Summary
VisioTracker लार्वा और छोटे वयस्क आँख आंदोलनों की रिकॉर्डिंग के आधार पर मछली के दृश्य प्रदर्शन के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक स्वचालित प्रणाली है. यह दृश्य उत्तेजना गुण और वास्तविक समय विश्लेषण पर पूरा नियंत्रण सुविधाओं, दृश्य प्रणाली के विकास और समारोह, औषध विज्ञान, तंत्रिका सर्किट अध्ययन और ज्ञानेन्द्रिय एकीकरण के रूप में इस तरह के क्षेत्रों में उच्च throughput अनुसंधान सक्षम.
Abstract
दृश्य प्रणाली के विकास और समारोह में जांच दृश्य प्रदर्शन के quantifiable व्यवहार मॉडल है कि प्रकाश में लाना आसान, मजबूत, और सरल हेरफेर करने के लिए कर रहे हैं की जरूरत है. एक उपयुक्त मॉडल optokinetic (OKR) की प्रतिक्रिया एक reflexive सभी अपने उच्च चयन मूल्य के कारण रीढ़ में मौजूद व्यवहार में पाया गया है. OKR तेजी resetting saccades साथ alternated आँखों की धीमी प्रोत्साहन निम्नलिखित आंदोलनों शामिल है. इस व्यवहार के माप zebrafish लार्वा में आसानी से बाहर किया जाता है, अपनी प्रारंभिक और स्थिर (पूरी तरह से 96 घंटे के बाद निषेचन (HPF) के बाद विकसित) शुरुआत और zebrafish आनुवंशिकी के बारे में पूरी जानकारी से benefitting के कारण एक इष्ट मॉडल के दशकों के लिए, इस क्षेत्र में जीवों. इस बीच वयस्क मछली में इसी तरह के तंत्र का विश्लेषण औषधीय और विषाक्तता अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से महत्व प्राप्त की है.
यहाँ हम VisioTracker का वर्णन है, एक पूरी तरह से स्वचालित, उच्च throughpuदृश्य प्रदर्शन के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए प्रणाली. प्रणाली प्रो स्टेपहान Neuhauss के समूह में बाहर किए गए शोध पर आधारित है और त्से सिस्टम्स द्वारा फिर से डिजाइन किया है. यह छोटे से एक उच्च गुणवत्ता वाले वीडियो कैमरा एक उच्च संकल्प ज़ूम लेंस के साथ सुसज्जित द्वारा निगरानी की मछली के लिए एक immobilizing डिवाइस के होते हैं. मछली कंटेनर एक ड्रम स्क्रीन से घिरा हुआ है, जिस पर कंप्यूटर जनित प्रोत्साहन पैटर्न पेश किया जा सकता है. आँख आंदोलनों दर्ज की गई है और स्वचालित रूप से वास्तविक समय में VisioTracker सॉफ्टवेयर पैकेज से विश्लेषण कर रहे हैं.
डेटा विश्लेषण धीमी और तेज चरण अवधि आंदोलन चक्र आवृत्ति, धीमी गति से चरण लाभ, दृश्य तीक्ष्णता, और इसके विपरीत संवेदनशीलता के रूप में इस तरह के मानकों के तत्काल मान्यता के लिए सक्षम बनाता है.
विशिष्ट परिणाम उदाहरण के लिए दृश्य प्रणाली म्यूटेंट कि जंगली प्रकार morphology में कोई स्पष्ट परिवर्तन दिखाने की तेजी से पहचान की है, या मात्रात्मक प्रभाव के निर्धारण की अनुमति औषधीय या विषाक्त और mutagenicदृश्य प्रणाली के प्रदर्शन पर एजेंट.
Protocol
1. मछली के प्रजनन
भ्रूण रखा और मानक स्थितियों (2002 ब्रांड) के तहत उठाया और दिनों के बाद निषेचन (DPF) में विकास के अनुसार मंचन किया. 5 DPF और वयस्कों लार्वा मापन के लिए उपयोग किया गया.
2. प्रायोगिक प्रक्रिया
- साधन की तैयारी
लार्वा: मछली लार्वा% 3 में एम्बेडेड थे पूर्व गर्म (28 डिग्री सेल्सियस) methylcellulose शरीर के आंदोलनों को रोकने के लिए. भ्रूण पृष्ठीय पक्ष रखा गया VisioTracker में पेश स्क्रीन का सामना करना पड़ रहा है. वयस्क मछली: मछली 300 mg / l MS-222 में संक्षेप anesthetized थे, immobilizing डिवाइस में फिट और VisioTracker में रखा. इससे पहले मापन शुरू किए गए, वे 1-2 मिनट के लिए ठीक करने के लिए छोड़ दिया गया.
- प्रोत्साहन पैटर्न की पीढ़ी
प्रोत्साहन ऊर्ध्वाधर काला और सफेद साइन लहर मछली के आसपास घूर्णन gratings के मिलकर पैटर्न बनाया गया थामालिकाना सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग. वे सॉफ्टवेयर पैकेज के माध्यम से संग्राहक लहर फार्म, इसके विपरीत, तीव्रता, कोणीय गति और स्थानिक आवृत्ति के अनुसार हो सकता है. पैटर्न एक डिजिटल प्रकाश VisioTracker के भीतर निहित प्रोजेक्टर का उपयोग कर स्क्रीन पर पेश किया गया. मछली की आंख और स्क्रीन के बीच अनुमानित दूरी 4.5 सेमी, और प्रक्षेपण आकार और परदे पर 360 डिग्री क्षैतिज खड़ी 55 डिग्री था. लार्वा मछली के लिए उत्तेजना की दिशा 0.33 हर्ट्ज की एक आवृत्ति के साथ एनीमेशन आवृत्ति को कम करने के लिए बदल दिया गया था. वयस्क मछली unidirectionally प्रेरित थे और केवल अस्थायी नाक दिशा में प्रेरित आंख माना था, के बाद नाक, अस्थायी सामान्य में आंख वेग काफी कम और कम स्थिर है (म्यूएलर और Neuhauss, 2010 को देखें).
- आँख आंदोलनों की रिकॉर्डिंग
मछली सिर के एक उज्ज्वल मैदान छवि एक अवरक्त वीडियो कैमरा तंग आ गया था. मछली की इन्फ्रारेड रोशनी च प्रभावित थानीचे रोम. कैमरा 5 फ्रेम / 2 (लार्वा) या 12.5 फ्रेम / 2 (वयस्क) की दर पर छवियों क्रमशः दर्ज की गई. छवियों को स्वचालित रूप से संसाधित कर रहे हैं, सही है और आंख के आकार के लिए smoothed. क्षैतिज अक्ष के संबंध में नेत्र उन्मुखीकरण तो स्वचालित रूप से निर्धारित किया गया था और आंख वेग मालिकाना सॉफ्टवेयर पैकेज द्वारा गणना की गई. मछली के छोटे आंदोलनों स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर के द्वारा किए गए के लिए सही है. सभी रिकॉर्डिंग और विश्लेषण वास्तविक समय में हासिल की थी.
3. पोस्ट - प्रयोगात्मक डाटा प्रोसेसिंग
- आंख वेग कच्चा मापन saccades के लिए फ़िल्टर क्रम में धीमी गति चरण वेग निकालने.
- एनीमेशन फ़िल्टर्ड आंख वेग घटता 7 फ्रेम के एक स्लाइडिंग खिड़की के साथ एक चल औसत से smoothed थे.
- नेत्र वेग समान प्रोत्साहन शर्तों के साथ फ्रेम के औसत से अधिक था.
- लार्वा मछली के लिए, आंख वेग दोनों आंखों पर औसतन किया गया था.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
लार्वा Zebrafish के लिए, बम्पर उत्परिवर्ती चुना गया था. इस उत्परिवर्ती लेंस, उपकला कोशिकाओं hyperproliferate, कम लेंस के आकार और लेंस के अस्थानिक स्थान के लिए अग्रणी. इन morphological परिवर्तन इसके विपरीत संवेदनशीलता और दृश्य तीक्ष्णता (Schonthaler एट अल, 2010) का एक महत्वपूर्ण कमी से परिलक्षित होते हैं. चित्रा 1 जंगली प्रकार भाई बहन बनाम बम्पर म्यूटेंट के विपरीत संवेदनशीलता में अंतर को दर्शाता है बम्पर म्यूटेंट तेजी प्रोत्साहन विपरीत घटने के रूप में नजर वेग को समायोजित करने में विफल. सादृश्य से, जब प्रोत्साहन स्थानिक आवृत्ति में वृद्धि हुई है, यानी उत्तेजना धारी चौड़ाई कम है, बम्पर म्यूटेंट वैसे ही दृश्य तीक्ष्णता (2 छवि) कम दिखाना है
वयस्क Zebrafish visua की निर्भरतापर्यावरण की स्थिति पर एल प्रदर्शन उनके टैंक पानी में 30 मिनट के लिए शराब की सांद्रता को अलग करने के लिए मछली subjecting और बाद बदलती प्रोत्साहन की शर्तों के तहत optokinetic प्रतिक्रिया को मापने के द्वारा जांच की गई. वयस्क Zebrafish जब शराब सांद्रता में वृद्धि (3 छवि) में बनाए रखा इसके विपरीत संवेदनशीलता में एक उल्लेखनीय कमी दिखाते हैं. जब मछली बढ़ती शराब सांद्रता (4 छवि) के साथ इलाज किया गया स्थानिक आवृत्तियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर एक समान खुराक पर निर्भर समग्र आंख वेग के कमी को देखा जा सकता है. शराब उपचार इसके अलावा खुराक-dependently अधिक कार्य की मांग के रूप में वृद्धि की प्रोत्साहन गति (5 छवि) द्वारा उदाहरण में oculomotor प्रदर्शन को कम कर देता है.
चित्रा 1 Zebrafish लार्वा आंख वेग प्रोत्साहन विपरीत पर निर्भर है. 10 बम्पर म्यूटेंट और 10 प्रकार के जंगली भाई बहन 5 DPF में एस बदलती के तहत विश्लेषण किया गया timulus धारी विपरीत परिस्थितियों. औसत आँख ± वेग 1 SEM ग्राफ़ दिखाता है.
चित्रा 2 Zebrafish लार्वा आंख वेग स्थानिक आवृत्ति पर निर्भर करता है. 10 बम्पर म्यूटेंट और 10 प्रकार के जंगली भाई बहन 5 DPF में विभिन्न प्रोत्साहन पट्टी चौड़ाई के अधीन थे और विश्लेषण के रूप में वर्णित है. औसत आँख ± वेग 1 SEM ग्राफ़ दिखाता है.
चित्रा 3 वयस्क Zebrafish इसके विपरीत संवेदनशीलता में शो शराब एकाग्रता पर निर्भर कमी. वयस्क Zebrafish शराब सांद्रता अलग रूप में 30 मिनट के लिए संकेत और बदलती प्रोत्साहन धारी विपरीत शर्तों के तहत विश्लेषण में बनाए रखा गया है. (N = 11 नियंत्रण समूह के अलावा) औसत लौकिक नाक आंख वेग ± 1 समूह प्रति 9 मछली के SEM ग्राफ़ दिखाता है.
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चित्रा 4 वयस्क Zebrafish प्रोत्साहन धारी चौड़ाई की एक विस्तृत श्रृंखला पर शो में अल्कोहल की एकाग्रता पर निर्भर समग्र नेत्र आंदोलन में कमी. वयस्क Zebrafish शराब सांद्रता अलग रूप में 30 मिनट के लिए संकेत और बदलती प्रोत्साहन धारी चौड़ाई शर्तों के तहत विश्लेषण में बनाए रखा गया है. (N = 11 नियंत्रण समूह के अलावा) औसत लौकिक नाक आंख वेग ± 1 समूह प्रति 9 मछली के SEM ग्राफ़ दिखाता है.
5 चित्रा वयस्क Zebrafish प्रोत्साहन गति की एक विस्तृत श्रृंखला पर समग्र नेत्र आंदोलन में शो शराब एकाग्रता पर निर्भर कमी. वयस्क Zebrafish शराब सांद्रता अलग रूप में 30 मिनट के लिए संकेत और उत्तेजना की स्थिति बदलती गति के तहत विश्लेषण में बनाए रखा गया है. औसत लौकिक नाक आंख वेग ± 1 समूह (नियंत्रण समूह को छोड़कर प्रति 9 मछली के SEM ग्राफ़ दिखाता है:n = 11).
Discussion
दृश्य समारोह के अध्ययन के लिए OKR के महत्व को एक लंबे समय (ईस्टर और निकोला 1996, 1997) के लिए वैज्ञानिक समुदाय में मान्यता प्राप्त किया गया है, और अच्छी तरह से करने के लिए वास्तव में प्रतिमान मात्रा ठहराना करने का प्रयास शुरू कर दिया है एक दशक पहले. ईस्टर और निकोला (1996) मोटर चालित धारीदार ड्रम, जहां नेत्र आंदोलन की वीडियो रिकॉर्डिंग मैन्युअल रूप से विश्लेषण किया गया था घूर्णन के साथ एक प्रणाली विकसित की है. इस प्रणाली मछली भ्रूण, जो अक्सर repositioning पुस्तिका की आवश्यकता के स्थिरीकरण की कमी से पीड़ित है, और बड़ी मुश्किल से ही आँखों के ट्रैकिंग आंदोलनों का पता लगा सकता है. एक कदम आगे एक वीडियो अनुमानित धारीदार ड्रम का उपयोग करने के लिए अधिक चर कंप्यूटर उत्पन्न उत्तेजना प्रस्तुति (. Rinner एट अल, 2005A Roeser Baier, 2003) के लिए अनुमति देने के लिए किया गया था.
ज्यादातर मैनुअल, वीडियो टेप रिकॉर्डिंग के फ्रेम दर फ्रेम विश्लेषण बेहद श्रमसाध्य साबित हो गया है, और एक निश्चित डिग्री करने के लिए प्रेक्षक (पूर्वाग्रह बेक एट अल. द्वारा बाधा उत्पन्न,2004). वास्तविक समय में स्वचालित विश्लेषण व्यवहार प्रतिक्रिया सीखने तंत्र (मेजर एट अल, 2004) के उपयोग की अनुमति देने का सुझाव दिया गया था. अवरक्त रोशनी और आवृत्ति नियंत्रित घूर्णन उत्तेजनाओं का उपयोग बेक एट अल द्वारा बीड़ा उठाया है (2004). हालांकि, इस प्रणाली वर्णित वहाँ केवल लार्वा के लिए इस्तेमाल किया गया है, और विश्लेषण किया गया बंद लाइन. इसके अलावा, VisioTracker प्रयोग के दौरान प्रोत्साहन को बदलने सहित उत्तेजनाओं, पर पूरा नियंत्रण की अनुमति देता है, जिससे अधिक से अधिक लचीलापन और प्रयोग के पाठ्यक्रम पर सहज प्रभाव की अनुमति. इसके अलावा, डिजिटल प्रोत्साहन VisioTracker द्वारा इस्तेमाल निर्माण पहले एक धारीदार प्रोत्साहन ड्रम (बेक एट अल, 2004) के निष्क्रिय जन के त्वरण के साथ समस्याओं का उल्लेख किया overcame.
Methylcellulose द्वारा लार्वा संयम काफी नेत्र आंदोलन के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है और अच्छी तरह से किया जा रहा है zebrafish पर कोई दीर्घकालिक प्रभाव नहीं है. मछली लार्वा सफलतापूर्वक किया गया हैmethylcellulose में कई दिनों के लिए बनाए रखा एम्बेडेड, जब तक त्वचा के माध्यम से ऑक्सीजन की आपूर्ति बढ़ती उम्र (Qian एट अल, 2005) के साथ मांग के लिए अपर्याप्त हो जाता है.
वयस्क मछली निरोधक विधि जानवर पर भी उतना ही आसान है. , तेजी से परीक्षण के लिए एक अलग से एक पशु का आदान प्रदान के विकल्प के साथ मिलकर प्रयोग से कम की अवधि आगे सकारात्मक पशु कल्याण प्रणाली के पहलुओं के लिए कहते हैं. गहरे नाले के बाद से लगातार पानी से प्लावित कर रहे हैं, यह कील आँख आंदोलनों और दृश्य प्रदर्शन पर उसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए पसंद के किसी भी रासायनिक साथ पानी के लिए सुविधाजनक है. इसी तरह धोने बाहर प्रयोग प्रयोगों के बीच पशुओं को संभालने की जरूरत के बिना जोड़ा जा सकता है.
वीडियो चित्र में पिक्सेल शोर स्वामित्व VisioTracker सॉफ्टवेयर के एल्गोरिदम चौरसाई द्वारा कम से कम किया गया था, नेत्र स्थिति और कोणीय वेग के बेहद सटीक माप सक्षम. इसके अलावा, सांख्यिकीय को सुविधाजनक बनाने के लिएविश्लेषण, सॉफ्टवेयर बाहर saccadic आंदोलनों जो निश्चित वेग में होते हैं और प्रयोगात्मक बयान करने के लिए योगदान नहीं फ़िल्टर्ड. 7 वीडियो तख्ते पर वेग घटता के एक औसत के बाद विश्लेषण की सुविधा.
VisioTracker कई विभिन्न अनुसंधान के क्षेत्रों के लिए एक नया आयाम खोलता है. प्रणाली और अपने पूर्ववर्तियों की पहले से ही सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है zebrafish लार्वा में दृश्य प्रदर्शन यों, दृश्य तीक्ष्णता, इसके विपरीत संवेदनशीलता और प्रकाशानुकूलन (Rinner एट अल, 2005A, Schonthaler एट अल, 2010) के रूप में इस तरह के मानकों का उपयोग, कार्य से विश्लेषण के लिए दृश्य पारगमन (जैसे Rinner एट अल, 2005b, Renninger एट अल, 2011) झरना या उत्परिवर्ती zebrafish (जैसे Schonthaler एट अल, 2005, लार्वा 2008 में दृश्य दोषों के विश्लेषण के सदस्यों के हेरफेर के बाद कोन photoreceptors, Bahadori एट अल., 2006). दृश्य प्रणाली के morphological और कार्यात्मक परिपक्वता के अन्योन्याश्रयOKR मापन द्वारा अध्ययन किया गया है दिखाने के लिए मुख्य रूप से है, लेकिन उस दृश्य तीक्ष्णता फोटोरिसेप्टर रिक्ति से लार्वा चरणों (Haug एट अल, 2010) में पूरी तरह से सीमित नहीं हैं.
VisioTracker समान रूप से वयस्क zebrafish और अन्य समान आकार की मछली प्रजातियों (म्यूएलर और Neuhauss (2010), इस रिपोर्ट) में दृश्य समारोह का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है.
यह भी बोधगम्य विष विज्ञान या औषध जिससे जांच की जा पदार्थ पानी वयस्क मछली गहरे नाले के आसपास के प्रवाह के लिए जोड़ा जा सकता है के रूप में इस तरह के क्षेत्रों में अनुसंधान प्रणाली का उपयोग करने के लिए. इसके अलावा, VisioTracker की बहुमुखी प्रतिभा दृश्य समारोह, तंत्रिका सर्किट समारोह और विकास, ज्ञानेन्द्रिय या नियंत्रण (हुआंग और Neuhauss, 2008 में समीक्षा देखें) के ontogenetics के उदाहरण के लिए अधिक गहन विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है.
Disclosures
ओलिवर डॉ. Schnaedelbach और Holger डी. Russig त्से सिस्टम GmbH के कर्मचारियों कि दृश्य प्रदर्शन ट्रैकिंग प्रणाली का उत्पादन इस लेख में इस्तेमाल कर रहे हैं. इस लेख का उत्पादन त्से सिस्टम GmbH द्वारा प्रायोजित किया गया था. स्टेपहान CF Neuhuass जो त्से सिस्टम्स द्वारा प्रत्येक बेचा प्रणाली के लिए पारिश्रमिक प्राप्त ज्यूरिख विश्वविद्यालय के एक कर्मचारी है.
Acknowledgments
KPM यूरोपीय संघ FP7 (RETICIRC) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
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