Summary
El VisioTracker es un sistema automatizado para el análisis cuantitativo de los resultados visuales de peces adultos de larvas y pequeños basados en el registro de los movimientos oculares. Cuenta con un control total sobre propiedades de los estímulos visuales y análisis en tiempo real, permitiendo la investigación de alto rendimiento en áreas como el desarrollo del sistema visual y la función, la farmacología, los estudios neuronales del circuito y la integración sensoriomotora.
Abstract
Las investigaciones sobre el desarrollo del sistema visual y la función necesario cuantificar los modelos de comportamiento de los resultados visuales que son fáciles de obtener, robusto y fácil de manipular. Un modelo adecuado se ha encontrado en la respuesta optocinético (okr), un comportamiento reflexivo presente en todos los vertebrados, debido a su valor de alta selección. El okr implica lento siguientes estímulos movimientos de ojos rápidos alternados con movimientos sacádicos reposición. La medición de este comportamiento es fácil de llevar a cabo en las larvas de pez cebra, debido a su aparición temprana y estable (completamente desarrollado después de 96 horas después de la fecundación (HPF)), y se benefician de los conocimientos a fondo sobre el pez cebra genética, desde hace décadas uno de los modelos favorecidos organismos en este campo. Mientras tanto, el análisis de mecanismos similares en peces adultos ha adquirido mayor importancia, particularmente para aplicaciones farmacológicas y toxicológicas.
A continuación se describe VisioTracker, un sistema totalmente automatizado, de alto rendimiento del sistema de análisis cuantitativos de rendimiento visual. El sistema se basa en investigaciones llevadas a cabo en el grupo del Prof. Stephan Neuhauß y fue re-diseñado por Sistemas de EET. Se trata de un dispositivo de inmovilización para los peces pequeños controlados por una cámara de vídeo de alta calidad, equipado con una lente de zoom de alta resolución. El contenedor de pescado está rodeado por una pantalla de tambor, en el que los patrones generados por computadora estímulo puede ser proyectada. Los movimientos del ojo se registran y analizan de forma automática por el paquete de software VisioTracker en tiempo real.
El análisis de datos permite el reconocimiento inmediato de parámetros tales como la duración de la fase lenta y rápida, la frecuencia del ciclo de movimiento, el aumento lento de la fase, la agudeza visual y la sensibilidad al contraste.
Los resultados típicos permiten, por ejemplo, la rápida identificación de los mutantes del sistema visual que no muestran ninguna alteración evidente en la morfología de tipo salvaje, o la determinación de los efectos cuantitativos de agentes farmacológicos o tóxicos y mutagénicos en el rendimiento del sistema visual.
Protocol
1. La cría de peces
Los embriones se mantienen y se crió en condiciones normales (Marca 2002) y por etapas de acuerdo al desarrollo de la fertilización días después (DPF). Adultos y larvas en 5 fdd fueron utilizados para las mediciones.
2. Procedimiento experimental
- Preparación de instrumentos
Larvas: Las larvas fueron incorporados en el 3% de pre-calentado (28 ° C) metilcelulosa para evitar los movimientos del cuerpo. Los embriones fueron colocados lado dorsal en el VisioTracker, frente a la pantalla de proyección. Los peces adultos: Los peces fueron anestesiados brevemente en 300 mg / l MS-222, equipado en el dispositivo de inmovilización y se coloca en el VisioTracker. Antes de que se iniciaron las mediciones, se quedaron para recuperarse durante 1-2 min.
- Generación de patrones de estímulos
Patrones de estímulos consiste en vertical, negro y blanco de onda senoidal rejillas girando alrededor de los peces fueron creados con el paquete de software propietario. Que puede ser modulada a través del paquete de software de acuerdo a la forma de onda, frecuencia de contraste, la intensidad, la velocidad angular y espacial. Los patrones fueron proyectadas sobre la pantalla con un proyector de luz digital contenida en el VisioTracker. La distancia aproximada entre el ojo del pez y la pantalla fue de 4,5 cm y tamaño de la proyección en pantalla era de 360 grados en horizontal y 55 º verticalmente. Para larvas de peces, la dirección de la estimulación se alteró con una frecuencia de 0,33 Hz para reducir la frecuencia sacada. Los peces adultos fueron estimulados unidireccional y sólo el ojo estimulado en lo temporal a la dirección nasal se consideró, ya que nasal a temporal la velocidad del ojo en general es mucho menor y menos constante (se refieren a Mueller y Neuhauß, 2010).
- Grabación de los movimientos oculares
Una imagen de campo claro de la cabeza del pez se alimenta a una cámara de video infrarroja. Iluminación de infrarrojos de los peces se llevó a cabo desde abajo. La cámara de imágenes grabadas a una velocidad de 5 fotogramas / segundo (larvas) o 12,5 cuadros / segundo (adultos), respectivamente. Las imágenes se procesan automáticamente, corregida y suavizada por la forma del ojo. La orientación del ojo en relación con el eje horizontal se determina automáticamente la velocidad del ojo y se calculó por el paquete de software propietario. Pequeños movimientos de los peces se han corregido de forma automática por el software. Todos los registros y análisis se logró en tiempo real.
3. Post-procesamiento de datos experimentales
- Mediciones brutas de las velocidades de los ojos fueron filtradas para sacadas con el fin de extraer lenta velocidad de fase.
- Sacada con filtro de curvas de velocidad ojos se suavizaron por un promedio de ejecución con una ventana deslizante de 7 cuadros.
- La velocidad promedio de atención fue sobre los marcos de las condiciones de estímulos idénticos.
- Para larvas de peces, la velocidad del ojo fue un promedio de más de dos ojos.
4. Los resultados representativos:
Con el fin de evaluar las capacidades de la VisioTracker de peces en estado larvario y adulto, se realizaron experimentos con larvas de pez cebra a 5 dpf, y adultos de pez cebra.
Para larvas de pez cebra, el mutante parachoques fue elegido. En este objetivo mutante, las células epiteliales hyperproliferate, lo que reduce el tamaño del objetivo y localización ectópica de la lente. Estas alteraciones morfológicas se reflejan en una reducción significativa de la sensibilidad al contraste y la agudeza visual (Schonthaler et al., 2010). La Figura 1 muestra la diferencia en la sensibilidad al contraste de los mutantes de parachoques frente a los hermanos de tipo salvaje. Mutantes parachoques cada vez menos para ajustar la velocidad del ojo a medida que disminuye el estímulo de contraste. Por analogía, cuando la frecuencia del estímulo espacial es mayor, es decir, el ancho de banda de estímulo se reduce, los mutantes parachoques también demuestran la agudeza visual reducida (Fig. 2)
La dependencia de los adultos de pez cebra rendimiento visual de las condiciones ambientales fue investigado por someter a los peces a diferentes concentraciones de alcohol en el tanque de agua durante 30 minutos y, posteriormente, para medir la respuesta optocinético en condiciones diferentes estímulos. Adultos de pez cebra muestran una marcada reducción en la sensibilidad al contraste cuando se mantiene en la concentración de alcohol en aumento (Fig. 3). Un dependiente de la dosis similares de reducción de la velocidad total del ojo en un amplio rango de frecuencias espaciales se pudo observar que los peces fueron tratados con concentraciones de alcohol en aumento (Fig. 4). Tratamiento de alcohol, además, dependiendo de la dosis reduce el rendimiento oculomotor en tareas más exigentes como lo demuestra una velocidad mayor estímulo (Fig. 5).
Figura 1. La velocidad de pez cebra ojo de larvas depende de la diferencia de estímulo. 10 mutantes parachoques y 10 hermanos de tipo salvaje se analizaron en 5 fdd en diversas stimulus condiciones banda de contraste. El gráfico muestra la velocidad media del ojo ± 1 SEM.
Figura 2. La velocidad de pez cebra ojo de larvas depende de la frecuencia espacial. 10 mutantes parachoques y 10 hermanos de tipo salvaje fueron sometidos a diferentes anchos de banda de estímulo a las 5 fdd y analizados como se describe. El gráfico muestra la velocidad media del ojo ± 1 SEM.
Figura 3. Adultos alcohol muestran pez cebra dependiente de la concentración en la reducción de la sensibilidad al contraste. Adultos de pez cebra se han mantenido en diferentes concentraciones de alcohol como se indica durante 30 minutos y se analizaron en diferentes condiciones de contraste de estímulo de banda. El gráfico muestra el promedio temporal a nasal velocidad ojos ± 1 SEM de 9 de los peces por grupo (excepto el grupo de control: n = 11).
Figura 4. Adultos alcohol muestran pez cebra dependiente de la concentración de reducción en el movimiento del ojo en general en un amplio rango de ancho de banda de estímulo. Adultos de pez cebra se han mantenido en diferentes concentraciones de alcohol como se indica durante 30 minutos y analizada bajo diferentes condiciones de ancho de banda de estímulo. El gráfico muestra el promedio temporal a nasal velocidad ojos ± 1 SEM de 9 de los peces por grupo (excepto el grupo de control: n = 11).
Figura 5. Adultos alcohol muestran pez cebra dependiente de la concentración de reducción en el movimiento del ojo en general en un amplio rango de velocidades de estímulo. Adultos de pez cebra se han mantenido en diferentes concentraciones de alcohol como se indica durante 30 minutos y se analizaron en diferentes condiciones de estímulo de velocidad. El gráfico muestra el promedio temporal a nasal velocidad ojos ± 1 SEM de 9 de los peces por grupo (excepto el grupo de control: n = 11).
Discussion
La importancia de la okr para el estudio de la función visual ha sido reconocido en la comunidad científica desde hace mucho tiempo (Semana Santa y Nicola 1996, 1997), y los intentos de cuantificar realmente el paradigma de haber comenzado más de una década atrás. Semana Santa y Nicola (1996) desarrolló un sistema motorizado con tambores rotativos de rayas, donde se analizó la grabación de vídeo de movimiento de los ojos de forma manual. Este sistema sufrió de la falta de inmovilización de los embriones de pez, que requiere reposición manual frecuente, y puede detectar los movimientos de seguimiento de los ojos sólo con gran dificultad. Un paso adelante fue el uso de un tambor rayado video-proyectado para permitir una mayor presentación de estímulos variables generadas por ordenador (Roeser y Baier, 2003;. Rinner et al, 2005a).
La mayor parte manual, cuadro a cuadro el análisis de grabaciones en vídeo ha demostrado ser extremadamente difícil, y hasta cierto punto, obstaculizado por el sesgo del observador (Beck et al., 2004). El análisis automatizado en tiempo real, se sugirió que se permita el uso de mecanismos de retroalimentación del comportamiento de aprendizaje (al Mayor et al., 2004). El uso de la iluminación infrarroja y la frecuencia de los estímulos controlados de rotación ha sido promovida por Beck et al. (2004). Sin embargo, el sistema descrito no sólo se ha utilizado para las larvas, y el análisis se llevó a cabo fuera de línea. Además, el VisioTracker permite un control completo sobre los estímulos, incluyendo el cambio de los estímulos durante el experimento, lo que permite una mayor flexibilidad y la influencia espontánea en el transcurso del experimento. Además, la creación de estímulo digital utilizado por el VisioTracker superó los problemas mencionados anteriormente con la aceleración de la masa inerte de un tambor de estímulo a rayas (Beck et al., 2004).
Restricción de las larvas de metilcelulosa no interfiere significativamente con el movimiento del ojo y no tiene ningún efecto a largo plazo sobre el bienestar del pez cebra. Las larvas de peces se han mantenido con éxito incrustado en metilcelulosa durante varios días, hasta el suministro de oxígeno a través de la piel se vuelve insuficiente para la demanda que aumenta la edad (Qian et al., 2005).
El método de restricción de peces adultos es igual de fácil en el animal. La corta duración del experimento, junto con la opción de intercambiar rápidamente el animal de experimentación para uno diferente, se suma a los aspectos de bienestar de los animales positivos del sistema. Desde las branquias están continuamente bañadas por el agua, es conveniente pico el agua con cualquier producto químico de elección para estudiar su efecto sobre los movimientos de los ojos y el rendimiento visual. Del mismo modo un experimento de lavado se puede añadir sin la necesidad de manejar el animal entre los experimentos.
Ruido de los píxeles de la imagen de vídeo se ha minimizado por los algoritmos de suavizado del software VisioTracker de propiedad, lo que permite mediciones de alta precisión de la posición del ojo y la velocidad angular. Además, para facilitar el análisis estadístico, el software filtra los movimientos sacádicos que se producen a una velocidad fija y que no contribuyen a la declaración experimental. El promedio de curvas de velocidad de más de 7 fotogramas de vídeo facilitado su posterior análisis.
El VisioTracker abre una nueva dimensión para muchos campos de investigación variados. El sistema y sus predecesores ya han sido utilizados con éxito para cuantificar el rendimiento visual en larvas de pez cebra, utilizando parámetros como la agudeza visual, sensibilidad al contraste y la adaptación a la luz (Rinner et al., 2005a, Schonthaler et al., 2010), para el análisis funcional de conos siguientes manipulación de los miembros de la cascada de transducción visual (por ejemplo, Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011..), o el análisis de los defectos visuales en las larvas de pez cebra mutante (por ejemplo, Schonthaler et al, 2005, 2008,. Bahadori et al., 2006). La interdependencia de la maduración morfológica y funcional del sistema visual ha sido estudiado por las mediciones okr para mostrar que la agudeza visual es todo, pero no completamente limitado por espacio de fotorreceptores en la etapa larval (Haug et al., 2010).
El VisioTracker es adecuado para analizar la función visual en adultos de pez cebra y otras especies de peces de tamaño parecido (Mueller y Neuhauß (2010), este informe).
También es concebible utilizar el sistema en áreas de investigación tales como la toxicología o farmacología que las sustancias a investigar podrían añadirse al flujo de agua alrededor de las branquias de peces adultos. Además, la versatilidad de VisioTracker permite realizar análisis más a fondo, por ejemplo, de ontogenetics de la función visual, la función de circuitos neuronales y el desarrollo, o sensitivomotora de control (véase la revisión de Huang y Neuhauß, 2008).
Disclosures
Oliver DR Schnaedelbach y Holger D. Russig son empleados del TSE Systems GmbH que produce el sistema de seguimiento del rendimiento visual utilizados en este artículo. La producción de este artículo fue patrocinado por TSE Systems GmbH. Stephan CF Neuhuass es un empleado de la Universidad de Zurich, que recibe una remuneración por los sistemas de TSE para cada sistema vendido.
Acknowledgments
KPM fue apoyada por la UE del 7 º PM (RETICIRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
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