Summary
VisioTrackerは、眼球運動の記録に基づいて、幼虫や小さな成魚の視覚性能を定量的に分析するための自動化されたシステムです。それはそのような視覚系の発達と機能、薬理学、神経回路の研究や感覚統合などの分野で高スループットの研究を可能にし、視覚刺激のプロパティおよびリアルタイム分析を完全に制御しています。
Abstract
視覚系の発達と機能への調査では、操作する、引き出すのは簡単、堅牢でシンプルなビジュアル性能の定量化ビヘイビア·モデルを必要としている。適切なモデルは、視運動反応（OKR）、その高選択値に起因するすべての脊椎動物に存在する反射的な行動で発見されている。 OKRは急速リセットサッカーと交互に目の遅い刺激、次の動きを伴います。この現象の測定が容易に起因し、その早期かつ安定した発症までゼブラフィッシュ幼生、およびゼブラフィッシュ遺伝学についての十分な知識の恩恵を受け、（完全に96時間後に受精（HPF）の後に開発された）待遇モデルの数十年1のために行われるこの分野での生物。一方、成魚で同様のメカニズムの分析は特に薬理学的および毒物学的なアプリケーションでは、重要性を増しています。
ここでは、完全に自動化された、高throughpuをVisioTrackerを記述ビジュアルパフォーマンスの定量分析のためのtシステム。システムは、教授ステファンNeuhaussのグループで行われた研究に基づいており、東証システムによって再設計されました。それは、高解像度のズームレンズを搭載し、高品質のビデオカメラで監視小魚用の固定装置で構成されています。魚コンテナはコンピュータによって生成された刺激パターンを投影することができる上に、ドラムスクリーンに囲まれています。眼球運動を記録し、自動的にリアルタイムでVisioTrackerソフトウェアパッケージによって分析される。
データ分析は、このような低速および高速位相持続時間、運動サイクルの頻度、遅い相ゲイン、視力、コントラスト感度などのパラメータの即時認識を可能にします。
典型的な結果は、例えば、野生型の形態に明らかな変化を示していない視覚系突然変異体の迅速な同定、または薬理学的又は毒性と変異原性の定量的効果の決定を可能にする視覚システムのパフォーマンス上のエージェント。
Protocol
1。魚類の繁殖
胚は保持され、隆起した標準的な条件（ブランド2002年）の下や日後受精（DPF）の開発によると上演された。 5 DPFにおける大人と幼虫を測定に利用された。
2。実験手順
- 楽器の準備
幼虫：魚の幼虫を3％に埋め込まれて予め温めておいた（28℃）体の動きを防ぐために、メチルセルロース。胚は、突出した画面に直面して、VisioTrackerに背側を上にして置かれた。アダルト魚：魚は300mg / lで、MS-222、固定装置に嵌め込まれVisioTrackerに配置で簡単に麻酔した。測定が開始された前に、彼らは、1〜2分間放置した後に回復する。
- 刺激パターンの生成
魚の周りを回転し、垂直白と黒の正弦波格子から成る刺激パターンが作成されましたプロプライエタリなソフトウェアパッケージを使用して。彼らは、波形、コントラスト、輝度、角速度と空間周波数に応じたソフトウェアパッケージを介して変調された可能性があります。パターンはVisioTracker内に含まれているデジタル光プロジェクターを使ってスクリーンに投影された。魚の眼とスクリーンの間のおおよその距離がスクリーンで4.5 cm、および投写サイズは水平360度、垂直方向に55度であった。仔魚は、刺激の方向は、サッカードの頻度を減らすために0.33 Hzの周波数で変化した。成魚は一方向に刺激されたと一般的に鼻に時空目速度が（MuellerとNeuhauss、2010を参照）有意に低いとほぼ一定であるため、唯一の一時的なツー鼻方向に刺激眼は、と考えられていた。
- 眼球運動の記録
魚の頭の明視野像、赤外線ビデオカメラに供給した。魚の赤外線照明は、fを行った下のROM。カメラはそれぞれ、5フレーム/秒（幼虫）または12.5フレーム/秒（成人）の速度で画像を記録した。画像は自動的に処理され修正され、目の形のために平滑化される。横軸の関係で眼の向きが自動的に決定されたと目の速度はプロプライエタリなソフトウェア·パッケージによって算出した。魚の小さな動きは、ソフトウェアによって自動的に補正した。すべての記録および分析をリアルタイムで実現しました。
3。ポスト·実験データ処理
- 眼球速度の生の測定値が遅い位相速度を抽出するために、サッカーのために濾過した。
- 眼球運動フィルタリング眼のベロシティ·カーブは7フレームのスライディングウィンドウを使用して、実行中の平均によって平滑化された。
- 瞳の速度は同一のスティミュラス条件を持つフレームにわたって平均した。
- 仔魚は、眼球速度は両眼で平均化された。
4。代表の結果：
幼虫のゼブラフィッシュでは、 バンパー変異が選ばれました。この変異体では、水晶体上皮細胞が減少し、レンズの大きさとレンズの異所性の場所につながる、hyperproliferate。これらの形態学的変化は、コントラスト感度の大幅な削減と視力（Schonthaler ら 、2010）によって反射される。図1は、バンパー変異体対野生型の兄弟のコントラスト感度の違いを示していますバンパー変異体はますます刺激コントラストが減少するにつれて、目の速度を調整するために失敗する。類推すると、刺激の空間周波数が高くなると、刺激のストライプ幅が小さくなる、すなわち、 バンパー変異体は、同様に視力低下（図2）を証明する
成体ゼブラフィッシュ映像設備への依存性環境条件では、lのパフォーマンスは30分間、自分の水槽の水に含まれるアルコールの濃度を変化させることに魚を施し、その後、様々な刺激条件下での視運動応答を測定することによって調べた。成体ゼブラフィッシュは増加アルコール濃度（図3）で維持コントラスト感度の著しい減少を示しています。魚が増加してアルコール濃度（図4）で処理したときの空間周波数の広い範囲にわたって全体的な眼の速度の類似の用量依存的な減少が観察された。アルコール治療は、さらに用量依存的に増加した刺激速度（図5）に代表される、より厳しい作業で眼球運動パフォーマンスが低下します。
図1：ゼブラフィッシュ幼生アイ速度は刺激コントラストに依存しています。 10 バンパー変異体および10は、野生型の兄弟は、sを変化させながら5 DPFで分析した timulusストライプコントラスト条件。グラフは、平均的な眼の速度±1 SEMを示しています。
図2：ゼブラフィッシュ幼生アイ速度は空間周波数に依存します。 10 バンパー変異体および10は、野生型兄弟は5 DPFで異なる刺激ストライプ幅に供し、前述のように分析した。グラフは、平均的な眼の速度±1 SEMを示しています。
図3：コントラスト感度でアダルトゼブラショーアルコール濃度依存性の減少。成体ゼブラフィッシュを30分間示されており、様々な刺激ストライプコントラスト条件下で分析したアルコール濃度を変化させて維持した。グラフは、平均的な時間的·ツー·鼻眼速度±グループごとに9魚（：N = 11、対照群を除く）の1 SEMを示しています。
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図4刺激ストライプ幅の広い範囲にわたって全体的な眼球運動でアダルトゼブラショーアルコール濃度依存性の減少。成体ゼブラフィッシュを30分間示されており、様々な刺激ストライプ幅の条件下で分析したアルコール濃度を変化させて維持した。グラフは、平均的な時間的·ツー·鼻眼速度±グループごとに9魚（：N = 11、対照群を除く）の1 SEMを示しています。
図5刺激速度の広い範囲全体眼球運動におけるアダルトゼブラショーアルコール濃度依存的な減少。成体ゼブラフィッシュを30分間示されており、刺激速度条件を変えることで分析としてアルコール濃度を変化させて維持した。グラフは、平均的な時間的·ツー·鼻眼速度±対照群を除く各群9魚（1 SEMを示しています。n = 11）で。
Discussion
視覚機能の研究のためOKRの重要性は、長い時間（イースター＆ニコラ1996年、1997年）のために科学界で認識されており、本当にパラダイムを定量化する試みは、10年以上前によく始めている。イースターとニコラ（1996）は、眼球運動のビデオ録画を手動で分析した縞模様のドラムを回転させるモーターとシステムを開発しました。このシステムでは、再配置が頻繁マニュアルを必要と魚類胚の固定化の欠如に苦しんで、そして非常に困難で目の追跡動きを検出することができる。ステップが前方に複数の可変コンピュータ生成刺激提示（; Rinner ら 、2005A Roeser＆バイアー、2003）を考慮するために、ビデオ投影縞模様のドラムの使用でした。
ビデオテープに録画録音のほとんどはマニュアル、フレーム毎の分析は非常に面倒であることが証明されて、観察者バイアス（ベックらによって阻まある程度2004年）。リアルタイムで自動化された分析は、行動のフィードバック学習のメカニズム（主ら 、2004）の使用を許可することが示唆された。赤外線照明と周波数制御回転刺激の使用は、Beck らによって開拓されています（2004）。ただし、システムは唯一の幼虫のためにそこに使用されてきた説明、および分析はオフラインで行われた。さらに、VisioTrackerそれによって実験の過程で、より高い柔軟性と自発的な影響力をできるように、実験中に刺激を変更するなどの刺激を完全に制御することができます。また、VisioTrackerで使用されるデジタル刺激の作成 はストライプ刺激ドラム（ベックら 、2004）の慣性質量の加速で前に述べた問題点を克服した。
メチルセルロースによる幼虫の拘束が大幅に眼球の動きを妨げないとゼブラフィッシュ幸福上の任意の長期的な効果を持っていません。魚の幼虫は正常であった皮膚を介して酸素供給が加齢に伴って需要（Qian ら、2005）には不十分になるまで、数日間メチルセルロースに埋め込 ま維持した。
成魚の拘束方法は、動物にも同様に簡単です。急速に別の1のための試験動物を交換するためのオプションと組み合わせる実験期間が短いが、さらにシステムの正動物福祉の側面に追加されます。鰓が連続水によって洗い流されるので、それはスパイク眼球運動と視覚の性能への影響を研究するために選択した任意の化学物質と水に便利です。同様に、ウォッシュアウトの実験は、実験動物の間を処理しなくても追加することができます。
ビデオ画像内のピクセルノイズが目の位置と角速度の高精度の測定を可能にする、独自のVisioTrackerソフトウェアのアルゴリズムを平滑化することにより、最小限に抑えられました。さらに、統計的容易にする解析、ソフトウェアは一定の速度で発生し、実験的な文に寄与しないサッカード運動を除外。 7ビデオフレーム上の速度曲線の平均化は、後の分析を容易にした。
VisioTrackerは、多くの様々な研究分野に新たな次元を開きます。システムとその前任者はすでにそのような視力、コントラスト感度および明順応（Rinner ら 、2005A、Schonthaler ら 、2010）などのパラメータを用いて、ゼブラフィッシュ幼生における視覚性能を定量化するために成功裏に使用されている、の機能解析変異体ゼブラフィッシュ幼生におけるコーン視覚伝達カスケードのメンバーの操作後に感光体（例えばRinner ら 、2005B、Renninger ら、2011）、または視覚欠陥の分析（例えばSchonthaler ら、2005、2008;。Bahadoriら、2006）。視覚系の形態学的および機能的成熟の相互依存その視力が主ですが、完全には幼虫の段階で感光体の間隔（ハウグら 、2010）によって限定されるものではない表示するOKR測定によって研究されてきた。
VisioTrackerは大人のゼブラフィッシュと他の同様の大きさの魚種（ミューラーとNeuhauss（2010）、本報告書）における視覚機能を分析することも同様に適しています。
それは調査されるべき物質が成魚のエラを周囲の水の流れに加えられるかもしれないそれによって毒性や薬理学などの研究分野でシステムを利用することも考えられる。さらに、VisioTrackerの汎用性は、視覚機能、神経回路機能の開発、または感覚運動制御（黄＆Neuhauss、2008年のレビューを参照）のontogeneticsの例については、より徹底した分析を可能にします。
Disclosures
オリバーのDR SchnaedelbachとHolger D. Russigは、この記事で使用したビジュアル性能トラッキングシステムを生成東証システムズ社の従業員である。この記事の産生は、東証システムズ社が主催した。ステファンCF Neuhuassは、販売システムごとに東証システムによって報酬を受け取るにはチューリッヒ大学の従業員です。
Acknowledgments
KPMはEU FP7（RETICIRC）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
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