- 上清を捨てる。
- 細胞ペレットを、ゆっくりとボルテックス細胞を再懸濁するためのチューブにTE緩衝液1ml（1 mMのトリス-HCl、0.1mMのEDTA、pHは8.7）を追加します。
- 37℃温水で液体窒素浴融解℃で細胞懸濁液を凍結15秒間激しくボルテックスチューブと凍結融解サイクルを3回繰り返します。
- 細胞ゲノムと非パッケージ化ウイルスDNAを消化するために、37℃で30分間50 U / mlのベンゾナーゼヌクレアーゼ°Cで細胞懸濁液を扱います。
- 4℃で20分間5000×gでチューブを遠心℃、
- 新しいチューブに上清を収集します。この段階で上澄み液は、粗製ウイルス抽出の準備を含んでいます。このプロトコルは、次の生産recPV-GFPの典型的な収量は1〜10×10 8ウイルス感染単位の範囲でなければなりません。
2.4ウイルスストレージ
- 4℃で短期間保存用（最大2ヶ月）、ストアウイルス
- LONのためにグラム長期保存（2ヶ月以上）、-80ストアウイルス℃、
3。 RecPV精製
- 粗ライセートからrecPVsの精製の ために、我々はZolotukhin らによるとイオジキサノール不連続勾配を実行することをお勧めします。9。我々は効率的なウイルス精製用原油のウイルスエキス（5 T175フラスコでの生産から得られる）を5mlの最小値を使用することをお勧めします。
4。組換えパルボウイルス滴定
- エルAndaloussi らに記載されrecPV滴定を行います。5
5。品質コントロール
- エルAndaloussi らに記述されたプロトコルを使用しています。5 NB324Kインジケーター細胞にパルボウイルスのプラークアッセイを実施する望ましくない複製コンピテントウイルス（RCV）の存在を確認する。
6。代表的な結果
recPVs productioの例nはアデノウイルスゲノムの要素の存在下または非存在下でトランスフェクションを介して図3に示します。細胞はPHH-1-GFP（recPVは、GFP遺伝子を有する）、またはPHH-1-ルシフェラーゼ（recPVは、 ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有する）と一緒のpCMV / VP（VPパルボウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を運ぶプラスミド）をトランスフェクトした、と（+ pXX6）の有無にかかわらず（-pXX6）プラスミドpXX6（アデノウイルスE2A、E4（ORF6）とVA RNA遺伝子を運ぶ）。粗細胞抽出物の等量エルAndaloussi らに報告されている細胞とGFP形質導入またはルシフェラーゼアッセイを行った。5 NB324Kに適用されました。 recPVs生産の明確な増加は、提案手法（ 図3A、B）後に得られる約5 TU /セルに、従来のプロトコルに従って生産が0.3 GFP达ユニット（TU）/セルから増加に伴ってpXX6の存在下で得られた。 recPV productiの大幅な増加（24倍程度）上でも、PHH-1-ルシフェラーゼ（ 図3C）の場合に観察された。これらの結果は、pXX6に含まれる遺伝物質は、パルボウイルスの産生を高めることができることを示しています。
感染経由recPVs生産の代表例を図4に示します。 NB324K細胞は、様々なrecPVs（図に示される）およびAd-VP-ヘルパー（PV VPキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を保有する）と共感染させた。アップシードセルあたり> 70 TU（ 図4A）するには、Ad-VPヘルパーさらに強化recPV生産望ましくない複製コンピテントウイルス粒子（ 図4B）の発生を増加させずに。
図1。自律的なパルボウイルスに基づくベクター。 （A）トップ：導入遺伝子は、VP-コードする遺伝子の一部を置き換え、ウイルスプロモーターP38の制御下にある。 NS1 / 2の遺伝子が再されている慣らしとその発現は、ウイルスプロモーターP4によって制御されます。ベクターゲノムは複製と組換えゲノムのパッケージングに必要なシス作用性要素が含まれているパルボウイルスITRは、に挟まれています。底部：プラスミド（ 例えば 、CMV）のいずれか異種、または自家（ 例えば、P38）プロモーター（PX）の下にVP-遺伝子を担持する構造遺伝子の破壊を補償するために、組換えパルボウイルスの生産時にトランスに供給されている組換えゲノムインチITR、逆方向末端反復。図4から適応。recPVsの製造に使用される古典的なプロトコルの（B）の模式図。 HEK293T細胞は一過性ウイルスDNA（ベクターとヘルパープラスミド）をトランスフェクトされ、三日後、細胞を採取し、ウイルスが収穫されます。
図2。とrecPVsの生産広告-VPのに役立ちます。 recPVおよびAd-VPゲノムの（A）の回路図にマップされます。 recPVはVP領域の一部を置き換え、異種遺伝子を含んでいます。広告-VPは、パルボウイルスVP遺伝子を抱いている。本稿で説明されたプロトコルの（B）の回路図ビューでは、。 NB324K細胞はrecPVおよびAd-VPウイルスと共感染している。三日後に細胞を回収しており、recPV粒子が細胞溶解物から回収した。
図3。アデノウイルスベースのプラスミドpXX6によってrecPV生産の刺激 。 10cmディッシュに播種したHEK293T細胞は、recPVsを生成するためにPHH-1-GFP（AおよびB）またはPHH-1-ルシフェラーゼ（C）との組み合わせでのpCMV / VPでトランスフェクトした。同時に、細胞が示すように、アデノウイルス由来のヘルパープラスミドpXX6かどうか、と共トランスフェクトした。三日間、トランスフェクション後、細胞を3回の凍結融解サイクルにより回収し、溶解した。クラッドの等量eのウイルス抽出物をインジケータセルをNBKに適用され、伝達アッセイを行った。（）コンフルエントNB324K単層内でGFP陽性細胞を示す代表的な顕微鏡写真を示す。（B）GFPトランスダクションアッセイの定量は、シードのセルごとに伝達ユニット（TU）で表される（C）ルシフェラーゼ活性の定量化は、相対ルシフェラーゼ単位（RLU）で表されます。エルAndaloussi らで説明したようにルシフェラーゼアッセイを行った。5。列は、3からの平均値が標準偏差バーを複製する表しています。 + pXX6列の先頭の数は、（A、BおよびC）では、pXX6の対せず存在下で得られたrecPVウイルス価の倍の増加を、示しています。
図4。組換え広告-VPヘルパーウイルスによるrecPV生産の刺激。 （A）NB324K細胞は、感染したその後、MOI 10で精製した広告-VPヘルパーウイルス（AD-Xユニット/細胞、アデノ-X迅速タイターキットを用いて滴定）とテッド、次の組換えパルボウイルスカイ-HH-1-EGFP 11（0.1のどちらかとsuperinfected TU /セル）またはH-1-GFP（0.5 TU /セル）5。一日感染後、培地を変更しました2日後、細胞を採取し、3回の凍結と融解を介して溶解した。粗細胞抽出物は、エル·Andaloussi らによると伝達アッセイによりウイルス力価を決定するために使用された5。 TU、伝達ユニットは、（B）AD-VPの不在の存在下で産生さウイルスバッチはNB324Kインジケーター細胞上のプラークアッセイにより複製コンピテントウイルス粒子（RCV）の、その内容について分析した。
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Discussion
我々はrecPV生産はアデノウイルスゲノムの要素の存在によって増強することができることを示している。私達はでrecPVとの組み合わせでトランスフェクションを介してアデノウイルスゲノムの要素を提供することによって、およびAd-VP-ヘルパーと100以上の倍の共感染細胞による10以上の倍（0.3から5 TU /セルから）でrecPV収率を増加している従来のプロトコルとの比較。ここで説明するプロトコルは、アデノウイルスゲノムの要素と感染症に使用される広告-VPヘルパーの最適濃度の配信のために最も適切なタイミングを決定することにより、さらに最適化することができます。
大規模遺伝子（1,600以上の拠点）とRecPVsが少なく効率的に生産されています。これはおそらく、導入遺伝子を挿入することにより、PV、適切なウイルスDNAのパッケージングに必要なシス作用性要素が削除された事実によるものである。その生産に影響を与えることなく、PVのゲノムに挿入することができ、導入遺伝子の最適なサイズは、700拠点までですの6。また、挿入遺伝子の並べ替えはrecPV生産（ 例えば 。細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子の挿入が低いrecPVの利回りになります）影響を与える可能性があります。
recPVsの製造時に考慮して取るために別の重要な側面は、自発的に組換えパルボウイルスとVP-を含有するプラスミド間の相同組換えを介して形成することができた複製コンピテントウイルス（RCV）発生の可能性があります。現在のプロトコルは、組換えのリスクを高めることはありません。それにもかかわらず、RCVの品質管理は、定期的にウイルス株がRCVsのは無視できる程度の量が含まれていることを保証するために生産の終了時に（ 例えば 。NB324Kインジケータセル5のプラークアッセイ）を実行する必要があります。
それが（とトランスフェクションが困難な細胞株の使用を可能にレンダリングとして記述されたプロトコルは、使用されるパッケージング細胞株の選択に以前の制限を克服トランスフェクションに基づいてプロトコルとそのために適していない）が、PVの優れたプロデューサーである。 例えば、。私たちの手にHEK293T（データは示さず）よりrecPVsの生産に、より効率的であることをNB324Kセル10。異なる細胞株のスクリーニングは、新しいプロトコルを適用することが可能になりました、とrecPV生産のためのより効率的な細胞を同定することができます。これはまた、組換えパルボウイルスなどの大規模生産のためのシステムの更なる探査への道が開けます。懸濁液中の細胞とバイオリアクターインチ
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は、特定のマーカス·ミュラー、シルビアミュンスターマン、バーバラLiebetrau、とマンディロッシャーで、DKFZウイルスの生産と開発部のチームに感謝しています。本研究では、部分的に教育研究（BMBF）とドイツKrebsforschungszentrum /Cancéropôleデュグランドエスト応用腫瘍ウイルスの共同プログラムの枠組みの中で、ヘルムホルツ協会の連邦省からの補助金によって支えられてきた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M4655 | |
| F–tal Bovine Serum | PAA Laboratories | A15-101 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030-024 | |
| Fugene | Roche Group | 047097050001 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E8263 | |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech Laboratories | 632250 |
References
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